Coxiella burnetii é a bactéria intracelular causadora da Febre Q, capaz de subverter funções celulares e evadir o reconhecimento do sistema imune da célula hospedeira permitindo o estabelecimento do seu nicho replicativo nas células-alvo: macrófagos e monócitos. É um patógeno altamente virulento, sendo necessário poucos organismos para desencadear a doença, e é considerado como um potencial agente de bioterrorismo da categoria B. Entre os danos econômicos causados por C. burnetii destaca-se a infecção de animais de gado, seu reservatório natural, pois causa aborto espontâneo dos filhotes e, consequentemente, prejuízo aos produtores. Seres humanos também adquirem a infecção, por inalação de partículas contaminadas. Hospedeiros imunocompetentes são capazes de restringir a infecção por C. burnetii apesar dos diversos mecanismos de evasão da resposta imune do hospedeiro, como interação com vias de sinalização celular e utilização de efetores bacterianos. No entanto, em hospedeiros não competentes a infecção pode evoluir para casos de Febre Q crônica e levá-los à morte. Modelos murinos são frequentemente utilizados para entender as interações patógeno-hospedeiro nas infecções por essa bactéria. A diferença na suscetibilidade de macrófagos de diferentes linhagens murinas e de diferentes tipos celulares à infecção por C. burnetii ainda é pouco conhecida. No entanto, sabe-se que C. burnetii fase II sucumbe a macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs) de camundongos C57BL/6, enquanto células das linhagens BALB/c e A/J são suscetíveis à infecção. Nesse contexto, considerando a relevância biomédica de C. burnetii, faz-se necessário a determinação de um modelo relevante para melhor compreender as relações patógeno-hospedeiro nas infecções por essa bactéria. Neste trabalho, caracterizamos um novo modelo de estudo com macrófagos primários que permite avaliar a infecção com C. burnetii fase II in vitro, além de elucidar os mecanismos relacionados à suscetibilidade das células à bactéria. Por meio de quantificação do DNA genômico bacteriano por qPCR verificamos que macrófagos alveolares (AMs) murinos são altamente suscetíveis à replicação da bactéria, mesmo no fundo gênico restritivo C57BL/6. Caracterizamos a replicação da bactéria em AMs por microscopia de fluorescência e microscopia eletrônica de transmissão e demonstramos que essa replicação ocorre dentro dos vacúolos parasitóforos típicos. Pela análise de expressão gênica por RT-PCR efenotipagem de marcadores de superfície por FACS identificamos que a alta suscetibilidade dos AMs se deve a uma polarização dessas células para um padrão M2. Por fim, validamos a relevância desse modelo pela análise da suscetibilidade de AMs murinos deficientes para NOS2, IFN-? e IL-4 como prova de princípio. Verificamos que a suscetibilidade de AMs é comparável à de células Vero e células THP-1, modelos celulares imortalizados descritos como altamente suscetíveis à replicação de C. burnetii, e que AMs podem ser utilizados para estudos utilizando células derivadas de camundongos com fundo gênico C57BL/6. Dessa forma, nosso trabalho caracterizou os AMs murinos como um relevante modelo celular primário altamente suscetível para o estudo das interações patógeno-hospedeiro frente à infecção in vitro por C. burnetii fase II, além de elucidar os mecanismos por trás dessa suscetiblidade / Coxiella burnetii is the intracellular bacterium that causes Q fever, capable of subverting cellular functions and evading recognition by the host cell immune system, thus allowing the establishment of its replicative niche in its the target cells: macrophages and monocytes. It\'as a highly virulent pathogen, with few organisms being sufficient to cause the disease, and considered a potential class B bioterrorism agent. Among the economic damages caused by C. burnetii are infection of cattle animals, its natural reservoir, that leads to spontaneous abortion of the offspring and financial loss to the producers. Human beings also acquire the infection, through inhalation of contaminated air particles. Immunocompetent hosts are able to restrict infection by C. burnetii despite the several evasion mechanisms from the host immune system, which includes interaction with cell signaling pathways and utilization of bacterial effectors. However, in non-competent hosts the infection can evolve to chronic Q Fever and lead to death. Murine models are frequently used to understand the host-pathogen interactions during infections by this bacterium. The difference in the susceptibility among macrophages from different murine strains, as well as different cell types, still poorly known. However, it is known that C. burnetii phase II succumbs to bone-marrow derived macrophages (BMDMs) from C57BL/6 mice, whereas cells from BALB/c and A/J strains are susceptible to infection. In this context, considering the biomedical relevance of C. burnetii, it\'s necessary to establish a relevant study model to better understand the host-pathogen relations in infections by C. burnetii. In this work, we characterized a new study model with primary macrophages to assess the infection by C. burnetii phase II in vitro and elucidated the mechanisms underlying the susceptibility to C. burnetii. By using qPCR for quantification of bacterial genomic DNA, we saw that murine alveolar macrophages (AMs) are highly susceptible to C. burnetii replication, even in the usually restrictive C57BL/6 backgound. We characterized the bacterium replication in murine AMs by florescence microscopy and transmission electron microscopy, showing that this replication occurred inside the typical C. burnetii-containing vacuole. We also identified, through the gene expression by RT-PCR and the phenotypic profile of surface markers by FACS, that the increased susceptibility of murine AMs were due to a polarization of these cells into a M2 profile. To finish, we validated the relevance of thismodel through the analysis of the susceptibility of murine AMs deficient to NOS2, IFN-? and IL-4 as a proof of principle. We verified that the susceptibility of AMs is comparable to Vero cells and THP-1 cells, immortalized cell models described as highly susceptible to C. burnetii replication, and that AMs can be used to studies using cells derived from mice with the C57BL/6 background. In this way, our work characterized murine AMs as a relevant primary cell model highly susceptible to studies among the host-pathogen interactions in infections with C. burnetii phase II in vitro, and we also elucidate the mechanisms underlying this susceptibility
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-30052019-154814 |
| Date | 11 December 2018 |
| Creators | Fernandes, Talita Duarte |
| Contributors | Zamboni, Dario Simões |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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