O reconhecimento eficiente do fungo Paracoccidioides brasiliensis pelos receptores do sistema imune inato do hospedeiro é essencial para a proteção contra a paracoccidioidomicose (PCM), micose sistêmica prevalente na América Latina. Diferente dos receptores do tipo Toll (TLRs),os receptores do tipo Nod-like (NLRs) são proteínas citoplasmáticas com capacidade de formar uma plataforma molecular denominada inflamassoma. Esta plataforma ativa caspase-1 e desencadeia a produção de IL-1? e IL-18. O inflamassoma de NLRC4 regula a resposta imune contra bactérias intracelulares através do reconhecimento de flagelina. No entanto, mesmo na ausência desta molécula, a bactéria Shigella flexneri é capaz de ativar o inflamassoma de NLRC4, o que sugere a existência de outros agonistas. Trabalhos recentes mostraram que o inflamassoma de NLRC4 tem papel importante no controle da infecção por Candida albicans. Contudo, sua participação na infecção por P. brasiliensis é uma incógnita. Portanto, o presente estudo teve como objetivo avaliar a participação do inflamassoma de NLRC4 na paracoccidioidomicose experimental. Os resultados obtidos demonstram que durante a infecção experimental por P. brasiliensis,macrófagos derivados de medula óssea (BMDM) provenientes de animais Nlrc4-/- produzem mais IL-1? do que BMDM de animais controles. Não foram detectadas diferenças significativas quanto aos níveis de TNF- ? em ambos os grupos. Para investigar o mecanismo responsável pelo aumento da produção de IL-1? por BMDM de camundongos Nlrc4-/-, as expressões do gene Nlrp3 e Nlrc4 foram avaliadas por qPCR durante, 0, 2, 6, 12, e 24 horas após a infecção. Comparado aos camundongos WT, BMDM de animais Nlrc4-/- exibiram um aumento na expressão de Nlrp3 durante as primeiras 12 horas de infecção. Surpreendentemente, 24 horas após a infecção, um aumento na expressão do gene de Nlrc4 foi detectado em BMDM de animais Nlrp3-/-, comparado ao controle. Estes resultados sugerem que o inflamassoma de NLRC4 reprime a atividade do inflamassoma de NLRP3, e consequentemente, anula a produção de IL-1? em macrófagos estimulados por P. brasiliensis. Além disso, camundongos Nlrc4-/- exibiram um aumento na produção de IL-1? e redução na produção de IL-18 aos7 dias após a infecção in vivo. Em contraste, a produção de IL-1? foi menor e a produção de IL-18 aumentou aos 30 dias após a infecção.Comparado ao grupo controle observamos menor carga fúngica, formação de granulomas bem definidos e compactos e redução na fibrose em pulmões de camundongos Nlrc4-/- aos 30 dias após infecção. Adicionalmente, observamos aumento na produção de citocinas do perfil Th1 (IFN-?, IL-12p40) e níveis reduzidos de IL-10. Em conclusão, estes dados mostram que o inflamassoma NLRC4 tem papel importante na suscetibilidade do hospedeiro durante a infecção por P. brasiliensis. / The efficient recognition of P. brasiliensis fungal cells by immune system receptors is essential for protection against paracoccidioidomycosis (PCM), a systemic mycosis prevalent in Latin America. Different from the Toll-like receptors (TLRs), NOD-like receptors (NLRs) are cytoplasmic proteins able to form the molecular platform, denominated inflammasome. This platform activates caspase-1 and triggers the production of IL-1? and IL-18. The NLRC4 inflammasome regulates the immune response against intracellular bacteria through recognition of flagellin. However, even in the absence of this structure, the bacteria Shigella flexneri activates the NLRC4 inflammasome, suggesting the existence of other agonists. It is known that NLRC4 control the Candida albicans infection. Therefore, in this study we evaluated the participation of NLRC4 inflammasome in experimental paracoccidioidomycosis. Our data demonstrated that Nlrc4-/- BMDMs produces more IL-1? than WT BMDMs during P. brasiliensis infection. No differences were detected regarding to TNF-? levels in both groups. To investigate the mechanism responsible to improvement of IL-1? production by Nlrc4-/- BMDMs, the nlrp3 and nlrc4 gene expression were evaluated by qPCR during 2, 6, 12 and 24 hours post infection. Compared to WT mice, the expression of nlrp3 was increased in Nlrc4-/- BMDMs during the first 12 hours of infection. Surprisingly, at 24 hour post infection and nlrc4 exhibited increased expression in Nlrp3-/- BMDMs, compared to WT controls. These data suggest that NLRC4 represses NLRP3 inflammasome activity, and consequently, abrogates the IL-1B production by P.brasiliensis estimuled macrophages. Furthermore, Nlrc4-/- mice exhibited an increased production of IL-1? and decreased production IL-18 at 7 days post infection in vivo. In contrast, there was a decrease in the production of IL-1? and increased production of IL-18 at 30 days post infection. Compared to controls, we observed lower fungal load, the formation of well-defined and compact lung granulomas, and decreased fibrosis in the lungs of Nlrc4-/- mice after 30 days post infection. In addition, we observed increased production of Th1 cytokine profile (IFN-?, IL-12p40) and reduced levels of IL-10. In conclusion, these data show that NLRC4 inflammasome play an important role on the host susceptibility during P. brasiliensis infection.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-06042018-100929 |
| Date | 16 May 2017 |
| Creators | Souza, Camila de Oliveira Silva e |
| Contributors | Silva, João Santana da |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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