A endostatina (ES) é uma proteína inibidora da angiogênese, com ação específica sobre células endoteliais em proliferação, utilizada para tratamento de tumores sólidos. No entanto, o elevado efeito antitumoral da ES observado em animais não é reproduzido em humanos. Com o intuito de potencializar a eficácia terapêutica da ES, produzimos duas proteínas híbridas com dois domínios funcionais. O primeiro domínio é a ES, que apresenta especificidade por células endoteliais ativadas, dirigindo estas proteínas de fusão às células endoteliais em proliferação, promovendo sua internalização e seu efeito inibitório. Como segundo domínio funcional utilizamos os domínios BH3 próapoptóticos de duas proteínas BH3-only com o objetivo de promover a liberação de citocromo C e desencadear o processo de apoptose, aumentando a ação antiangiogênica da ES. Neste trabalho, foram desenhadas duas proteínas de fusão que contêm o domínio BH3 das potentes proteínas pró apoptóticas PUMA e BIM (ES-PUMA e ES-BIM), que deveriam apresentar efeito antiangiogênico potencializado em relação à ES selvagem. A inserção dos fragmentos de DNA codificantes para os domínios BH3 de PUMA e BIM no vetor contendo o gene da ES (pET-ES) foram realizadas por mutagênese sítiodirigida. Estas proteínas de fusão recombinantes foram expressas como corpos de inclusão em E.coli, renaturadas utilizando processo que utiliza alta pressão e purificadas em resina de afinidade por heparina. O tratamento de células endoteliais com as proteínas ES-PUMA e ES-BIM não levou à queda de viabilidade em ensaio de MTS ou de apoptose avaliado por citometria de fluxo, em comparação com os resultados obtidos pelo tratamento com ES. / Endostatin (ES) is an angiogenesis inhibitor protein, with specific effect on proliferating endothelial cells, used to treat solid tumors. However, the high antitumor effect observed in animals is not reproduced in humans. In order to enhance the therapeutic efficacy of ES, we produced two hybrid proteins with two functional domains. The first domain is the ES that is specific for activated endothelial cells, directing the fusion proteins to endothelial cells in proliferation, promoting the internalization and the inhibitory effect. As a second functional domain we used the pro-apoptotic BH3 domains of two BH3-only proteins in order to promote the release of cytochrome C and trigger the apoptosis process, increasing the ES antiangiogenic action. In this work, we produced two fusion proteins containing the BH3 domain of the potent pro-apoptotic proteins BIM and PUMA (PUMA-ES and ES-BIM), which should provide enhanced antiangiogenic effect in relation to ES. The insertion of DNA fragments coding for the BH3 domain and PUMA and BIM in a vector containing ES gene (pETES) was accomplished by site-directed mutagenesis. These recombinant fusion proteins were expressed as inclusion bodies in E. coli, refolded using process at high pressure and purified on heparin affinity resin. Treatment of endothelial cells with ES-PUMA and ES-BIM did not lead to loss in viability in MTS assay or increase of apoptosis evaluated by flow cytometry, in comparison with the results obtained by treatment with ES.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-23032016-155417 |
| Date | 23 November 2015 |
| Creators | Silva, Natan Versati da |
| Contributors | Dias, Ligia Ely Morganti Ferreira |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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