Deux classes de poly(A)-binding protein (PABP) lient la queue poly(A) des ARNm chez la plupart des mammifères: PABPC1 au cytosol et PABPN1 au noyau. PABPC1 stimule la traduction des ARNm tandis que PABPN1 stimule la processivité de la poly(A) polymérase tout en contrôlant la taille des queues poly(A). Il est à noter que les orthologues de PABPC1 sont bien caractérisés chez la levure, toutefois un homologue de PABPN1 n'avait jamais été identifié. Précédemment, le Dr. Bachand avait réalisé une purification par affinité avec la protéine d’arginine méthyltransférase I (Rmt1) couplée à la spectrométrie de masse, ce qui a permis d'identifier l’homologue de PABPN1 (Pab2) chez la levure à fission. Différentes expériences ont démontré que Pab2 est une protéine nucléaire non-essentielle qui lie spécifiquement des séquences poly(A) in vitro. Pab2 a été identifiée par son interaction avec Rmt1 et cette enzyme méthyle les arginines présentes dans le domaine riche en arginine de la protéine Pab2. Cette modification post-traductionnelle n'affecte pas la localisation nucléaire et l’affinité aux séquences poly(A) de Pab2. Par contre, les niveaux d’oligomérisation de Pab2 sont nettement augmentés lorsque Pab2 n’est plus méthylée. De plus, les ARNs provenant de cellules [Delta]pab2 sont hyperadénylés, ce qui corrobore avec la fonction de PABPN1 à contrôler la taille des queues poly(A) in vitro. Par la suite, j'ai caractérisé l’implication de Pab2 durant la maturation du pré-ARNm. Des essais d'immunoprécipitation de chromatine (ChIP) ont établi que Pab2 est recrutée co-transcriptionnellement aux gènes activement transcrits. De façon surprenante, mes études ont démontré que le recrutement de Pab2 précède celui d'un facteur impliqué dans le clivage et la polyadénylation. De plus, le recrutement de Pab2 dépend de l’ARNm naissant. Conséquemment, j'ai voulu identifier les protéines associées à Pab2. Ainsi, une purification d’affinité par tandem couplée à la spectrométrie de masse a révélé que Pab2 est associée à plusieurs protéines ribosomales ainsi que des facteurs de traduction générale. Ces données étaient étonnantes puisque la traduction des ARNm implique la protéine Pab1. Par conséquent, il était pertinent de vérifier le rôle possible de Pab2 sur la traduction. À priori, j ’ai confirmé que Pab2 fait la navette entre le noyau et le cytosol, ce qui concorde avec l’orthologue PABPN1. Par la suite, j'ai démontré qu’une fraction de la protéine Pab2 demeure associée aux ARNm activement traduits. Il devenait alors intéressant de connaître les cibles de Pab2. L’analyse génomique a établi que Pab2 régule l’expression de certains transcrits, tels que les gènes méïotiques, les snoRNAs et les rétrotransposons. Pour la suite de mes recherches, je me suis concentrée sur le gène codant pour la protéine ribosomale de la large sous-unité Rpl30-2, dont l’expression augmente de 4 fois en absence de Pab2. Il est intéressant de noter que le changement d ’expression de Rpl30-2 dans une souche [Delta]pab2 dépend de la présence de l’intron Rpl30-2. Mes travaux démontrent que l’expression de Rpl30-2 est régulée au niveau du pré-ARNm par Pab2 et Rrp6, une composante de l’exosome nucléaire. De plus, l’analyse du transcriptome par RNA-seq a établi que ce mécanisme permet de réguler l’expression d'une soixantaine de gènes qui sont inefficacement épissés. En ce qui concerne Rpl30-2, l’épissage de ce transcrit est ralenti par Rpl30-1, le paralogue de Rpl30-2. L’ensemble de mes travaux ont pu caractériser l’homologue de PABPN1 (Pab2) chez la levure à fission tout en établissant une fonction spécifique pour cette poly(A)-binding protein.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usherbrooke.ca/oai:savoirs.usherbrooke.ca:11143/6241 |
| Date | January 2012 |
| Creators | Lemieux, Caroline |
| Contributors | Bachand, François |
| Publisher | Université de Sherbrooke |
| Source Sets | Université de Sherbrooke |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Thèse |
| Rights | © Caroline Lemieux |
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