Tendo em vista a importância do permutador Na+/H+ (isoforma 3) na reabsorção de NaCl e NaHCO3 em túbulos proximais e conseqüentemente no equilíbrio ácido-base e volume celular, surgiu o interesse em identificar a região promotora essencial para a transcrição do gene NHE3 e os elementos de ligação de fatores de transcrição presentes no mesmo, em células de túbulos proximais renais. Para isso, os segmentos da região flanqueadora 5´ do gene NHE3 de rato foram obtidos por PCR e inseridos no plasmídeo pGL3-basic, que codifica o gene repórter Firefly lucíferase. Os seguintes fragmentos foram analisados 1) -157 a +31; 2) -152 a +55; 3) -85 a +31; 4) -65 a +31; 5) -44 a +31; 6) -33 a +31; 7) -25 a +31; 8) -157 a +35, com deleção do elemento GATA (posição +20 a +23). Estes foram transfectados em células OKP, uma linhagem de túbulos proximais de rim de opossum. A atividade promotora de transcrição de cada segmento foi analisada em comparação com a atividade de luciferase observada com a transfecção do vetor pGL3-basic não recombinante, sem promotor. Foi realizado a cotransfecção do vetor pRL-CMV, que contém o gene da proteína repórter Renilla luciferase, usado como controle da eficiência de transfecção. Após serem analisados os resultados, observou-se que a atividade do promotor foi mais elevada com o constructo -152 a +55 (76.52 ± 45.26 (n=9)). Além disso, conseguimos identificar a existência de possíveis ativadores transcricionais no segmento entre a posição 85 e 65 (Egr-1/Sp1); 44 e 33 (Egr-1) e -33 e -25 (elemento TATA-Box não canônico), pois a remoção destes nucleotídeos reduziu significativamente a atividade do promotor. Outra observação foi a presença de elementos inibitórios entre as bases 65 e 44 (Sp1/Ap2), pois com a retirada destes, observamos um aumento muito significativo da atividade do promotor. O menor segmento (25/+31) apresentou atividade promotora significativa, sugerindo que ainda tenha os elementos indispensáveis para a montagem do complexo transcricional primário, embora com eficiência já bem reduzida. A presença do elemento GATA no primeiro exon, embora importante para a transcrição do gene NHE3 em células intestinais, não parece ser importante para a atividade transcricional em células de túbulos proximais. / In view of the importance of the exchanger Na+/H+ (isoform 3), in reabsoption of NaCl and NaHCO3 in proximal tubules and consequently the acid-base balance, and cell volume, came the interest in identifying the region promoter essential for transcription of the NHE3 gene and the elements of the binding of transcription factors present in the same, in cells renal proximal tubules. For this, segments of the 5 flanking region of the rat NHE3 gene were obtained by PCR and inserted into pGL3-basic vector, which encodes Firefly luciferase reporter gene. The following fragments were analyzed 1) -157 to +31, 2) -152 to +55, 3) -85 to +31, 4) -65 to +31, 5) -44 to +31, 6) -33 to +31, 7) -25 to +31; 8) -157 to +35, with deletion of the GATA element (position +20 to +23). These were transfected in OKP cells, line of the renal proximal tubules of opossum kidney. The promoter activity of transcription of each segment was analyzed in comparison with the luciferase activity observed with transfection of the pGL3-basic vector recombinant, without promoter. Was performed cotransfecção of PRL-CMV vector, containing the gene of the reporter protein Renilla luciferase, used as internal control of the efficiency of transfection. After analyzing the results, observed promoter activity was higher with the construct -152 to +55 (76.52 ± 45.26 (n = 9)). Furthermore, we identify the possible existence of transcriptional activators in the segment between position -85 and -65 (Egr-1/Sp1), -44 and -33 (EGR-1) and -33 and -25 (atypical TATA-box element) because the removal of these nucleotides significantly reduced the activity of the promoter. Another observation was the presence of inhibitory elements between bases -65 and -44 (Sp1/Ap2), because with the deletion of these, we observed a very significant increase in the activity of the promoter. The lower segment (-25 / +31) showed significant promoter activity, suggesting that still has the elements essential for transcriptiption complex assembly of the primary, in spite of with reduced efficiency well. The presence of the GATA element in the first exon, although important for the transcription of the NHE3 gene in intestinal cells, does not appear to be important for transcriptional activity in cells of proximal tubules.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-01072009-104645 |
| Date | 29 April 2009 |
| Creators | Neri, Elida Adalgisa |
| Contributors | Reboucas, Nancy Amaral |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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