As formigas cortadeiras coletam material vegetal para cultivar um fungo simbionte utilizado como fonte de alimento. Colônias de formigas agricultoras podem ser atacadas por micro-organismos invasores e, para proteção do ninho, as formigas se associaram com bactérias produtoras de antibióticos. O objetivo desse trabalho foi estudar os produtos naturais produzidos por micro-organismos associados aos ninhos da formiga cortadeira Atta sexdens rubropilosa. Formigas e amostras dos jardins foram lavadas com solução aquosa estéril e bactérias dos gêneros Serratia, Pseudonocardia e Burkholderia foram isoladas em meio ágar ISP-2 e quitina. A bactéria Serratia marcescens 3B2 produz as substâncias 3-etil-2,5-dimetil-pirazina e 2,5-dimetil-pirazina, que são componentes do feromônio de trilha das formigas Atta sexdens rubropilosa, e ácido indol-3-acético e ácido fenilacético, que são encontrados nas glândulas metapleurais dessas formigas. O genoma dessa bactéria foi sequenciado e os antibióticos andrimide, oocidina e serratamolide foram identificados por genome mining e desreplicação dos extratos. Os estudos biossintéticos da 3-etil-2,5-dimetil-pirazina e 2,5-dimetil-pirazina utilizando precursores isotopicamente marcados revelaram que o aminoácido L-treonina é precursor biossintético dessas substâncias. Bactérias Pseudonocardia spp., isoladas das formigas e jardins do fungo simbionte, inibiram o crescimento do fungo Escovopsis sp., que é parasita dos jardins cultivados pelas formigas. O extrato em acetato de etila da bactéria Pseudonocardia sp. 1B7 foi submetido ao isolamento monitorado pela atividade antifúngica, o que levou a identificação do ácido indol-3-acético como responsável pela inibição observada. O ácido indol-3-acético inibiu seletivamente o crescimento de esporos de cinco linhagens de Escovopsis spp. e não foi ativo contra o fungo cultivado como alimento pelas formigas, Leucoagaricus gongylophorus. O genoma da bactéria Pseudonocardia sp. 1B7 foi sequenciado e a biossíntese do ácido indol-3-acético foi determinada como dependente do aminoácido L-triptofano. A bactéria Burkholderia sp. JB2, isolada do jardim fúngico, produz o antibiótico tropolone, que apresenta elevada atividade inibitória frente ao fungo Escovopsis sp. devido a privação de ferro. Análises de microscopia eletrônica de varredura revelaram que os jardins do fungo simbionte estão encobertos por uma camada resistente a água, que aparenta estar relacionada com a proteção dos jardins. O fungo entomopatogênico Aspergillus nomius ASR3 foi isolado de uma rainha morta de Atta sexdens rubropilosa e as aflatoxinas B1 e G1 foram produzidas por esse fungo em condições laboratoriais e na formiga de onde foi isolado. Os resultados obtidos destacam a importância de metabólitos produzidos pela microbiota bacteriana para a defesa e comunicação das formigas. O conhecimento gerado pode servir de inspiração no desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas e formas de controle das formigas cortadeiras que sejam menos prejudiciais ao meio ambiente / Leaf-cutter ants collect plant material to cultivate their food source, a symbiotic fungus. Their colonies can be attacked by invading microorganisms and the ants have associated with protective antibiotic-producing bacteria. This work aimed to study the natural products produced by microorganisms associated with nests of the leaf-cutter ant Atta sexdens rubropilosa. Ants and fungal garden samples were washed with sterile aqueous solution and bacteria of the genera Serratia, Pseudonocardia and Burkholderia were isolated using ISP-2 and chitin agar plates. Serratia marcescens 3B2 produces 3-ethyl-2,5-dimethyl-pyrazine and 2,5-dimethyl-pyrazine, which are components of the ant trail pheromone, and the components of the metapleural glands secretions indole-3-acetic acid and phenylacetic acid were also produced by this strain. Serratia marcescens 3B2 genome was sequenced and the production of the antibiotics andrimid, oocydin A and serratamolide were identified by genome mining and dereplication of the crude extracts. Isotope labeling experiments have revealed that the amino acid L-threonine is the biossyntetic precursor of 2,5-dimethylpyrazine and 3-ethyl-2,5-dimethylpyrazine. Pseudonocardia spp., isolated from the ants and fungal garden, inhibited the growth of the fungus Escovopsis sp., a specialized fungal garden parasite. A bioassay-guided isolation of the Pseudonocardia sp. 1B7 ethyl acetate extract revealed indole-3-acetic acid as the active compound. This natural product selectively inhibited the spores growth of five Escovopsis spp. strains and it was not active against the fungal cultivar Leucoagaricus gongylophorus. Isotope feeding experiments and whole-genome sequencing of Pseudonocardia sp. 1B7 indicated that indole-3-acetic acid is biosynthesized by L-tryptophan dependent pathway. Burkholderia sp. JB2 was isolated from the fungal garden and it produces the antibiotic tropolone, which inhibits the Escovopsis sp. growth by iron privation. The fungal gardens produce a water-resistant layer that seems to be related to the garden protection, as evidenced by scanning electron microscopy analysis. The entomopathogenic fungus Aspergillus nomius ASR3 was isolated from a dead Atta sexdens rubropilosa queen and the aflatoxins B1 and G1 were produced by this fungus in laboratory and natural conditions. The results highlight the importance of bacterial microbiota for the defense and communication of Atta sexdens rubropilosa. These results could contribute for future development of new therapeutic strategies and environmentally friendly techniques to control leaf-cutter ants
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-23052017-151620 |
| Date | 24 March 2017 |
| Creators | Silva Junior, Eduardo Afonso da |
| Contributors | Clardy, Jon, Pupo, Monica Tallarico |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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