O vírus da mancha das orquídeas ("Orchid fleck virus" - OFV), transmitido pelo ácaro Brevipalpus californicus, causa manchas cloróticas e necróticas em orquídeas de vários gêneros e foi relatado em diversos países. O diagnóstico de "orchid fleck", doença causada pelo OFV, tem sido feito através da análise dos sintomas, sorologia, observação de cortes ultrafinos de tecido infectado em microscópio eletrônico de transmissão ou RT-PCR. No entanto, apesar de testes moleculares serem freqüentemente mais eficientes e específicos que outros métodos, os "primers" disponíveis na literatura nem sempre detectam o vírus em baixas concentrações no tecido vegetal, ou amplificam regiões da planta sadia. Com base nas seqüências nucleotídicas da capa protéica viral depositadas no GenBank foram desenhados novos "primers", que amplificam um fragmento de 326 pb. Esses "primers" foram utilizados para a detecção do OFV por RT-PCR e para a marcação com digoxigenina de sondas para hibridização. A variabilidade de um fragmento do gene da capa protéica deste vírus foi estudada por polimorfismo conformacional de fita simples ("Single strand conformational polymorphism" - SSCP) e seqüenciamento de nucleotídeos. Quarenta e oito amostras de 18 gêneros de orquídeas foram coletadas no Brasil, Costa Rica e Austrália. As análises dos padrões de SSCP resultaram em seis haplótipos diferentes e em agrupamentos baseados na origem geográfica das amostras. Amostras representando cada um desses padrões foram seqüenciadas e comparadas com aquelas disponíveis no GenBank. A análise de SSCP provou ser eficiente para fornecer informações preliminares sobre a variabilidade do OFV. No entanto, apenas através do seqüenciamento de nucleotídeos das amostras foi possível determinar a real variabilidade das mesmas. / Orchid fleck virus (OFV), transmitted by the mite Brevipalpus californicus, causes chlorotic and necrotic ringspots in many orchid genera and was reported in several countries. The diagnosis of the Orchid fleck disease has been performed by symptomatology, transmission electon microscopy, serology or RT-PCR. Even though the molecular tests are usually more efficient and specific than other methods, the available primers did not always detect the OFV in low concentrations or sometimes amplified healthy plant samples. Based on the nucleotide sequences of the coat protein gene (cp) available in the GenBank, new primers were designed. These primers amplified a 326 pb specific OFV fragment and were used for RT-PCR and as hybridization probes. The variability of a fragment of the cp of this virus was investigated by "single strad conformational polymorphism (SSCP)" and nucleotide sequencing. Forty eight samples of 18 genera of orchids were collected from Brazil, Costa Rica and Australia. The SSCP analysis resulted in six different haplotypes and demonstrated a clustering in samples based on geographical origin. Samples representing the different SSCP patterns were sequenced and compared with those available in the GenBank. The SSCP analysis proved to be efficient to provide preliminary information about OFV variability. However, only through nucleotide sequencing it was possible to determine the actual variability amongst the samples.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-16082006-145459 |
| Date | 23 June 2006 |
| Creators | Kubo, Karen Sumire |
| Contributors | Kitajima, Elliot Watanabe |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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