[EN] The Saccharomyces cerevisiae protein kinases Sat4 (Hal4) and Hal5 are required for the plasma membrane stability of the high affinity K+ transporter Trk1 and some amino acid and glucose permeases. A transcriptomic analysis of the hal4 hal5 strain revealed that the absence of these genes causes general alterations in the metabolism of amino acids and glucose. This data is confirmed by the following approaches: activity of the Gcn2-Gcn4 pathway, uptake of methionine and leucine, activity of succinate dehydrogenase (SDH), glucose consumption and ethanol production of this mutant.
In this thesis, we demonstrated that the high affinity permease Mup1 is internalized and degraded in the vacuole in the absence of potassium supplementation, like other plasma membrane permeases such as Hxt1 (glucose), Can1 (arginine), Fur4 (uracil) and Gap1 (amino acids). This destabilization of the Mup1 permease is likely to explain the reduction in the uptake of methionine in the double mutant hal4 hal5 and suggests that Hal4 and Hal5 are involved in a general mechanism of regulation of the stability of permeases in the plasma membrane. This hypothesis was corroborated by studies with inhibitors of endocytosis and mutant isoforms of the E3 ubiquitin ligase Rsp5, which is responsible for the ubiquitination and subsequent vacuolar degradation of the permeases studied.
The process of Rsp5-mediated ubiquitination requires, in many cases, specific adapters for recognition of the target protein. So far, 19 Rsp5 adapter proteins have been described, among which there are 9 ARTs proteins (Arrestin-Related Trafficking adaptor). In this study, we investigated whether there is a functional connection between Hal4 and Hal5 kinases and ARTs, since this mechanism could explain the observed phenotypes. We studied whether Art1, a regulator of Mup1 and Can1 endocytosis, is involved in the internalization of these permeases in hal4 hal5 strains. Our data indicates that Art1 is not necessary for internalizing Mup1 in the hal4 hal5 strain in the absence of potassium supplementation, therefore suggesting a new role for the Hal4 and Hal5 kinases. We extended the study to include the transporter of aspartic and glutamic acid, Dip5, whose endocytosis is mainly mediated by Aly2 (Art3). The results were positive, providing support for a more general mechanism of regulation of the permeases of the plasma membrane by these kinases.
It has been proposed that Npr1, a kinase that is an effector of the Target of Rapamycin Complex 1 (TORC1), controls the activity of Art1, Aly1 (Art6) and Aly2 (Art3), leading to the accumulation of some permeases in the plasma membrane. We observe lower expression levels of Npr1 in hal4 hal5 strains. We also observe a state of constitutive hyperphosphorylation, similar to WT cells under limiting potassium. Furthermore, overexpression of the Npr1 kinase partially rescues the growth defects and instability of the permeases in the plasma membrane described in the hal4 hal5 mutant. Therefore, we identify part of the pathway regulated by the Hal4 and Hal5 kinases.
In eukaryotes, TOR (Target of Rapamycin) exists in two distinct multiprotein complexes, TOR complex 1 (TORC1) and TOR complex 2 (TORC2). We have analyzed the direct substrates of TORC1 (Sch9) and TORC2 (Ypk1) in hal4 hal5 and trk1 trk2 mutants in potassium limiting conditions, observing alterations in the phosphorylation levels of both effectors. Finally, we observed that hal4 hal5 and trk1 trk2 mutants are highly sensitive to the TORC1 inhibitor, rapamycin, and that this sensitivity is rescued by increased external potassium. We confirmed that cells treated with rapamycin had lower internal potassium levels, an effect which is dependent on TORC1 and independent of Trk1 and Trk2. Therefore, our data indicates that the Hal4 and Hal5 kinases have a more specific effect on Npr1 and that there is a reciprocal regulation between potassium and the TOR signaling pathway. / [ES] Las proteínas quinasa de Saccharomyces cerevisiae Sat4 (Hal4) y Hal5 son necesarias para la estabilidad del transportador de K+ de alta afinidad Trk1 y de algunas permeasas de aminoácidos y de glucosa. El análisis transcriptómico del mutante hal4 hal5 reveló que la ausencia de estos genes origina alteraciones generales en el metabolismo de aminoácidos y de glucosa, datos que confirmamos mediante la medida de la ruta Gcn2-Gcn4, de la toma de metionina y de leucina, de la actividad de la succinato deshidrogenasa (SDH), del consumo de glucosa y de la producción de etanol.
En esta tesis, hemos demostrado que la permeasa de alta afinidad de metionina, Mup1 se degrada en la vacuola en ausencia de un suplemento de potasio en el mutante hal4 hal5, igual que otras permeasas de la membrana plasmática como Hxt1, Can1, Fur4 y Gap1. Esta desestabilización de Mup1 podría explicar el defecto en la toma de metionina observado y sugiere que Hal4 y Hal5 están implicadas en un mecanismo general de regulación de la estabilidad de las permeasas en la membrana plasmática. Esta hipótesis fue corroborada mediante estudios con inhibidores de la endocitosis y mutantes en la E3 ubiquitina ligasa Rsp5, responsable de la ubiquitinación y posterior degradación vacuolar de las permeasas estudiadas.
El proceso de ubiquitinación, en muchos casos, precisa de adaptadores específicos para reconocer la proteína diana. Se han descrito 19 proteínas adaptadoras de Rsp5, entre las que se encuentran 9 proteínas ARTs (Adaptadores de tráfico relacionados con arrestina). En este trabajo, hemos investigado si existe una conexión funcional entre las quinasas Hal4 y Hal5 y los ARTs; este mecanismo podría explicar los fenotipos observados. Estudiamos si Art1, regulador de la endocitosis de Mup1 y Can1, está implicado en la internalización de estas permeases en la cepa hal4 hal5. Nuestros datos indican que Art1 no es necesario para la internalización de Mup1 y Can1 en una cepa hal4 hal5 en ausencia de un suplemento de potasio, sugiriendo un papel novedoso de las quinasas Hal4 y Hal5. Ampliamos el estudio al transportador de ácido aspártico y glutámico, Dip5, cuya endocitosis viene mediada principalmente por Aly2 (Art3). Los resultados fueron positivos apoyando un mecanismo más general de regulación de las permeasas de la membrana plasmática por parte de estas quinasas.
Se ha propuesto que Npr1, una quinasa efectora del Target of Rapamycin Complex 1 (TORC1), controla la actividad de Art1, Aly1 (Art6) y Aly2 (Art3) generando la acumulación de algunas permeasas en la membrana plasmática. Observamos menores niveles de expresión de Npr1 en mutantes hal4 hal5, además de un estado de hiperfosforilación constitutivo similar al de células WT en condiciones de potasio limitante. Además, la sobreexpresión de NPR1 rescata los defectos de crecimiento observados en medios con baja disponibilidad de potasio e inestabilidad de permeasas de la membrana plasmática descritos en el mutante hal4 hal5. Por tanto, identificamos parte de la ruta regulada por las quinasas Hal4 y Hal5.
En los organismos eucariotas TOR (Target of Rapamycin) existe en dos complejos multiproteicos distintos, complejo TOR1 (TORC1) y complejo TOR2 (TORC2). Hemos analizado los sustratos directos de TORC1 (Sch9) y TORC2 (Ypk1) en mutantes hal4 hal5 y trk1 trk2 y en condiciones de potasio limitante observando alteraciones en los niveles de fosforilación de ambos efectores. Finalmente, hemos observado que los mutantes hal4 hal5 y trk1 trk2 son altamente sensibles al inhibidor de TORC1, rapamicina y que esta sensibilidad se rescata con un exceso de potasio en el medio. Comprobamos que células tratadas con rapamicina presentan una disminución del potasio interno dependiente de TORC1 e independiente de Trk1 y Trk2. Por tanto, nuestros datos indican que las quinasas Hal4 y Hal5 tienen un efecto más específico sobre Npr1 y que hay una regulación reciproca entre el potasio y la r / [CAT] Les proteïnes quinasa de Saccharomyces cerevisiae Sat4 (Hal4) i Hal5 són necessàries per a l'estabilitat del transportador de K+ d'alta afinitat Trk1 i d'algunes permeases d'aminoàcids i de glucosa. L'anàlisi transcriptòmic d'una soca mutant hal4 hal5 revela que l'absència d'aquests gens origina alteracions generals en el metabolisme d'aminoàcids i de glucosa, dades que confirmem mitjançant la mesura de la ruta Gcn2-Gcn4, de la presa de metionina i leucina, de l'activitat de succinat deshidrogenasa (SDH), del consum de glucosa i de la producció d'etanol d'aquest mutant.
En aquesta tesi, hem demostrat que la permeasa d'alta afinitat de metionina, Mup1 es degrada en el vacúol en absència d'un suplement de potassi en el mutant hal4 hal5, igual que altres permeases de la membrana plasmàtica com Hxt1, Can1, Fur4 i Gap1. Aquesta desestabilització de Mup1 podria explicar el defecte en la presa de metionina observat i suggereix que Hal4 i Hal5 estan implicades en un mecanisme general de regulació de l'estabilitat de les permeases a la membrana plasmàtica. Aquesta hipòtesi va ser corroborada mitjançant estudis amb inhibidors de l'endocitosi i mutants en l'E3 ubiquitina ligasa Rsp5, responsable de la ubiquitinació i posterior degradació vacuolar de les permeases estudiades.
El procés d'ubiquitinació, en molts casos, precisa d'adaptadors específics per reconèixer la proteïna diana. Fins al moment s'han descrit 19 proteïnes adaptadores de Rsp5, entre les quals es troben 9 proteïnes ART (Adaptadors de trànsit relacionats amb arrestina). En aquest treball hem investigat si existeix una connexió funcional entre les quinases Hal4 i Hal5 i els ARTs; aquest mecanisme podria explicar els fenotips observats. Estudiem si Art1, regulador de l'endocitosi de Mup1 i Can1, està implicat en la internalització d'aquestes permeases a la soca hal4 hal5. Les nostres dades indiquen que Art1 no és necessari per a la internalització de Mup1 i Can1 en una soca hal4 hal5 en absència d'un suplement de potassi, suggerint un paper nou de les quinases Hal4 i Hal5. Ampliem l'estudi per incloure el transportador d'àcid aspàrtic i glutàmic, Dip5, en l'endocitosi del qual intervé principalment Aly2 (Art3). Els resultats van ser positius recolzant un mecanisme més general de regulació de les permeases de la membrana plasmàtica per part d'aquestes quinases.
S'ha proposat que Npr1, una quinasa que és un efector del Target of rapamycin Complex 1 (TORC1), controla l'activitat de Art1, Aly1 (Art6) i Aly2 (Art3) i genera l'acumulació d'algunes permeases a la membrana plasmàtica. Observem nivells menors d'expressió de Npr1 en mutants hal4 hal5, a més d'un estat d'hiperfosforilació constitutiu semblant al de cèl·lules WT en condicions de potassi limitant. A més, la sobreexpressió de la quinasa Npr1 rescata parcialment els defectes de creixement observats en medis amb baixa disponibilitat de potassi i la inestabilitat de permeases de la membrana plasmàtica descrits en el mutant hal4 hal5. Per tant, identifiquem part de la ruta regulada per les quinases Hal4 i Hal5.
En els organismes eucariotes, TOR (Target of rapamycin) existeix en dos complexos multiproteics diferents, complex TOR1 (TORC1) i complex TOR2 (TORC2). Hem analitzat els substrats directes de TORC1 (Sch9) i TORC2 (Ypk1) en mutants hal4 hal5 i trk1 trk2 i en condicions de potassi limitant observant alteracions en els nivells de fosforilació dels dos efectors. Finalment, hem observat que els mutants hal4 hal5 i trk1 trk2 són altament sensibles a l'inhibidor de TORC1, rapamicina, i que aquesta sensibilitat es rescatada amb un excés de potassi en el medi. Vam comprovar que cèl·lules tractades amb rapamicina presenten una disminució del potassi intern dependent de TORC1 e independent de Trk1 i Trk2. Per tant, les nostres dades indiquen que les quinases Hal4 i Hal5 tenen un efecte més específic sobre Npr1 i que hi ha una regulació recíproca entre el potassi i / Primo Planta, C. (2015). Mecanismos de regulación post-traduccional de transportadores de la membrana plasmática: Papel de las quinasas Hal4 y Hal5 en el tráfico de transportadores de nutrientes e iones en el organismo modelo Saccharomyces cerevisiae [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/52697 / TESIS
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upv.es/oai:riunet.upv.es:10251/52697 |
| Date | 06 July 2015 |
| Creators | Primo Planta, Cecilia |
| Contributors | Yenush, Lynne Paula, Universitat Politècnica de València. Departamento de Biotecnología - Departament de Biotecnologia |
| Publisher | Universitat Politècnica de València |
| Source Sets | Universitat Politècnica de València |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/acceptedVersion |
| Rights | http://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 0.0044 seconds