Neste trabalho foi transfectada uma linhagem de células embrionárias de rim humano (HEK293) com os genes das subunidades α e β da tireotrofina humana (hTSH), hormônio glicoproteico secretado pela hipófise. Após 5 dias de cultivo obteve-se uma concentração de hTSH no meio condicionado de 0,95μg/mL. O material foi concentrado e purificado utilizando uma estratégia envolvendo duas etapas, uma cromatografia de troca catiônica e uma cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) de fase reversa, que permitiu uma recuperação de 55% e uma pureza >90%. O produto purificado (hTSH-HEK) foi analisado e comparado a uma preparação comercial obtida em células CHO (hTSH-CHO) e a uma preparação hipofisária (hTSH-Pit). A identidade e a pureza do hTSH-HEK foram avaliadas por métodos físicoquímicos e imunológico (espectrometria de massa MALDI-TOF, HPLC de exclusão molecular e de fase reversa, SDS-PAGE e ensaio imunoradiométrico). A porção glicídica do hTSH-HEK foi avaliada pela análise do perfil dos N-glicanos e o comportamento biológico deste hormônio foi avaliado por bioensaio in vivo e estudo farmacocinético. As 3 preparações apresentaram pureza equivalente (97%) e a massa molecular relativa do hTSH-HEK foi 2,1% menor do que a do hTSH-CHO e 2,7% maior do que a do hTSH-Pit. A maior hidrofobicidade relativa, avaliada por RP-HPLC, foi a do hTSH-HEK. Os N-glicanos identificados no hTSH-HEK foram do tipo complexo, apresentando predominantemente estruturas tri-antenárias, enquanto no hTSH-CHO e no hTSH-Pit as estruturas bi-antenárias foram predominantes. Foram detectadas diferenças significativas relacionadas à composição dos carboidratos para estas preparações, um teor muito menor de ácido siálico e muito maior de fucose foram observados no hTSHHEK. Foi confirmada a atividade biológica das 3 preparações, sendo a bioatividade do hTSHHEK 39% e 16% inferior à do hTSH-CHO e hTSH-Pit, respectivamente. A meia-vida circulatória do hTSH-HEK foi menor (1,5 X) que a do hTSH-CHO e a do hTSH-Pit (1,2 X). De acordo com esses resultados o hTSH-HEK pode ser considerado uma alternativa viável para aplicações clínicas especialmente por sua origem humana e composição de carboidratos. / In this work a strain of embryonic human kidney cells (HEK293) was transfected with the genes of the α and β subunits of human thyrotropin (hTSH), a glycoproteic hormone secreted by the pituitary gland. After 5 days of culture, the concentration of hTSH in conditioned medium was 0.95μg/mL. The material was concentrated and purified utilizing a strategy involving two steps, a cation-exchange chromatography and a reversed phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC), providing an overall yield of 55% and a purity level > 90%. The purified material (hTSH-HEK) was analyzed and compared to a recombinant commercial preparation obtained from CHO cells (hTSH-CHO) and to a human pituitary preparation (hTSH-Pit). Identity and purity of hTSH-HEK were evaluated through physicochemical and immunological methods (MALDI-TOF mass spectrometry, size exclusion HPLC, reversed-phase HPLC, SDS-PAGE, immunoradiometric assay). Glycidic portion of hTSHHEK was evaluated by N-glycoprofiling analysis and the biological behavior of this hormone was evaluated by an in vivo bioassay and via a pharmacokinetic study. The 3 preparations showed equivalent purity (97%) and hTSH-HEK molecular mass was 2.1% lower than hTSHCHO mass and 2.7% higher than hTSH-Pit mass. The highest relative hydrophobicity, evaluated by RP-HPLC, was shown by hTSH-HEK. Remarkable differences related to the carbohydrate moiety were found for these preparations, a much lower sialic acid content and a higher fucose content being observed in hTSH-HEK. Biological activity was confirmed for the three preparations, the hTSH-HEK bioactivity being 39% and 16% lower than hTSH-CHO and hTSH-Pit, respectively. The hTSH-HEK circulatory half-life (t1/2) was lower than that of hTSHCHO (1.5-fold) and hTSH-Pit (1.2-fold). According to these findings, HEK293-derived hTSH can be considered useful for clinical applications, also in view of its human origin and particular N-glycan composition.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-05122016-160030 |
| Date | 23 September 2016 |
| Creators | Sant'Ana, Patricia Marinho |
| Contributors | Ribela, Maria Teresa de Carvalho Pinto |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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