Worldwide research devotes significant effort to identify new, targetable molecular mechanisms
in the field of angiogenesis, since therapeutic modulation of angiogenesis can critically alter the
progression of a number of diseases. Stimulation of angiogenesis is desirable in situations
characterized by tissue-damaging ischemia where blood supply is severely reduced, such as
lower limb diabetic arteriopathy or following myocardial infarct. In contradistinction, stemming
excessive or ectopic angiogenesis can be beneficial in situations such as solid tumor growth or
in neovascular age-related macular degeneration.
It has been previously shown that Hydrogen Sulfide (H2S), a new vasoactive gasotransmitter,
can initiate angiogenic responses which depend on the activation of ATP-sensitive potassium
channels (KATP). Intriguingly, C-type Natriuretic Peptide (CNP), which is also known to activate
KATP, has been reported to promote endothelial cell growth; however, its angiogenic properties
have not been explored at any depth. This pattern prompted us to investigate whether direct
KATP activation induces angiogenic responses and whether endothelial responses to CNP or
Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) indeed require KATP activation.
We undertook a dual-pronged approach, based on both in vivo and in vitro experimental
approaches. In vivo, chick embryo chorioallantoic membrane (CAM) angiogenesis was similarly
enhanced by the direct KATP channel activator SG-209 and by the polypeptides CNP or VEGF.
Two KATP inhibitors, Glibenclamide and 5-Hydroxydecanoate (5-HD), abrogated both basal and
CNP-induced CAM angiogenesis. In vitro, direct activators of KATP such as Nicorandil and SG-
209 and receptor-acting agonists such as VEGF and CNP, increased proliferation and migration
in the mouse brain endothelial cell line bEnd.3. In addition, VEGF and CNP induced
comparable capillary tube-like formation by Human Umbilical Vein Endothelial cells (HUVECs)
in low growth factor Matrigel. All these in vitro pro-angiogenic endothelial responses were
effectively abrogated by Glibenclamide or by 5-HD. Transfection of HUVECs with a siRNA
specifically targeting the inwardly rectifying potassium channel (Kir) 6.1 subunit decreased the
expression of this subunit at both the mRNA and the protein level. The resulting knock-down of
the Kir6.1 KATP subunit impaired HUVEC migration through transwells in vitro and substantially
decreased tubular network formation in Matrigel in response to either the direct KATP activator
SG-209 or the receptor-operating KATP activator CNP. Furthermore, the bEnd.3 endothelial cell
proliferation and migration responses to SG-209 required mobilization of the “classic”
endothelial pro-angiogenesis kinases Erk1/2, p38 and Akt, since the responses to SG-209 were
all abolished by each of the respective kinase inhibitors.
This work allows us to firmly conclude that:
a) direct pharmacological modulation of KATP channels affects angiogenic responses in vitro and
in vivo, b) CNP is a bona fide angiogenic factor, as potent and efficient to mobilize endothelial
cells as VEGF, c) the angiogenic effects of CNP and VEGF depend on the activation of
endothelial KATP channels and specifically require the expression of the Kir6.1 pore-forming KATP
subunit, and finally d) KATP activation may be a common molecular mechanism that underpins
angiogenesis to a wide variety of endogenous vasoactive stimuli that includes H2S, VEGF and
CNP.
The therapeutic implications of this work are significant: Sulfonylurea-type KATP channel
inhibitors, with questionable selectivity for pancreatic β-cells, are widely used drugs to treat type
II diabetes, a disease characterized by arterial dysfunction and higher incidence of myocardial
and lower limb ischemia. The outcome of cardiac ischemia in diabetic patients is worse if they
have been treated with sulfonylureas, indicating some, until now unresolved, deleterious
cardiovascular activity of this class of compounds. The present demonstration that endothelial
KATP channel activation is a common pro-angiogenic mechanism, may in part explain this
unfavorable outcome of sulfonylurea treatment in diabetics. Furthermore, it raises the need to
design new molecules which, while inhibiting the pancreatic KATP channels, should spare the
endothelial KATP channels and the ensuing angiogenesis, thus exhibiting increased therapeutic
benefit. / Σε πολλά εργαστήρια, σε παγκόσμιο επίπεδο, συντελείται σημαντική ερευνητική προσπάθεια
για την ταυτοποίηση νέων μοριακών μηχανισμών στο πεδίο της αγγειογένεσης ως στόχων
ανάπτυξης φαρμάκων, καθώς η θεραπευτική ρύθμιση της αγγειογένεσης μπορεί να επηρεάσει
σημαντικά την εξέλιξη πολλών ασθενειών. Η διέγερση της αγγειογένεσης είναι επιθυμητή σε
καταστάσεις ισχαιμίας όπου η παροχή αίματος μειώνεται σοβαρά, με αποτέλεσμα
δυσλειτουργία ή νέκρωση ιστών, όπως πχ συμβαίνει κατά την εμφάνιση αρτηριοπάθειας στο
διαβητικό κάτω άκρο ή μετά από έμφραγμα του μυοκαρδίου. Σε αντιδιαστολή, η αναστολή
υπερβολικής ή έκτοπης αγγειογένεσης μπορεί να είναι επωφελής σε καταστάσεις όπως κατά
την ανάπτυξη συμπαγούς όγκου ή σε νεοαγγειακή εκφύλιση της ωχράς κηλίδας σχετιζόμενη με
την ηλικία.
Έχει δειχθεί ότι το Υδρόθειο (H2S), ένας νέος αγγειοδραστικός αέριος διαβιβαστής
(gasotransmitter), μπορεί να εκκινήσει αγγειογόνες αποκρίσεις που εξαρτώνται από την
ενεργοποίηση των ευαίσθητων στο ΑΤΡ διαύλων καλίου (ΚΑTP). Μας κίνησε επίσης το
ενδιαφέρον η αναφορά οτι το C-νατριουρητικό πεπτίδιο (CNP), που είναι γνωστό ότι ενεργοποιεί
τους ίδιους διαύλους καλίου, δύναται να προάγει τον πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών
κυττάρων. Ωστόσο, οι αγγειογενετικές ιδιότητες του CNP δεν έχουν διερευνηθεί σε βάθος. Αυτή
η σύγκλιση μας ώθησε στη διερεύνηση του κατά πόσον η άμεση ενεργοποίηση των ΚΑTP
διαύλων καλίου προκαλεί αγγειογενετική απόκριση και επίσης εάν η απόκριση των
ενδοθηλιακών κυττάρων στο CNP ή στον αγγειακό ενδοθηλιακό αυξητικό παράγοντα (VEGF)
απαιτούν πράγματι ενεργοποίηση των διαύλων ΚΑTP.
Η πειραματική προσέγγιση σχεδιάστηκε με βάση τόσο in vivo, όσο και in vitro μεθόδους. In vivo,
η φυσιολογικά συντελλούμενη αγγειογένεση στην χοριοαλλαντοϊκή μεμβράνη εμβρύου όρνιθας
(CAM) ενισχύθηκε απο τον άμεσο ενεργοποιητή των διαύλων ΚΑTP, το μόριο SG-209, καθώς και
απο τα πολυπεπτίδια CNP και VEGF. Δύο αναστολείς των διαύλων ΚΑTP, η γλιβενκλαμίδη
(glibenclamide) και το 5-υδροξυδεκανοϊκό οξύ (5-HD), ανέστειλαν τόσο την αγγειογένεση
υποβάθρου (basal) της χοριοαλλαντοϊκής μεμβράνης, όσο και την επαγόμενη απο το CNP
αγγειογένεση το σύστημα αυτό. In vitro, άμεσοι ενεργοποιητές των διαύλων ΚΑTP όπως η
νικορανδίλη (nicorandil) και το SG-209, καθώς και έμμεσοι ενεργοποιητές, μέσω αρχικής
αγωνιστικής δράσης τους σε ειδικούς υποδοχείς, όπως ο VEGF και το CNP, αύξησαν τον
πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση εγκεφαλικών ενδοθηλιακών κυττάρων ποντικού της
κυτταρικής σειράς bEnd.3. Επιπλέον, ο VEGF και το CNP επάγουν με παρόμοιο τρόπο το
σχηματισμό τριχοειδών αγγείων απο ενδοθηλιακά κύτταρα απομονωμένα απο φλέβα
ανθρώπινου ομφάλιου λώρου (HUVEC) που δημιουργούνται σε Matrigel με χαμηλή
περιεκτικότητα σε αυξητικούς παράγοντες. Όλες αυτές οι in vitro θετικές αγγειογενετικές
ενδοθηλιακές αποκρίσεις αναστέλλονται παρουσία της γλιβενκλαμίδης και του 5-HD.
Διαμόλυνση κυττάρων HUVECs με siRNA που στοχεύει ειδικά την υπομονάδα του δίαυλου
καλίου Kir 6.1 μείωσε αποτελεσματικά την έκφραση αυτής της υπομονάδας τόσο σε επίπεδο
mRNA όσο και σε πρωτεϊνικό επίπεδο. Η μείωση στην έκφραση της υπομονάδας Kir6.1 των
διαύλων καλίου προκάλεσε καταστολή της μετανάστευσης των κυττάρων HUVECs σε θαλάμους
τύπου φρέατος (transwells) καθώς και σημαντική απομείωση στο σχηματισμό δικτύου
τριχοειδών αγγείων σε Matrigel, όταν αυτές οι αποκρίσεις επάγονται είτε απο τον άμεσο
ενεργοποιητή των διαύλων ΚΑTP, το μόριο SG-209, είτε απο τον έμμεσο ενεργοποιητή των
διαύλων ΚΑTP (μέσω δράσης σε ειδικούς υποδοχείες), το πεπτίδιο CNP.
Επιπλέον, ο πολλαπλασιασμός και η μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων bEnd.3 που
διεγείρονται ως απόκριση στο μόριο SG-209 απαιτούν κινητοποίηση των "κλασσικών"
ενδοθηλιακών προ-αγγειογενετικών κινασών Erk1 / 2, p38 και Akt, δεδομένου ότι οι αποκρίσεις
αυτές στον SG-209 καταστάλθηκαν απο κάθε ένα από τους αντίστοιχους αναστολείς των
κινασών.
Η παρούσα μελέτη μας επιτρέπει να συμπεράνουμε ότι:
α) άμεση φαρμακολογική τροποποίηση της λειτουργίας των διαύλων ΚATP επηρεάζει σημαντικά
τις αγγειογόνες αποκρίσεις τόσο in vitro όσο και in νίνο, β) το CNP είναι όντως ένας
αγγειογενετικός παράγοντας, τόσο ισχυρός και αποτελεσματικός για την κινητοποίηση
ενδοθηλιακών κυττάρων όσο και ο VEGF, γ) οι αγγειογόνες επιδράσεις του CNP και του VEGF
εξαρτώνται από την ενεργοποίηση των ενδοθηλιακών διαύλων ΚΑTP και συγκεκριμένα απαιτούν
την έκφραση της υπομονάδας Kir6.1 του διαύλου ΚΑTP, και τέλος δ) η ενεργοποίηση των
διαύλων ΚΑTP φαίνεται οτι είναι ένας κοινός μοριακός μηχανισμός που υποστηρίζει την
αγγειογένεση που διεγείρεται απο ένα ευρύ φάσμα ενδογενών αγγειοδραστικών χυμικών
ερεθισμάτων, που περιλαμβάνουν το H2S, τον VEGF και το CNP.
Οι επιπτώσεις της μελέτης αυτής στην θεραπευτική πράξη είναι πιθανώς σημαντικές: Οι τύπου
σουλφονυλουρίας αναστολείς διαύλων των διαύλων ΚΑTP, που στοχεύουν μη-επαρκώς
επιλεκτικά σε β-παγκρεατικά κύτταρα, χρησιμοποιούνται ευρέως ως φάρμακα για τη θεραπεία
του διαβήτη τύπου II, μια ασθένεια που χαρακτηρίζεται από γενικευμένη δυσλειτουργία του
αρτηριακού συστήματος, με συνέπεια υψηλή επίπτωση εμφράγματος του μυοκαρδίου και
ισχαιμίας των κάτω άκρων. Η εξέλιξη ενός επεισοδίου μυοκαρδιακής ισχαιμίας σε διαβητικούς
ασθενείς είναι χειρότερη εάν αυτοί ακολουθούσαν φαρμακολογική θεραπεία με
σουλφονυλουρίες, υποδεικνύοντας κάποια, μέχρι τώρα σε σημαντικό βαθμό ανεξήγητη,
επιβλαβή καρδιαγγειακή επίδραση αυτής της κατηγορίας ενώσεων. Η παρούσα μελέτη
αποδεικνύει ότι η ενεργοποίηση ενδοθηλιακών διαύλων ΚΑTP είναι ένας κοινός προ-
αγγειογενετικός μηχανισμός, που μπορεί εν μέρει να εξηγήσει αυτή την αρνητική έκβαση της
πρότερης θεραπείας με σουλφονυλουρίες σε διαβητικούς. Επιπλέον, η έρευνα αυτή υποστηρίζει
την ανάγκη για το σχεδιασμό νέων μορίων, τα οποία, ενώ θα αναστέλλουν τους διαύλους ΚΑTP
στο πάγκρεας, δεν θα επηρεάζουν τους ενδοθηλιακούς διαύλους ΚΑTP και την εξαρτώμενη απο
αυτούς αγγειογένεση, και έτσι θα παρουσιάζουν, βάσει των ανωτέρω, βελτιωμένη θεραπευτική
δράση.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upatras.gr/oai:nemertes:10889/8703 |
| Date | January 2015 |
| Creators | Bukar, Umaru |
| Contributors | Τοπούζης, Σταύρος, Παπαπετρόπουλος, Ανδρέας, Τοπούζης, Σταύρος, Πουλάς, Κωνσταντίνος, Παπαδημητρίου, Ευαγγελία, Σπυρούλιας, Γεώργιος, Λάμαρη, Φωτεινή, Φλυτζάνης, Κωνσταντίνος |
| Source Sets | University of Patras |
| Language | English |
| Detected Language | Greek |
| Type | Thesis |
| Rights | 0 |
| Relation | Η ΒΚΠ διαθέτει αντίτυπο της διατριβής σε έντυπη μορφή στο βιβλιοστάσιο διδακτορικών διατριβών που βρίσκεται στο ισόγειο του κτιρίου της. |
Page generated in 0.0038 seconds