Los terpenos constituyen el mayor grupo de metabolitos secundarios, siendo
componentes de las glándulas de aceites esenciales, de las flores y de las resinas defensivas
de plantas aromáticas, a los que proporcionan sus aromas y sabores característicos. Los
terpenos volátiles se asocian a la defensa de muchas especies de plantas, animales y
microorganismos contra depredadores, patógenos y competidores. Por otra parte, estos
compuestos parecen servir como señales para atraer a los polinizadores y agentes dispersores
de semillas, así como a depredadores de plagas. El estudio de compuestos orgánicos volátiles
emitidos durante el desarrollo del fruto y después del desafío con diferentes agentes bióticos
puede ayudar a conocer las interacciones de los frutos carnosos no sólo con vertebrados
dispersores y depredadores, sino también con insectos y microorganismos.
Los frutos carnosos son particularmente ricos en volátiles. En los frutos cítricos, los
monoterpenos son los principales componentes de las glándulas del aceite esencial de la
cáscara (flavedo), siendo el D-limoneno el más abundante (hasta 95% en la naranja). Esta
característica hace que los cítricos sean un buen sistema modelo para el estudio de la función
de los terpenos en los frutos. La biología molecular moderna permite la realización de
experimentos para comprobar la función de terpenos por medio del uso de organismos
transformados genéticamente en los que se han manipulado los niveles de acumulación de
dichos compuestos. En este trabajo, se ha utilizado un plásmido que alberga el cDNA completo
del gen de una limoneno sintasa de cítricos (CiTMTSE1) en orientación antisentido (AS) o
sentido (S) para modificar la expresión y la acumulación de D-limoneno en plantas de naranjo
dulce (Citrus sinensis L. Osb.). La acumulación de D-limoneno en las frutas AS se redujo
drásticamente pero la acumulación de otros terpenos también se modificó, afectando a
compuestos tales como alcoholes monoterpenos, cuya concentración se incrementó en la
cáscara de las frutas. Las plantas transformadas fueron morfológicamente indistinguibles de las
plantas control (WT) y de las plantas transformadas con el vector vacío (EV).
Los frutos transgénicos fueron desafiados con un insecto plaga y con diferentes
patógenos para probar si la alteración de los niveles de acumulación de estos volátiles daba
como resultado una mejora en la respuesta del flavedo frente a plagas y patógenos. Los
machos de la mosca mediterránea de la fruta (Ceratitis capitata) expuestos a las frutas AS y EV
en ensayos en túnel de viento fueron significativamente más atraídos por el aroma de los frutos
control EV. En otros experimentos de desafío con el hongo de la podredumbre verde
Penicillium digitatum y la bacteria causante de la cancrosis de los cítricos Xanthomonas
axonopodis subsp. citri, las frutas transgénicas con un contenido reducido de D-limoneno
mostraron elevada resistencia a estos patógenos. El alto contenido en D-limoneno en la
cáscara de naranjas maduras puede ser una señal para la atracción de plagas y
microorganismos que podrían estar involucrados en la facilitación del acceso a la pulpa de los
frugívoros dispersores de semillas.
El análisis de la expresión génica global en el flavedo de las frutas transgénicas vinculó
la disminución de D-limoneno y la reducción de la expresión de genes del metabolismo de
monoterpenos con la activación de la expresión de genes implicados en inmunidad innata,
incluyendo factores de transcripción, genes de quinasas implicadas en la entrada de Ca2+ en la
célula y genes implicados en la activación de las cascadas de MAPKs, con la consiguiente
activación de la ruta de señalización de ácido jasmónico (JA), lo que provocó la activación del
metabolismo de JA y un aumentó drástico de la acumulación de JA en la cáscara de la naranja
tras el desafío con P. digitatum, lo que explicaría la resistencia al menos a hongos necrotrofos
observada en las frutas.
Estos resultados indican que la acumulación de D-limoneno en la cáscara de la naranja
estaría implicada en la interacción trófica entre las frutas, insectos y microorganismos, lo cual
proporciona una visión mucho más amplia de las funciones de los terpenos en la naturaleza.
También representa una alternativa muy prometedora para incrementar la resistencia o
tolerancia de las plantas frente a patógenos y plagas. / Terpenes, the largest group of secondary metabolites, are well known as constituents of essential oils, floral scents and defensive resins of aromatic plants, to which they impart their characteristic aromas and flavors. Terpene volatiles defend many species of plants, animals and microorganisms against predators, pathogens and competitors. Moreover, those compounds seem to serve as advertisements to attract pollinators and seed-dispersal agents as well as pest predators. The study of VOCs emitted during fruit development and after challenge with different biotic agents may help to determine the interactions of fleshy fruits not only with legitimate vertebrate dispersers and predators, but also with insects and microorganisms.
Fleshy fruits are particularly rich in volatiles. In citrus fruits, monoterpenes are the main components of the essential oil glands of the peel, being D-limonene the most abundant one (up to 95% in orange fruits). This characteristic makes citrus a good model system for studying the function of terpenes in plants. Modern molecular biology now enable experiments to test terpenoid function by the use of genetically transformed organisms in which terpene levels have been manipulated. In this work, a plasmid harboring the complete cDNA of a citrus limonene synthase gene (CiTMTSE1) in antisense (AS) or sense (S) orientation was used to modify the expression and accumulation of D-limonene of sweet orange (Citrus sinensis L. Osb) plants. D-limonene accumulation in AS fruits was dramatically reduced but the accumulation of other terpenoids was also modified, such as monoterpene alcohols, whose concentration increased in the peel of fruits. Genetically transformed plants were morphologically indistinguishable from wild-type (WT) and empty vector (EV) control plants.
Transgenic fruits were challenged against a pest and different pathogens to test whether volatile profile alteration results in an improvement in the response of the fruit flavedo against them. Males of the Mediterranean fruit fly (Ceratitis capitata) exposed to AS fruits versus EV in wind tunnel assays were significantly more attracted to the odor of EV control fruits. In separate experiments with the green mould rot of citrus fruits and citrus canker caused by Penicillium digitatum and Xanthomonas axonopodis subsp. citri, respectively, transgenic fruits with a reduced content in D-limonene showed resistance to both pathogens. High D-limonene content in mature orange peels may be a signal for attractiveness of pests and microorganisms which might be likely involved in facilitating the access to the pulp of seed dispersal frugivores.
A global gene expression analysis of the flavedo of AS transgenic fruits linked the decrease of D-limonene and monoterpene metabolism to the up-regulation of genes involved in the innate immunity response, including transcription factors together with Ca2+ entry into the cell and activation of MAPK cascades, contributing to activation of jasmonic acid (JA) signaling, which triggered the up-regulation of JA metabolism and drastically increased the accumulation of JA in orange peels upon fungal challenge, explaining the resistance to necrotrophic fungi observed in AS fruits.
These results indicate that limonene accumulation in the peel of citrus fruit appears to be involved in the successful trophic interaction between fruits, insects, and microorganisms and provide a much more comprehensive view of roles of terpenes in nature. It also represents a very promising alternative for increasing resistance or tolerance of plants to pathogens. / Rodríguez Baixauli, AM. (2013). Genetic engineering of plant volatiles in fleshy fruits: pest repellency and disease resistance through D-limonene downregulation in transgenic orange plants [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/31655 / TESIS
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upv.es/oai:riunet.upv.es:10251/31655 |
| Date | 02 September 2013 |
| Creators | Rodríguez Baixauli, Ana María |
| Contributors | PEÑA GARCIA, LEANDRO, Universitat Politècnica de València. Departamento de Biotecnología - Departament de Biotecnologia |
| Publisher | Universitat Politècnica de València |
| Source Sets | Universitat Politècnica de València |
| Language | English |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/acceptedVersion |
| Source | Riunet |
| Rights | http://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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