Abbrevations t – fluorescence lifetime j – rotational correlational time ([Ru(bpy)2(phen-ITC)]2+) – Bis-(bipyridine)-5-(isotiocyanatophenantrolin)-Ru(PF6-)2 Ab – antibody AF – Alexa Fluor 660 AF-hGH – with Alexa Fluor 660 labelled human growth hormone FITC – fluorescein isothiocyanate FITC-Ab – FITC labelled antibody FP – fluorescence polarization FRET – fluorescence resonance energy transfer hGH – human growth hormone PMI – N-(3-pyrene)maleimide PMI-hGH – human growth hormone labelled N-(3-pyrene)maleimide PVPPB – poly(N-vinyl-2-pyrolidone) with phenylboronic acid copolymer r – anisotropy RITC – rodamine B isothiocyanate RITC-hGH – with RITC labeled human growth hormone SDS-PAGE – sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis INTRODUCTION Relevance of the study. Human growth hormone (hGH) is a heterogeneous protein with several molecular forms (isoforms). Human growth hormone measurements are complicated because of the heterogeneous nature of hGH. Specific assays for each isoform are currently unavailable. Because the different antibodies used in immunoassays bind to a different spectrum of hGH isoforms, hGH concentrations measured by immunoassay are likely to depend on the particular antibody used. Moreover, because the distribution of the different hGH isoforms varies among individuals, the results from different immunoassays cannot be interrelated easily by using a single conversion factor. Fluorescence is by far the most important optical... [to full text]

Šioje daktaro disertacijoje buvo nagrinėjami paviršiaus plazmonų rezonanso (PPR) ir elektrocheminiai imuniniai jutikliai žmogaus augimo hormonui (ŽAH) ir antikūnams prieš žmogaus augimo hormoną (anti-ŽAH) nustatyti bei pritaikyti juos realių mėginių analizei. Šiame darbe buvo nagrinėjami nekryptingas ir kryptingas antikūnų imobilizavimo būdai PPR jutiklio lusto paviršiuje ir tirtas antikūno-antigeno komplekso formavimasis. Buvo nustatyta, kad tinkamiausias iš tirtų anti-ŽAH imobilizavimo PPR jutiklio lusto paviršiuje būdų yra kryptingas anti-ŽAH fragmentų gautų redukuojant anti-ŽAH 2-merkatoetilaminu (2-MEA) imobilizavimas. Atominės jėgos mikroskopijos pagalba buvo stebėti įvairiais būdais modifikuotų PPR jutiklio lusto paviršių skirtumai, kurie parodė, ar fragmentai gauti redukuojant anti-ŽAH buvo tinkamai prijungti prie auksinio PPR jutiklio lusto paviršiaus, o imuninis kompleksas susiformavo dėl specifinės antikūno-antigeno sąveikos. PPR ŽAH imuninis jutiklis pasižymi maža aptikimo riba (3,4 nmol/L), stabilumu, atrankamu. Aktyvus PPR jutiklio lusto paviršius visiškai regeneruojamas, o tai leidžia imuninio jutiklio daugkartinį panaudojimą. Tiesioginio ir netiesioginio tipo PPR anti-ŽAH imuniniai jutikliai buvo tiriami kombinuojant du analizinius metodus – PPR ir elektrocheminius (impulsinė amperometrija (PA) ir ciklinė voltamperometrija (CV)). Anti-ŽAH imuniniai jutikliai pasižymi maža aptikimo riba (0,056, 0,051 ir 0,027 nmol/L, atitinkamai CV, PPR ir PA), stabilumu... [toliau žr. visą tekstą] / In this doctoral thesis the development of surface plasmon resonance (SPR) and electrochemical (EL) immunosensors has been examined and used for the detection of human growth hormone (HGH) and antibodies against human growth hormone (anti-HGH). The designed immunosensors were applied for the real sample analysis. In this research work random and oriented techniques of anti-HGH immobilization on the SPR sensor chip were compared and the interaction between immobilized anti-HGH and HGH was evaluated. Fragments of anti-HGH immobilization via their native thiol-groups directly coupled to the SPR chip is the most suitable technique for the development of an SPR immunosensor for the HGH detection. Fragments of antibody were obtained by chemical reduction of 2-mercaptoethylamine (2-MEA). In our study atomic force microscopy has been successfully applied for the imaging of the the differently modified surfaces. The achieved results indicate how much adequately the fragments of anti-HGH molecules bound onto the gold substrate and how immune complexes were formed. SPR HGH immunosensor is suitable for HGH detection with a limit of detection (3.4 nmol/L), good stability and selectivity. Furthermore, active SPR-chip surface is fully regenerated that allows multiply usage of designed immunosensor. Direct and indirect anti-HGH immunosensor was studied by combining two analytical methods – SPR and EL (pulsedamperometry (PA) and cyclic voltammetry (CV)). The limit of detection values of... [to full text]

Šioje daktaro disertacijoje buvo nagrinėjami paviršiaus plazmonų rezonanso (PPR) ir elektrocheminiai imuniniai jutikliai žmogaus augimo hormonui (ŽAH) ir antikūnams prieš žmogaus augimo hormoną (anti-ŽAH) nustatyti bei pritaikyti juos realių mėginių analizei. Šiame darbe buvo nagrinėjami nekryptingas ir kryptingas antikūnų imobilizavimo būdai PPR jutiklio lusto paviršiuje ir tirtas antikūno-antigeno komplekso formavimasis. Buvo nustatyta, kad tinkamiausias iš tirtų anti-ŽAH imobilizavimo PPR jutiklio lusto paviršiuje būdų yra kryptingas anti-ŽAH fragmentų gautų redukuojant anti-ŽAH 2-merkatoetilaminu (2-MEA) imobilizavimas. Atominės jėgos mikroskopijos pagalba buvo stebėti įvairiais būdais modifikuotų PPR jutiklio lusto paviršių skirtumai, kurie parodė, ar fragmentai gauti redukuojant anti-ŽAH buvo tinkamai prijungti prie auksinio PPR jutiklio lusto paviršiaus, o imuninis kompleksas susiformavo dėl specifinės antikūno-antigeno sąveikos. PPR ŽAH imuninis jutiklis pasižymi maža aptikimo riba (3,4 nmol/L), stabilumu, atrankamu. Aktyvus PPR jutiklio lusto paviršius visiškai regeneruojamas, o tai leidžia imuninio jutiklio daugkartinį panaudojimą. Tiesioginio ir netiesioginio tipo PPR anti-ŽAH imuniniai jutikliai buvo tiriami kombinuojant du analizinius metodus – PPR ir elektrocheminius (impulsinė amperometrija (PA) ir ciklinė voltamperometrija (CV)). Anti-ŽAH imuniniai jutikliai pasižymi maža aptikimo riba (0,056, 0,051 ir 0,027 nmol/L, atitinkamai CV, PPR ir PA), stabilumu... [toliau žr. visą tekstą] / In this doctoral thesis the development of surface plasmon resonance (SPR) and electrochemical (EL) immunosensors has been examined and used for the detection of human growth hormone (HGH) and antibodies against human growth hormone (anti-HGH). The designed immunosensors were applied for the real sample analysis. In this research work random and oriented techniques of anti-HGH immobilization on the SPR sensor chip were compared and the interaction between immobilized anti-HGH and HGH was evaluated. Fragments of anti-HGH immobilization via their native thiol-groups directly coupled to the SPR chip is the most suitable technique for the development of an SPR immunosensor for the HGH detection. Fragments of antibody were obtained by chemical reduction of 2-mercaptoethylamine (2-MEA). In our study atomic force microscopy has been successfully applied for the imaging of the the differently modified surfaces. The achieved results indicate how much adequately the fragments of anti-HGH molecules bound onto the gold substrate and how immune complexes were formed. SPR HGH immunosensor is suitable for HGH detection with a limit of detection (3.4 nmol/L), good stability and selectivity. Furthermore, active SPR-chip surface is fully regenerated that allows multiply usage of designed immunosensor. Direct and indirect anti-HGH immunosensor was studied by combining two analytical methods – SPR and EL (pulsedamperometry (PA) and cyclic voltammetry (CV)). The limit of detection values of... [to full text]