Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-06-14T12:31:47Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Raquel Gontijo.pdf: 2958488 bytes, checksum: 8dbc875d07ab2eefcee30117ac6d2fbf (MD5) / Made available in DSpace on 2013-06-14T12:31:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Raquel Gontijo.pdf: 2958488 bytes, checksum: 8dbc875d07ab2eefcee30117ac6d2fbf (MD5) Previous issue date: 2013 / Infecções causadas por Leishmania (Viannia) braziliensisapresentam manifestações clínicas diversas e a leishmaniose cutânea localizada (LCL) é a forma clínica mais comum. Na Terra Indígena Xakriabá, localizada no norte de Minas Gerais, 212 casos autóctones de LCL foram registrados no período de 2001 a 2007. O grande número de casos e as particularidades da área reforçam o interesse de investigar aspectos da resposta imune do hospedeiro em relação à infecção.O óxido nítrico (NO) é um potente agente citotóxico presente na resposta imune anti-Leishmania. Na LCL, um dos mecanismos de produção de NO envolve a ligação de IgE ao receptor CD23 de macrófagos num microambiente de citocinas IFN-γou IL-4. Apesar do papel crucial do NO no curso da infecção, tem sido relatada a existência de isolados de L. (V.) braziliensis resistentes à ação dessa molécula. Assim, os objetivos do presente trabalho foram avaliar por citometria de fluxo, o perfil de expressão do marcador de ativação CD23 e de produção de NO intracelular por monócitose o perfil de expressão das citocinas IFN-γe IL-4 por linfócitos T do sangue periférico de indivíduos não infectados (NI, n=10), Teste de Montenegro positivosem lesão (TM +, n=13) e portadores de leishmaniose cutânea localizada (LCL,n=17), considerando o tempo de evolução da lesão (LCL<60 dias, n=7; LCL>60 dias, n=10). Foi feita também a dosagem dos níveis séricos de IgE dos indivíduos participantes. Além disso, investigou-se a possível presença de L. (V.) braziliensis resistentes/susceptíveis ao NO em isolados de pacientes responsivos (C, n=5) e refratários ao tratamento (FT, n=5) com Glucantime®. Para o estudo imunológico foram realizadas culturas de leucócitos do sangue periférico na ausência (CC) ou presença de formas promastigotas vivas de L. (V.) braziliensis (LEISH) ou na presença de antígeno solúvel de L. (V.) braziliensis. A dosagem dos níveis séricos de IgE foi feita utilizando-se kit específico baseado na técnica ELISA sanduíche. Para identificação do perfil de resistência dos isolados foram feitos ensaios de viabilidade utilizando-se a técnica do MTT. Os resultados obtidos com o estudo imunológico mostram que o grupo LCL apresentou maior expressão de CD23 e maior produção de NO por monócitos em relação aosgrupos TM + e NI, além de menor expressão de IFN-γe IL-4 por linfócitos T CD4+ em relação ao grupo TM +. Por outro lado, o grupo TM + apresentou aumento relevante no percentual de altoprodutores das citocinas avaliadas, NO e CD23 quando comparadoao grupo NI. Ao dividirmos o grupo LCL por tempo de lesão, observamos no grupo LCL<60 grande frequência de alto produtores de IL-4, NO e CD23, indicando um perfil misto de ativação/modulação da imunidade inata. Os níveis séricos de IgE total foram menores no grupo LCL quando comparado aos grupos NI e TM + , havendo redução do grupo TM + em relação ao grupo NI. Além disso, dos 10 isolados testados, 8 foram resistentes à ação do NO, sendo que, os 2 sensíveis foram provenientes de indivíduos responsivos ao tratamento com Glucantime®. Diante disso, foi possível inferir queo utras fontes celulares, além dos linfócitos T, podem estar envolvidas na produção de citocinas no grupo LCL e que no grupo TM + há forte indício da participação do mecanismo de ativação de monócitos e indução de NO investigado neste estudo, favorecendoo controle da infecção, impedindo assim, o aparecimento de lesões. Além disso, a existência de isolados de L. (V.) braziliensis resistentes à ação do NO corrobora com achados de outros autores e pode estar diretamente relacionada com a resistência à ação do Glucantime®. / Infections caused by Leishmania (Viannia) braziliensis presents many clinical manifestations and localized cutaneous leishmaniasis (LCL) is the most common clinical form. At the Xakriabá Indigenous Land, located in the northern Minas Gerais, 212 autochtone cases of LCL was reported during theperiod of 2001 to 2007. The elevated number of cases and particularities of thearea reinforces the interest to investigate aspects of the host immune response in relation with infection. Nitric oxide (NO) it’s a potent cytotoxical agent present in theanti-Leishmania immune response. In LCL, one of many mechanisms of NO production involves the IgE bind to the macrophages CD23 receptor in a cytokines IFN-γor IL-4 microenvironment. Despite the crucial role of NO in the infection course, hasbeen related the existence of Leishmania (Viannia) braziliensis isolates resistant to NO action. Thus, the aims of this study was evaluate, by flow cytometry, the expression profile of CD23 activation marker and NO production by monocytes, and the expression profile of cytokines IFN-γ and IL-4 by T lymphocytes subpopulations of peripheral blood of noninfected individuals (NI, n=10), Positive Montenegro Skin Test without lesion (TM+, n=13) and patients with Localized Cutaneous Leishmaniasis (LCL, n=17), considering the evolution time of the lesion (LCL<60 days, n=7; LCL>60 days, n=10). Was made too, the seric IgE levels dosage in the participants. Besides this, was investigated the possible presence of the resistant/susceptible L. (V.) braziliensis isolates from responsive (C, n=5) and refractory (FT, n=5) patients to treatment with Glucantime®. For the immunological study, was realized leucocytes cultures of peripheral blood in the absence (CC) or presence of live L. (V.) braziliensis promastigotes/L. (V.) braziliensis soluble antigen (LEISH). The dosage of seric IgE levels was made using a specific kit based on sandwich ELISA technique. For the resistant/susceptible profile investigation, viability assays was made using the MTT technique. The obtained results with immunological study show that the LCL group present higher CD23 expression and higher NO production by monocytes in relation with TM + e NI groups, besides lower expression of IFN-γe IL-4 by CD4+ T lymphocytes when compared to TM + group. On the other side, TM + group presents relevant increase in the percentage of higher producers of evaluated cytokines, NO and CD23 when compared with NI group. Dividing LCL group for lesion evolution time, was observed in LCL<60 increase frequency of higher producers of IL-4, NO and CD23,indicating a mixed profile of activation/modulation of the innate immunity. The total IgE seric levels was lower in the LCL group when compared to the NI and TM + groups, with a reduction of TM + in relation with NI group. Besides this, of 10 isolates tested, 8 was resistant to NO action and the 2 sensible was obtained from individuals that was responsible to the treatment with Glucantime®. In front this, was possible to infer that other cellular sources, besides T lymphocytes, could be involved in the cytokine production in LCL group and in the TM + group there is a strong possibility for the participation of monocytes activation and induction mechanism and NO induction investigated in this study, favoring the infection control, preventing the occurrence of skin lesions.Besides this, the existence of NO resistant L. (V.) braziliensis isolates, corroborates with other authors findings and could be directly related with Glucantime® treatment resistance.