O sistema coletor de energia luminosa (LHCII) funciona como um sistema antena associado a um centro de reação do PSII. O sistema antena é formado por moléculas de clorofila complexadas às proteínas CAB ("Chlorophill a/b binding proteins"). As moléculas de clorofila são excitadas pela energia luminosa, e quando voltam para o estado de repouso dessa transição, tem-se a liberação de elétrons que são transportados do PSII para PSI, gerando NADPH e ATP. A proteína Lhcb1*2 é a principal proteína CAB, e está associada à cerca de 50% das moléculas de clorofila do PSII. O emprego de técnicas de biotecnologia, como a transformação genética de plantas, representa uma ferramenta adicional para melhorar o potencial produtivo das espécies cultivadas. Por exemplo, o aumento de biomassa é uma característica de ser conseguida em diversas culturas e está relacionada, em grande parte, à capacidade fotossintética das plantas. As plantas superiores, são capazes de ajustar o tamanho do sistema antena (LHCII), localizados nas membranas dos tilacóides dos cloroplastos, como observado em estudos anteriores, em nosso laboratório, sobre a regulação do processo fotossintético, em plantas transgênicas de tabaco (Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1) que superexpressaram o gene quimérico Lhcb1*2 de ervilha. A expressão deste gene foi facilitada pelo promotor constitutivo 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV). Neste caso foram obtidas duas linhagens que têm alta expressão desse transgene e os resultados mostraram que a expressão ectópica do gene Lhcb1*2 resultou em um aumento da capacidade fotossintética das plantas transgênicas em condições limitantes de luz, e também em uma série de efeitos pleiotrópicos no desenvolvimento e anatomia foliar. Assim, o objetivo dessa dissertação foi o de obter-se um maior número de linhagens transgênicas de tabaco, para o estudo posterior de diferentes níveis de expressão do transgene, de forma a entender a relação entre o nível de expressão do transgene e os efeitos sobre o desenvolvimento, anatomia foliar e fisiologia das plantas transgênicas. O sistema de transformação de plantas utilizado foi o de Agrobacterium tumefaciens. A identificação dos transformantes feita por PCR. As plantas PCR positivas foram então autofecundadas, e suas progênies, avaliadas em meio seletivo. As plantas que apresentaram o padrão de seleção, de três plantas resistentes para uma suscetível à canamicina, foram selecionadas. Nove plantas de cada progênie resistente foram novamente autofecundadas, para a identificação de plantas homozigotas para o transgene. Dezessete linhagens, independentes e homozigotas para o transgene, foram obtidas de dezenove plantas com segregação mendeliana (3:1). A análise de Southern blot de 12 plantas PCR positivas e homozigotas para o transgene, apenas uma planta revelou-se negativa, e várias, apesar da segregação mendeliana, apresentaram mais de uma cópia do transgene integrado ao seu genoma. / The LHCII light harvesting complex acts as an antenna system, associated to the (PSII) core complex. The LHCII is formed by chlorophyll molecules associated to the CAB proteins ("chlorophyll a/b binding proteins"). The chlorophyll molecules are excited by the light energy, before returning to the steady state. From this transition, electrons are liberated and transferred form PSII to PSI, producing NADPH and ATP. The Lhcb 1*2 is the major CAB protein and binds around 50% of total PSII Chlorophyll molecules. The use of biotechnology techniques, such as plant genetic transformation, represent an additional tool to improve the productive potential of cultivated species. For example, the increase in biomass is a (desired) feature to be achieved in several cultures and is largely related, to the photosynthetic capacity of higher plants. The higher plants are able to adjust the size of the LHCII antenna system, located in the thylakoid membrane of the chloroplasts, as observed in previous work in our laboratory, consuming the regulation of the photosynthetic apparatus in transgenic tobacco plants overexpressing the chimeric pea Lhcb1*2 gene. The expression of this gene was facilitated by the constitutive cauliflower mosaic virus 35S promotes (CaMV). ln this case, two lines, showing high expression of the transgene were obtained and the results showed that the ectopic expression of the Lhcb 1*2 lead to an enhanced photosynthetic capacity of these transgenic lines in limiting light conditions and also to a series of pleitropic effects upon development and leaf anatomy. So, the aim of this work was to obtain a larger number of transgenic tabacco lines for a future study of the different levels of the transgene expression , o be able to understand the relation between the transgene expression level and its effects upon development , leaf anatomy and fisiology of these transgenic plants. Toe plant transformation system used was the Agrobacterium tumefaciens one. The identification of the transformants was made by PCR. The PCR positive plants where then selfcrossed, and their progeny, evaluated in selective medium. The plants which showed a selective pattern of three resistant plants to one susceptible to kanamycin, were selected. Nine plants of each resistant progeny were selfcrossed a second time, for the identification of the homozygous transgenic lines. Seventeen independent homozygous transgenic lines were obtained, out of nineteen plants which showed Mendelian Segregation (3: 1 ). From the Southern blot analysis of thirteen PCR positive plants, homozygous plants, only one was not a genuine transformant and others, showed more than one copy of the transgene integrated into their genome, although the pattern of the segregation was Mendelian.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-20190821-132452 |
| Date | 25 January 2002 |
| Creators | Gomes Junior, Rui Alberto |
| Contributors | Labate, Carlos Alberto |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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