Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2016-06-29T12:56:33Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_IzabellaBatista_CPqRR2015 pdf.pdf: 11084546 bytes, checksum: 8c38bfafc90f14023e6dd82b69adc985 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2016-06-29T12:56:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_IzabellaBatista_CPqRR2015 pdf.pdf: 11084546 bytes, checksum: 8c38bfafc90f14023e6dd82b69adc985 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-29T12:56:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_IzabellaBatista_CPqRR2015 pdf.pdf: 11084546 bytes, checksum: 8c38bfafc90f14023e6dd82b69adc985 (MD5) Previous issue date: 2016 / Made available in DSpace on 2016-07-22T13:24:52Z (GMT). No. of bitstreams: 3 Dissertacao_BCM_IzabellaBatista_CPqRR2015 pdf.pdf.txt: 157030 bytes, checksum: c1e93a8d2c64e66d80837be88c555677 (MD5) Dissertacao_BCM_IzabellaBatista_CPqRR2015 pdf.pdf: 11084546 bytes, checksum: 8c38bfafc90f14023e6dd82b69adc985 (MD5) license.txt: 2991 bytes, checksum: 5a560609d32a3863062d77ff32785d58 (MD5) Previous issue date: 2016 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / A dengue é uma doença viral transmitida de mosquitos para humanos sendo a arbovirose mais prevalente em países tropicais e subtropicais, atingindo milhões de pessoas em diferentes regiões do mundo. A dengue é causada pelo Dengue vírus (DENV), membro da família Flaviviridae, que possuem 4 sorotipos geneticamente distintos conhecidos como DENV 1-4. Uma vacina eficiente necessita de gerar resposta imune tetravalente balanceada. Para alcançarmos essa imunidade tetravalente balanceada,trabalhamos com a hipótese de que proteínas quimérica s expressando epítopos imunogênicos dos quatro sorotipos do DENV possam ser utilizadas no desenvolvimento de uma vacina segura e/ou um sistema de diagnóstico eficiente. Para este estudo onze proteínas quiméricas foram desenhadas contendo regiões de proteínas com potencial imunogênico derivado do envelope, capsídeo, membrana e/ou da proteína não estrutural NS1, dos quatro sorotipos do DENV. Tais regiões foram selecionadas in silico utilizando- se o algoritmo BepiPred. Regiões com alta homologia entre os quatro sorotipos do DENV foram preferencialmente incluídas, mas regiões antigênicas de um ou mais sorotipos do DENV também foram utilizados. As proteínas quiméricas foram construídas pela adição de resíduos de aminoácidos entre as sequências selecionadas, chamados de espaçadores, para que a estrutura dos epítopos expressos fosse mantida. A sequência final de aminoácidos foi traduzida e a sequência de nucleotídeos foi otimizada utilizando o algoritmo LETO 1.0 (Entelechon). Todas as onze proteínas quiméricas foram produzidas utilizando os vetores de expressão pET 28 TEV, pQE-9 ou pET-21ª, transformados em E. coli BL21 ou M15 e foram purificadas por cromatografia de afinidade utilizando resina de níquel para realização de ensaios de Western blot e ELISA para testar a reatividade das proteínas com soros de indivíduos já infectados pelo DENV e indivíduos nunca infectados e testes de imunogenicidade através da imunização de camundongos das linhagens BALB/c e C57BL/6. Nossos resultados mostraram um reconhecimento específico de cinco proteínas quiméricas com soros de pacientes sabidamente infectados pelo DENV-1, DENV-2 ou DENV-3. Além disso, a imunização de camundongos com a proteína quimérica EnvEpII, mostrou que esta proteína foi capaz de estimular uma produção robusta de anticorpos IgG1, IgG2a e IgG2c nas duas linhagens de camundongos testadas e de anticorpos neutralizantes em C57BL/6. Além disso, foi observada a ativação de células T CD4+ e CD8+ em BALB/c e o aumento dos níveis das citocinas IL-2, IL-4, IL-17 e IFNγ, quando camundongos foram imunizados com a proteína EnvEpII. Nossos resultados demonstram que desenhar, sintetizar, expressar e purificar proteínas quiméricas em sistemas bacterianos é viável e, dessa forma, proteínas artificiais podem ser estudadas como candidatas para o desenvolvimento de vacinas e/ou sistemas de diagnóstico contra doenças infecciosas / Dengue is the most common mosquito-borne viral disease of humans and the most prevalent arbovirus in tropical and subtropical countries, infecting thousands individuals annually in different regions of the world. Dengue is caused by Dengue virus (DENV), members of the Flaviviridae familyand is composed by 4 genetically distinct serotypes referred to as DENV 1–4. A safe vaccine demands a balanced tetravalent immune response. To address the balanced immune response, we hypothesized that chimeric proteins with potential immunogenic epitopes from the four DENV serotypes can be used to develop a safe dengue vaccine and/or an efficient diagnostic system. We designed eleven chimeras, for this the most potentially immunogenic regions of proteins derived from envelope, capsid, membrane and/or non-structural protein 1, NS1, from all DENV serotypes were in silico selected using the BepiPred algorithm. High homology regions among the four DENV serotypes were preferentially included, but antigenic regions from single or pairs of DENV serotypes were also used. The chimeras were constructed by adding non immunogenic amino acid residues between the selected sequences, named spacers residues, thus the expressed epitopes structure was maintained. The final chimeric amino acid sequence was back translated and the nucleotide sequence was optimized using the LETO 1.0 algorithm (Entelechon). All the eleven chimeric proteins were produced using the expression vectors pET 28 TEV, pQE-9 and pET-21a, transformed in E. coli BL21 or M15, and purified by Nickel-affinity chromatography to perform the Western blot and ELISA assays to test their reactivity with sera of DENV-infected patients and DENV-negative sera and to test their immunogenicity through the immunization of mice strains BALB/c and C57BL/6. Our results showed a specific recognition of five proteins by sera DENV-1, DENV-2 or DENV-3 infected patients. Moreover, the immunization using the chimera EnvEpII, shows that this protein are able to stimulate a robust production of antibodies IgG1, IgG2a and IgG2c in both mice strains tested and neutralizing antibodies were produced in C57BL/6. We also noted the activation of T cells CD4+ and CD8 + in BALB/c and the production of IL-2, IL-4, IL-17 and IFNγ when we immunized the mice with EnvEpII. Our results indicating that design, synthesize, express and purify artificial proteins in bacterial systems is viable and, thus, these proteins can be studied as candidates for the development of vaccines and/or diagnostic systems against infectious diseases.