Les cellules souches pluripotentes (CSP) incluent les cellules souches embryonnaires (ES) et les celles souches pluripotentes induites (iPS). Elles sont définies par deux propriétés fondamentales : l’auto-renouvellement et la capacité à se différencier dans tous les types cellulaires. Les ES sont dérivées de la masse cellulaire de l’embryon. Elles soulèvent l’intérêt de la communauté scientifique du fait de leur capacité à générer tous les tissus. Il s’agit d’un outil biotechnologique majeur dont les applications thérapeutiques et pharmacologiques comporteront notamment la médecine régénératrice, la modélisation in vitro de maladies humaines et le criblage de candidat-médicaments. Cependant l’utilisation d’embryons humains pour générer les ES soulève des problèmes éthiques. Les iPS contournent ces difficultés car elles sont dérivées de cellules somatiques différenciées. En effet, S. Yamanaka, qui a reçu le prix Nobel en 2012, a découvert en 2006 une technique simple de reprogrammation cellulaire. L’expression transitoire de quatre gènes (OCT4, SOX2, c-MYC and KLF4) est suffisante pour reprogrammer des fibroblastes murins en iPS. Ces cellules iPS ont la même morphologie et les mêmes propriétés que les cellules ES. L’année suivante, S. Yamanaka a appliqué avec succès son cocktail à des fibroblastes humains pour produire des iPS humaines (hiPS). Les hiPS peuvent également dépasser les problèmes immunologiques soulevés par l’utilisation d’ES dans la thérapie cellulaire, par le simple fait que les hiPS pourront être dérivées du patient à traiter. De plus, parce qu’il est possible de choisir les cellules du donneur à reprogrammer selon son génotype, il est plus facile de modéliser des maladies génétiques à partir d’hiPS que d’ES. Enfin, d’un point de vue pharmaceutique, les hiPS peuvent fournir une plateforme quasi-infinie pour le criblage de molécules afin de traiter diverses pathologies. Le but de mon projet de recherche est l’utilisation de la technologie hiPS afin de modéliser le développement de l’épithélium bronchique. Premièrement, in vivo, des tératomes ont été générés après injection d’hiPS dans des souris immunodéficientes. Les tératomes démontrent la capacité de nos hiPS à se différencier en épithélium bronchique. Secondairement, in vitro, reproduire le développement embryonnaire et fœtal permet d’offrir une méthode simple pour modéliser l’épithélium bronchique dans un puits. Cette technologie ouvre la voie vers de nombreuses recherches, du criblage de molécules à la production de cellules souches pour réparer l’épithélium bronchique, et in fine à la promotion de nouveaux traitements pharmacologiques ou de thérapie innovante pour les maladies respiratoires. / Pluripotent stem cells (PSC) include embryonic stem cells (ES) and induced pluripotent stem cells (iPS). They are defined by two fundamental properties: self-renewal and the capacity to differentiate into all cell types. ES cells are derived from the inner cell mass of embryos. They arouse the interest of the scientific community in particular for their ability to generate all tissues. They provide major therapeutic and pharmacological applications, including regenerative medicine, in vitro modelling of human diseases and molecular screening. However, the use of human blastocysts to generate ES cells raises many ethical problems. iPS circumvent these ethical issues as they can be derived from differentiated somatic tissues. Indeed, S. Yamanaka, Nobel Prize in 2012, discovered in 2006 a simple technique of cellular reprogramming. The transient expression of four genes (OCT4, SOX2, c-MYC and KLF4) is sufficient to reprogram mouse fibroblasts into iPS. These iPS cells have the same morphology and the same properties than ES cells. The following year, S. Yamanaka applied successfully his cocktail to human fibroblasts to produce human iPS (hiPS). hiPS may also overcome immunological problems raised by the use of ES cell for cellular therapy, as hiPS can be derived from the patient to be treated. In addition, it is easier to model genetic diseases from hiPS than ES, because it is possible to choose the donor cells to reprogram according to its genotype. Finally, from a pharmacological point of view, hiPS can provide a broad platform of molecular screening to treat various diseases. The aim of my research project is to use the hiPS technology to model the development of bronchial epithelium. First, in vivo, teratomas were formed by the injection of hiPS into immunodeficient mice. Teratomas highlight the ability of differentiation of our hiPS into bronchial epithelium. Second, in vitro, reproducing embryonic and foetal bronchial development provides a way to model bronchial epithelium in a dish.These techniques open the door to many potential research avenues from screening small molecules to engineering stem cells to repair bronchial epithelium, and will in fine promote new pharmacologic or cell-based treatments for respiratory diseases.

La protéine CCSP (« Club Cell Secretory Protein »), produite par les cellules Club au niveau de l’épithélium respiratoire, se retrouve déficiente chez les patients atteints de Bronchopneumopathie Chronique Obstructive (BPCO). Le but de ce travail était de comprendre la régulation et les différents rôles de la protéine CCSP afin d’en évaluer son potentiel intérêt thérapeutique. Nous avons dans un premier temps observé les effets du polymorphisme connu de CCSP au niveau de sa région promotrice, la mutation G38A, sur la transcription même du gène. Nous avons constaté in vivo dans une étude clinique prospective sur 1 an comprenant 66 patients souffrant de BPCO, et confirmé in vitro dans un modèle de cellules BEAS-2B transfectées, que la fumée de cigarette était un répresseur de la transcription de CCSP et que ce phénomène était amplifié par la présence de la mutation G38A. De plus, in vitro, certains facteurs de transcription tels que p53 et Nkx2.1, ainsi que les lipopolysaccharides, affectaient l'efficacité du promoteur de CCSP.Ensuite, nous avons caractérisé les cellules qui sécrètent cette protéine dans un modèle ex vivo de culture en interface air-liquide de cellules primaires épithéliales bronchiques. Nous avons observé par microscopie électronique à balayage des cellules en dôme, forme caractéristique des cellules Club, et par microscopie électronique à transmission des cellules contenant des granules de sécrétion contenant la protéine CCSP. Nous avons constaté par immunofluorescence que les cellules marquées CCSP+ étaient également MUC5AC+ (marqueur de cellules à mucus), P63+ (marqueur de cellules basales) ou encore KI-67+ (marqueur de prolifération). Nous suggérons donc que les cellules Club sont des cellules progénitrices, permettant ainsi la régénération de l’épithélium bronchique. Par ailleurs, nous avons évalué l’implication de la protéine CCSP dans le recrutement des neutrophiles, cellules inflammatoires prépondérantes dans la BPCO. Une étude pharmacologique a d’abord permis d’évaluer les effets de CCSP sur des neutrophiles de sujets témoins. Le déplacement des neutrophiles, stimulé par l’IL8 ou le fMLP (tous deux puissants agents chemoattractants), était inhibé par CCSP. Puis, par une étude in vitro, nous avons déterminé la modulation du sécrétome de l’épithélium bronchique par CCSP. Lorsque les sécrétions d’épithélia reconstitués ex vivo à partir de biopsies de fumeur et de BPCO étaient mis en présence de neutrophiles, un chimiotactisme exagéré des neutrophiles étaient constaté. Lorsque les épithélia étaient traités avec la protéine CCSP, à l’état de base ou stimulés par de la fumée de cigarette, ce chimiotactisme exagéré était alors diminué.Enfin, dans une dernière partie, nous nous sommes intéressés à la régulation de la protéine, dans un modèle de culture cellulaire NCI-H292, lignée de cellules bronchiques cultivées en monocouche. Nous avons supplémenté ces cellules en CCSP exogène afin d’analyser les variations du profil protéomique des secrétions engendrées (méthode LC-MS/MS). De façon générale, il s’avérait que la supplémentation en CCSP permettrait une restauration de la « machinerie » du protéasome avec une augmentation des protéines de la famille des tubulines.Ce travail de thèse a démontré que la protéine CCSP était un acteur potentiel de la physiopathologie de la BPCO. L’étude de sa régulation a montré que la synthèse de CCSP était effectivement diminuée dans la BPCO. Ainsi, une supplémentation en CCSP pourrait être une piste thérapeutique. / A defective in Club Cell Secretory Protein (CCSP) produced by nonciliated Club cells was observed in COPD (Chronic Obstructive Pulmonary Disease) airways. Our aim was to understand CCSP biological mechanisms of action and its dysregulation in COPD and whether it might be a therapeutic axis in COPD.First, the influence of the CCSP G38A polymorphism on CCSP transcription levels and its regulatory mechanisms were analyzed. Our in vivo study conducted in a 1 year prospective cohort consisting of 66 COPD patients confirmed that circulating CCSP levels were associated with smoking. Moreover, the CCSP G38A polymorphism and the smoking status significantly repressed CCSP serum levels. Our in vitro study conducted in BEAS-2B transfected cells supported those findings as CSE repressed the CCSP transcription of the A carrying transfected cells more intensely than the wild type cells. Noteworthy, LPS, Nkx2.1 and p53 transcription factors also modulated the CCSP promoter efficiency in vitro. Furthermore, CCSP producing cells were characterized in an air-liquid interface (ALI) culture model of bronchial epithelial cells. Transmission electron microscopy, scanning electron microscopy and confocal microscopy confirmed the pseudostratified organization of the reconstituted epithelium. Evidences of full differentiation were identified and labeled with MUC5AC (goblet cells), tubulinIV (ciliated cells), P63 (basal cells) and CCSP (club cells). Moreover, the ex vivo reconstituted COPD epithelium released higher levels of IL8 and MUC5AC. Ki-67 and collocating antibodies with CCSP argued for an accessory stem cell and a transitory differentiating roles for CCSP+ cells.Then, we aimed to investigate whether exaggerated airway neutrophilia was driven by the CCSP-defective COPD airway epithelium. CCSP action on healthy neutrophil chemotaxis was evaluated in a pharmacological study demonstrating that CCSP directly inhibited neutrophil chemotaxis induced by fMLP and IL8. Then, in an in vitro study, ALI-reconstituted COPD airway epithelium in a clean environment promoted an exaggerated neutrophilic chemotaxis compared to smokers and controls at steady state. Treating the airway epithelium with exogenous CCSP prevented baseline and CSE-induced neutrophil chemotaxis.Finally, CCSP regulation was studied in NCI-H292 cells, a human pulmonary cell line. The cells were supplemented with CCSP. Proteomic profile (LC-MS/MS method) of the bronchial epithelium in response to CCSP treatment demonstrated that the proteasome machinery and the tubulin family members were upregulated.This work supported the potential implication of CCSP in the pathophysiology of COPD. CCSP was confirmatively defective in COPD patients, therefore, restoring physiological concentrations of CCSP by exogenous supplementation may be a therapeutic perspective.

La BPCO (bronchopathie pulmonaire chronique obstructive) est un problème majeur de santé publique et représentera la 3ème cause de mortalité dans le monde en 2030. L’âge, le tabagisme, ainsi que la pollution atmosphérique via l’exposition aux particules de diesel mais également la pollution domestique – majoritairement représentée par la combustion domestique de biomasse – sont des facteurs de risque bien identifiés d’apparition d’une BPCO. Il n’existe à ce jour aucun traitement curatif pouvant interférer avec l’histoire naturelle de la maladie.Les cellules souches pluripotentes, et notamment les cellules souches humaines pluripotentes induites (hiPSCs), sont définies par deux propriétés fondamentales : l’auto-renouvellement et la capacité à se différencier en tous les types cellulaires de notre corps. Elles offrent une opportunité sans précédent de modéliser le développement humain normal et pathologique de l’appareil respiratoire.Ce projet de recherche a pour objectif de modéliser in vitro les trajectoires de la BPCO, en lien avec une origine développementale (racines pédiatriques) et/ou une susceptibilité au tabac. Afin d’élucider les mécanismes qui sous-tendent la pathogénie de la BPCO et de la susceptibilité au tabac, nous avons constitué deux groupes caricaturaux : i) 4 patients atteints d’une forme sévère de la BPCO, constituant le groupe « hautement susceptibles », ii) 4 patients fumeurs indemnes de BPCO ou tout autre comorbidité liée au tabac « hautement résistants » au tabac.Nous avons utilisés deux modèles de culture cellulaires in vitro : les hiPSCs et la culture de cellules épithéliales primaires bronchiques humaines (HBECs) cultivées en ALI (interface air liquide).Dans un premier temps, nous avons généré des lignées hiPSCs par reprogrammation cellulaire à partir du sang périphérique d’un sujet sain (contrôle), et de trois patients BPCO sévères hautement caractérisés. Dans un second temps, la différenciation dirigée des hiPSCs a permis de récapituler le développement pulmonaire précoce (génération de progéniteurs bronchiques NKX2.1) par la mise au point d’un protocole de différenciation dirigée robuste et reproductible sur plusieurs lignées hiPSCs. La maturation de ces progéniteurs bronchiques en culture 2D ou 3D a permis d’obtenir des structures épithéliales exprimant les marqueurs de cellules basales (KRT5), de cellules Club (CCSP), et ciliées (FOXJ1). Dans un second temps, ces épithélia seront exposés au tabac (CSE- cigarette smoke extract) afin d’induire un phénotype « BPCO-like ». Enfin, la culture des HBECs cultivées en ALI des patients BPCO sévères a été réalisée en condition exposée (CSE) et non exposée. La résistance transépithéliale, la motilité ciliaire, le profil sécrétoire et la diversité ARN ont été collecté.Ce travail a permis de mettre en place les outils nécessaires pour reproduire les trajectoires in vitro de la BPCO et élucider les origines de la pathologie. Les outils de séquençage à haut débit (transcriptomique dans notre étude), permettront de découvrir de nouveaux candidats, représentants de potentielles cibles en vue d’un criblage pharmacologique. / COPD (Chronic Obstructive Pulmonary Disease) is a major public health problem and will be the 3rd leading cause of death in the world in 2030. Age, smoking, and air pollution through the exposure to particulate matter but also domestic pollution - mostly represented by domestic biomass combustion - are well-identified risk factors for the development of COPD. To date, there is no cure that can interfere with the natural history of the disease.Pluripotent stem cells, including induced pluripotent human stem cells (hiPSCs), are defined by two fundamental properties: self-renewal and the ability to differentiate into all cell types in our body. They offer an unprecedented opportunity to model the normal and pathological human development of the respiratory system.This research project aimed to model in vitro the trajectories of COPD, related to a developmental origin (pediatric roots) and / or susceptibility to tobacco. In order to elucidate the underlying mechanisms of COPD and tobacco susceptibility, we established two extreme groups: i) 4 patients with a severe form of COPD, the "highly susceptible" group, ii) 4 patients who are free of COPD or other tobacco-related comorbidity despite heavy smoking, called as "highly resistant" to tobacco.We have used two different but complementary in vitro cell culture models: hiPSCs and human bronchial primary epithelial cell cultures (HBECs) grown in ALI condition (Air Liquid Interface).First of all, we generate hiPSCs cell lines by reprogramming cells from peripheral blood of a healthy subject (control), and three highly characterized severe COPD patients. In a second step, the directed differentiation of hiPSCs allowed to recapitulate the early pulmonary development (NKX2.1 generation of bronchial progenitors) by the development of a robust and reproducible directed differentiation protocol of several hiPSCs lines. The maturation of these bronchial progenitors in 2D or 3D culture allows the generation of epithelial structures expressing markers of KRT5 + basal cells , CSSP + Club cells and FOXJ1 + ciliated cells. In a second step, these epithelia will be exposed to tobacco (CSE-cigarette smoke extract) in order to induce a "COPD-like" phenotype. Finally, ALI culture of HBECs of severe COPD patients was performed in unexposed and exposed condition (CSE). Transepithelial resistance, ciliary motility, secretory profile, and RNA diversity were collected.This work allowed to put in place the necessary tools to reproduce the in vitro trajectories of COPD and to clarify the origins of this pathology. The high throughput sequencing tools (transcriptomic in our study), will allow the discovery of new candidates, that represent potential targets for future pharmacological screening.

L’asthme sévère de l’enfant est une pathologie respiratoire chronique dont le traitement est difficile. L’épithélium bronchique à l’interface de l’organisme et de l’environnement, est un pivot central dans la maladie asthmatique. Le but de ce travail a donc été d’étudier l’épithélium bronchique de l’enfant asthmatique sévère.Dans un premier temps, j’ai développé un modèle de reproduction d’épithélium bronchique in vitro obtenu à partir de cellules épithéliales bronchiques issues de biopsies bronchiques d’enfants asthmatiques sévères. J’ai comparé ces épithélia obtenus chez l’enfant à ceux obtenus chez l’adulte. Nous avons spécifiquement étudié un marqueur inflammatoire important dans l’asthme sévère, le TSLP. J'ai montré 2 isoformes de TSLP ayant un rôle contraire, anti inflammatoire et proinflammatoire. Dans un deuxième temps, j’ai mis au point un modèle d’exacerbation d’asthme viro-induite. J’ai utilisé le modèle de culture et soumis les cellules à une stimulation Poly I:C. Les différentes cytokines sécrétées lors d’une exacerbation asthmatique virale ont été retrouvées augmentées dans notre modèle : CXCL8, CXCL10, CCL2, CXCL9 et RANTES. Enfin, j’ai étudié le propionate de fluticasone dans le modèle d’exacerbation asthmatique. Nous avons montré que l’effet de la fluticasone est différent entre les cellules épithéliales bronchiques issues de témoins et celles issues d’asthme sévère. Le modèle de stimulation viro-induite a permis d’étudier l’effet des corticoïdes inhalés sur l’épithélium bronchique et va permettre d’étudier les voies mécanistiques en jeu dans les exacerbations viro-induites, de tester d’autres molécules et proposer d’autres pistes thérapeutiques. / Severe childhood asthma is a chronic respiratory disease difficult to control despite treatment. Bronchial epithelium, at the interface between the body and the environment, is a central pivot in the asthmatic disease. The aim of this study was to examine the bronchial epithelium of severe asthmatic children. Initially, I developed a bronchial epithelium in vitro reproduction model obtained from bronchial epithelial cells from bronchial biopsies of severe asthmatic children. I compared these epithelia obtained in children with those obtained in adults. We specifically studied an important inflammatory marker in severe asthma,TSLP. I have highlighted the presence of two isoforms of TSLP which have an opposite role, anti-inflammatory for the short form and the long form for proinflammatory.Secondly, I developed an asthma exacerbation model of virus-induced. I used the culture model and challenged bronchial cells with poly I:C to. Different cytokines secreted upon viral asthma exacerbation were found increased in our model: CXCL8, CXCL 10, CCL2, RANTES and CXCL9.Finally, I have studied fluticasone propionate in the exacerbation asthmatic model. I studied cells from asthmatic and from non asthmatic children. Interestingly, we have shown that the effect of fluticasone is different between bronchial epithelial cells from non asthmatic children and those from severe asthma.The model of virus-induced stimulation was used to study the effect of inhaled corticosteroids on bronchial epithelium and will allow studying the mechanistic pathways involved in virus-induced exacerbations, testing other molecules and propose other therapeutic approaches.

Dans la mucoviscidose (CF), Pseudomonas aeruginosa colonise les voies respiratoires, conduisant à une inflammation chronique de l’épithélium bronchique. Une analyse transcriptomique antérieure nous a permis d’identifier CHAC1 comme un gène différentiellement exprimé entre les cellules épithéliales bronchiques primaires de patients CF et non-CF, au niveau basal et au cours de l’infection à P. aeruginosa. CHAC1 est une protéine dégradant le glutathion et associée au stress du réticulum endoplasmique et à l’apoptose. L’objectif principal de ce travail était de comprendre la contribution de CHAC1, en particulier dans la réponse inflammatoire et l’apoptose des cellules épithéliales pulmonaires. Nous avons donc, dans un premier temps, confirmé que CHAC1 est surexprimé au niveau ARNm dans les cellules épithéliales bronchiques primaires non-CF par rapport aux cellules CF. Nous avons observé que P. aeruginosa et deux de ses facteurs de virulence, le LPS et la flagelline, induisent l’expression de CHAC1 dans les cellules non-CF. L’expression de CHAC1 induite par le LPS est indépendante de PERK mais implique ATF4. De plus, nous avons observé qu’une réduction de l’expression de CHAC1 est associée, après stimulation par du LPS et de la flagelline, à une modulation des marqueurs inflammatoires notamment l’IL-8, l’IL-6, CCL2 et PGE2. Enfin, nous avons montré que P. aeruginosa n’est pas capable d’induire de l’apoptose dans la lignée de cellules épithéliales bronchiques NCI-H292. Ces résultats suggèrent que la régulation de l’expression de CHAC1 dans les cellules CF pourrait contribuer à la réponse inflammatoire excessive et chronique observée chez les patients atteints de mucoviscidose. / In cystic fibrosis (CF), Pseudomonas aeruginosa colonizes the airways, leading to chronic inflammation of the bronchial epithelium. A previous transcriptomic analysis allowed us to identify CHAC1 as a gene differentially expressed between primary bronchial epithelial cells of CF and non-CF patients at the basal level and during P. aeruginosa infection. CHAC1 is a glutathione-degrading protein associated with endoplasmic reticulum stress and apoptosis. The main objective of this work was to understand the contribution of CHAC1, particularly in the inflammatory response and apoptosis of pulmonary epithelial cells. We therefore first confirmed that CHAC1 is overexpressed at the mRNA level in non-CF primary bronchial epithelial cells relative to CF cells. We observed that P. aeruginosa and two of its virulence factors, LPS and flagellin, induce CHAC1 expression in non-CF cells. The expression of CHAC1 induced by LPS is independent of PERK but involves ATF4. Moreover, we have observed that a reduction in the expression of CHAC1 is associated, after stimulation by LPS and flagellin, with a modulation of the inflammatory markers, in particular IL-8, IL-6, CCL2 and PGE2. Finally, we have shown that P. aeruginosa is not capable of inducing apoptosis in the NCI-H292 bronchial epithelial cell line. These results suggest that CHAC1 is involved in the regulation of bronchial cell inflammation during P. aeruginosa infection and the regulation of CHAC1 expression in CF cells may contribute to the observed excessive and chronic inflammatory response in patients with cystic fibrosis.