A Proteína Transportadora de Poliaminas (PotD) é um antígeno importante para a virulência de Streptococcus pneumoniae in vivo, capaz de proteger camundongos imunizados contra infecção sistêmica, além de reduzir a colonização da nasofaringe dos animais. Porém, visando ampliar a cobertura vacinal, a combinação com outros antígenos da bactéria se faz necessária. Este trabalho teve como objetivo aprofundar o estudo sobre a resposta imune gerada contra a proteína PotD, sozinha ou em fusão com duas outras proteínas pneumocócicas: o derivado de Pneumolisina, PdT, e a proteína de superfície de pneumococo A (PspA). Para tanto, os genes potD, pdT e pspA foram clonados e expressos, sozinhos ou fusionados, gerando as proteínas híbridas rPotD-PdT e rPspA-PotD. As proteínas recombinantes e os híbridos foram utilizados na imunização subcutânea de camundongos BALB/c, gerando elevados níveis de anticorpos. O soro dos animais imunizados foi capaz de reconhecer e se ligar à superfície de diferentes isolados de pneumococos, e de ampliar a fagocitose da bactéria por células peritoneais murinas in vitro. Em todos os ensaios, os híbridos se mostraram mais eficazes do que as proteínas isoladas, induzindo anticorpos capazes de potencializar a fagocitose dos pneumococos. A resposta imune celular foi caracterizada pela produção de INF-γ, IL-2 e IL-17 pelos esplenócitos, e um aumento na produção de NO pelos fagócitos peritoneais dos animais imunizados. Apesar dos resultados promissores in vitro, a proteína rPotD-PdT não foi capaz de induzir proteção em nenhum dos modelos avaliados; em contraste, a fusão rPspAPotD foi capaz de proteger os camundongos contra sepse por dois isolados virulentos de pneumococo, além de reduzir a colonização na nasofaringe. Por fim, demonstramos que a adição das poliaminas transportadas por PotD, espermidina e putrescina, à cultura de pneumococos interfere na formação de biofilme in vitro. Cnsiderando o importante papel da formação de biofilmes na colonização, este resultado sugere um possível mecanismo de ação da PotD durante a colonização por pneumococo. Em conjunto, os resultados deste estudo sugerem que a utilização de uma formulação híbrida, rPspA-PotD, compreende uma estratégia vacinal promissora, capaz de proteger contra colonização e sepse pneumocócica, pela produção de anticorpos opsonizantes e ativação de citocinas protetoras, como IL-17. / Polyamine Transporter D (PotD) is an important antigen for Streptococcus pneumoniae virulence in vivo, protecting immunized mice against systemic infection and reducing the bacterial load in the nasopharynx of immunized animals. However, in order to extend vaccine coverage, the combination of PotD with other antigens of the bacterium is required. The present study aimed at expanding the investigation of the immune response generated against PotD alone or fused with two other pneumococcal proteins: the Pneumolysin derivative, PdT and Pneumococcal Surface Protein A (PspA). Therefore, the potD, pdt and pspA genes were cloned and expressed, either alone or in fusion, generating the hybrid proteins rPotD-PdT and rPspA-PotD. The recombinant proteins and hybrids were used for subcutaneous immunization of BALB/c mice, generating high levels of antibodies. Sera from immunized animals were able to recognize and bind onto the surface of different pneumococcal strains, and to enhance phagocytosis of the bacterium in vitro. In all tests, the hybrids were more effective than the isolated proteins. The cellular immune response was characterized by the production of INF-γ, IL-2 and IL-17 by splenocytes and increased production of NO by peritoneal cells of the immunized animals. Despite promising results in vitro, rPotD-PdT protein was not able to induce protection in any of the tested challenge models. In contrast, rPspA-PotD fusion was able to protect mice against sepsis with two virulent isolates of pneumococcus and led to reduction in bacterial loads in the nasopharynx of challenged animals. Finally, we demonstrate that the addition of exogenous polyamines, spermidine, and putrescine, in the pneumococcal culture interfered with biofilm formation in vitro. Considering the important role of biofilm formation for successful colonization, this result suggests a possible mechanism of action of PotD during colonization by pneumococcus. Taken together, the results suggest that the use of the hybrid rPspA-PotD comprises a promising vaccine strategy, able to protect against colonization and pneumococcal sepsis, through the production of opsonizing antibodies and activation of protective cytokines, such as IL-17.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-23052017-154053 |
| Date | 10 February 2017 |
| Creators | Converso, Thiago Rojas |
| Contributors | Leite, Luciana Cezar de Cerqueira |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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