Οι υδατάνθρακες αποτελούν βασικά δομικά στοιχεία των κυτταροπλασματικών μεμβρανών, ως συστατικά των μορίων γλυκοπρωτεϊνών, γλυκοζαμινογλυκανών ή γλυκολιπιδίων. Είναι πλέον γνωστό ότι οι υδατάνθρακες δεν αποτελούν απλά ενεργειακά αποθέματα αλλά μόρια υψίστης λειτουργικής σημασίας, τα οποία δρουν ρυθμιστικά στον πολλαπλασιασμό και την διαφοροποίηση των κυττάρων και συμμετέχουν σε διεργασίες όπως η κυτταρική αναγνώριση και προσκόλληση, η λειτουργία υποδοχέα, η λήψη και η μεταγωγή μηνυμάτων, ο καθορισμός της αντιγονικότητας, η αντιπρωτεολυτική και ανοσοδυναμική δράση κ.α. Οι λεκτίνες είναι πρωτεΐνικά ή γλυκοπρωτεΐνικά μόρια φυτικής ή ζωικής προελεύσεως, τα οποία έχουν την ιδιότητα της ειδικής και αναστρέψιμης συνδέσεως με υδατανθρακικές ομάδες της κυτταρικής επιφάνειας, της διάμεσης θεμέλιας ουσίας ή ελεύθερων γλυκολιπιδίων και γλυκοπρωτεϊνών, την χημική σύσταση των οποίων δεν αλλοιώνουν. Η χρήση ειδικά σεσημασμένων λεκτινών στα πλαίσια ιστοχημείας, ανοσοϊστοχημείας, ηλεκτρονικής μικροσκοπίας, ραδιοαπεικονιστικών και άλλων μεθόδων, προσφέρει ένα θαυμάσιο εργαλείο για τη μελέτη και κατευθυνόμενη τροποποίηση της μεμβρανικής υδατανθρακικής συστάσεως. Παρά τα σημαντικά βήματα προόδου στην μοριακή ανατομία κατά τα τελευταία έτη, οι γνώσεις μας για τη μορφογένεση του ανθρώπινου δέρματος είναι σχετικά περιορισμένες. Η ιδιαίτερα σημαντική για την διαφοροποίηση αλλά και για την μορφογένεση, υδατανθρακική σύσταση των κυτταροπλασματικών μεμβρανών της ανθρώπινης εμβρυϊκής επιδερμίδας, οι μεταβολές της αναλόγως του εξελικτικού σταδίου και οι διαφορές της σε σχέση με την επιδερμίδα του ενηλίκου, είναι ελάχιστα μελετημένες. Οι σχετικές εργασίες που ανευρίσκονται στη διεθνή βιβλιογραφία είναι ελάχιστες σε αριθμό και αποσπασματικές (περιορισμένο υλικό, στενό φάσμα εξεταζόμενων ηλικιών), ενώ τα αποτελέσματα τους είναι σε πολλές περιπτώσεις αντιφατικά. Για τους λόγους αυτούς ο σκοπός της παρούσης εργασίας ήταν η διερεύνηση σε μεγάλο δείγμα και ευρύ ηλικιακό φάσμα της υδατανθρακικής συστάσεως των κυτταροπλασματικών μεμβρανών κατά τη μορφογένεση της ανθρώπινης επιδερμίδας, με τη χρήση έξι διαφορετικών βιοτινυλιωμένων λεκτινών (PNA, DBA, WGA, RCA, ConA και UEA), η αντιπαραβολή των ευρημάτων με τα αντίστοιχα της διεθνούς βιβλιογραφίας και με εκείνα της υγιούς επιδερμίδας του ενηλίκου και τέλος η διερεύνηση του ενδεχομένου μελλοντικής αξιοποιήσεως των ευρημάτων της μελέτης στα πλαίσια διαγνωστικών ή θεραπευτικών εφαρμογών. Το υλικό της παρούσης εργασίας αποτελείτο από 152 συνολικά βιοψίες δέρματος κνήμης, ηλικίας 10 έως 23 εβδομάδων EGA. Ο καθορισμός της ηλικίας, η επεξεργασία των βιοψιών και η χρώση με λεκτίνες έγιναν σύμφωνα με καθιερωμένες μεθόδους που περιγράφονται στο αντίστοιχο κεφάλαιο. Κατά τη χρώση με τη λεκτίνη ΡΝΑ διαπιστώθηκε στο περιδέρμιο και στην ενδιάμεση στιβάδα συνεχής παρουσία της D-γαλακτοζο-β-(1,3)- Ν-ακετυλο-D-γαλακτοζαμίνης από την 10η μέχρι και την 20η εβδομάδα. Η βασική στιβάδα ήταν αρνητική σε όλα τα παρασκευάσματα από την 10η έως την 20η εβδομάδα, ενώ παρουσία της D-γαλακτοζο-β-(1,3)-Ν- ακετυλο-D-γαλακτοζαμίνης στην βασική μεμβράνη διαπιστώθηκε από την 10η έως και την 13η εβδομάδα. Στα παρασκευάσματα της 23η εβδομάδας η κεράτινη στιβάδα, η βασική στιβάδα και η βασική μεμβράνη ήταν αρνητικές στην ΡΝΑ, ενώ οι κυτταροπλασματικές μεμβράνες των κυττάρων τόσο της κοκκώδους όσο και της ακανθωτής στιβάδας παρουσίαζαν μετρίας εντάσεως θετική χρώση. Η υδατανθρακική σύσταση των κυτταροπλασματικών μεμβρανών στην εμβρυϊκή επιδερμίδα ηλικίας 23ων εβδομάδων και στην επιδερμίδα των ενηλίκων είναι ταυτόσημη. Η RCA έδωσε θετική αντίδραση κυμαινόμενης εντάσεως στο περιδέρμιο και στην ενδιάμεση στιβάδα σε όλα τα παρασκευάσματα από την 10η έως και την 20η εβδομάδα, γεγονός το οποίο υποδηλώνει μεμβρανική παρουσία της β-D-γαλακτόζης. Η β-D-γαλακτόζη ήταν παρούσα σε χαμηλή συγκέντρωση στις κυτταροπλασματικές μεμβράνες των κυττάρων της βασικής στιβάδας μεταξύ 10ης-12ης και 18ης-20ης εβδομάδας, ενώ αντιθέτως δεν ανιχνεύθηκε από την 13η έως την 17η εβδομάδα. Στην βασική μεμβράνη παρουσία της διαπιστώθηκε έως την 15η εβδομάδα. Στην εμβρυϊκή επιδερμίδα της 23ης εβδομάδας η β-D- γαλακτόζη απουσιάζει μόνο στην κεράτινη στιβάδα και στη βασική μεμβράνη, ενώ η συγκέντρωσή της αυξάνει στις μεμβράνες των κυττάρων από την βασική προς την ενδιάμεση στιβάδα. Όσον αφορά και την RCA η χρώση της εμβρυϊκής επιδερμίδος κατά την 23η εβδομάδα αντιστοιχεί σε γενικές γραμμές με εκείνη της επιδερμίδας των ενηλίκων. Το περιδέρμιο ήταν θετικό για την DBA από την 10η έως και την 20η εβδομάδα, εύρημα το οποίο υποδηλώνει παρουσία της α-D-N- ακετυλο-D-γαλακτοζαμίνης στις κυτταροπλασματικές μεμβράνες των κυττάρων του από την 10η εβδομάδα μέχρι και την απόπτωσή του. Ο υδατάνθρακας αυτός απουσίαζε όμως πλήρως στις μεμβράνες των κυττάρων τόσο της ενδιάμεσης όσο και της βασικής στιβάδας από την 10η έως και την 20η εβδομάδα. Η α-D-N-ακετυλο-D-γαλακτοζαμίνη ανιχνευόταν στη βασική μεμβράνη μόνον μεταξύ της 10ης και της 12ης εβδομάδας. Στην εμβρυϊκή επιδερμίδα ηλικίας 23ων εβδομάδων ο υδατάνθρακας αυτός απουσίαζε παντελώς στη βασική μεμβράνη και σε όλες τις στιβάδες πλην της βασικής, στην οποία ανιχνευόταν σε ποσοστό 40% των παρασκευασμάτων και μόνον εστιακά. Το παρατηρούμενο πρότυπο γλυκοζυλιώσεως στην 23η εβδομάδα όσον αφορά την α-D-N- ακετυλο-D-γαλακτοζαμίνη, είναι ταυτόσημο με εκείνο που παρατηρείται στην επιδερμίδα των ενηλίκων. Σύμφωνα με πρόσφατα βιβλιογραφικά δεδομένα πιθανολογείται πως τα DBA-θετικά κύτταρα της βασικής στιβάδας αποτελούν πρώιμα μεταμιτωτικά διαφοροποιούμενα κύτταρα. Για την μετακίνηση των κυττάρων αυτών προς τις υπερβασικές στιβάδες είναι απαραίτητη η απώλεια των β1-ιντεγκρινών από την κυτταρική επιφάνεια, φαινόμενο που σχετίζεται με την διακοπή της γλυκοζυλιώσεως της β1 ιντεγκρινικής υπομονάδας και τη συσσώρευσή της στο σύστημα Golgi. Η παρουσία της α-D-N-ακετυλο-D- γαλακτοζαμίνης θα μπορούσε να αντιπροσωπεύει σήμα αναστολής της κινήσεως της β1-ιντεγκρίνης προς την κυτταρική επιφάνεια. Η χρώση της εμβρυϊκής επιδερμίδας με ConA στο περιδέρμιο και την ενδιάμεση στιβάδα ήταν θετική μεταξύ 10ης και 20ης εβδομάδος, με συνεχείς διακυμάνσεις της εντάσεως (και κατά συνέπεια της συγκεντρώσεως της α-D-μανόζης και της α-D-γλυκόζης). Στην βασική στιβάδα η ConA ήταν θετική έως και την 12η εβδομάδα, ενώ στην βασική μεμβράνη ήταν θετική έως την και την 14η εβδομάδα. Η παρουσία της α- D-μανόζης και της α-D-γλυκόζης στην βασική στιβάδα σε πρώιμα στάδια της μορφογενέσεως φαίνεται να αποτελεί διαφορά μεταξύ της εμβρυϊκής επιδερμίδας και άλλων εμβρυϊκών επιθηλίων και υποδηλώνει κάποιο ειδικό ρόλο του υδατάνθρακος αυτού κατά το κρίσιμο στάδιο της επιδερμιδικής διαφοροποιήσεως. Στην εμβρυϊκή επιδερμίδα κατά την 23η εβδομάδα η α-D-μανόζη και η α-D-γλυκόζη ανιχνεύονται μόνο στις κυτταροπλασματικές μεμβράνες των κυττάρων της κοκκώδους και της ακανθωτής στιβάδας. Η απουσία τους από τη βασική στιβάδα της εμβρυϊκής επιδερμίδας στις 23 εβδομάδες αποτελεί και τη μοναδική διαφορά της τελευταίας σε σύγκριση με την επιδερμίδα των ενηλίκων. Αν εξαιρέσει κανείς τη βασική στιβάδα της εμβρυϊκής επιδερμίδας (και τη βασική μεμβράνη) από τη 10η έως και την 20η εβδομάδα στην οποία η μεμβρανική χρώση με UEA ήταν αρνητική (άρα απουσίαζε η α- L-φουκόζη) στις υπόλοιπες επιδερμιδικές στιβάδες η ένταση της χρώσεως παρουσίαζε μεγάλες διακυμάνσεις. Στην εμβρυϊκή επιδερμίδα ηλικίας 23ων εβδομάδων θετική χρώση με UEA και επομένως και παρουσία α-L-φουκόζης υπήρχε μόνο στις κυτταροπλασματικές μεμβράνες των κυττάρων της κοκκώδους και της ακανθωτής στιβάδας, όπως ακριβώς συμβαίνει και στην επιδερμίδα του ενηλίκου. Η απουσία της α-L-φουκόζης στη βασική στιβάδα φαίνεται να αποτελεί σημαντική διαφορά μεταξύ της εμβρυϊκής επιδερμίδας και άλλων εμβρυϊκών επιθηλίων όπως π.χ. του αναπνευστικού. Αντιθέτως, η πρώιμη παρουσία της στις μεμβράνες των κυττάρων της ενδιάμεσης στιβάδας, υποδηλώνει σημαντικό ρόλο της κατά τα πρώτα στάδια της επιδερμιδικής διαφοροποιήσεως. Βασικό χαρακτηριστικό γνώρισμα της χρώσεως της εμβρυϊκής επιδερμίδας από την 10η έως και την 20η εβδομάδα με τη λεκτίνη WGA ήταν οι συνεχείς διακυμάνσεις της εντάσεώς της τόσο στο περιδέρμιο όσο και στην ενδιάμεση και στη βασική στιβάδα, ενώ στη βασική μεμβράνη μετά την 13η εβδομάδα η αντίδραση ήταν αρνητική. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν αντίστοιχες ποσοτικές μεταβολές της μεμβρανικής συγκεντρώσεως της β(1,4)-D-N-ακετυλο-D-γλυκοζαμίνης. Στα παρασκευάσματα της 23ης εβδομάδας αρνητική χρώση με WGA παρατηρήθηκε μόνο στην κεράτινη στιβάδα και στη βασική μεμβράνη, όπως ακριβώς και στην επιδερμίδα των ενηλίκων. Σε όλες τις περιπτώσεις μεταξύ 13ης και 15ης εβδομάδος η βασική μεμβράνη αρνητικοποιήθηκε για τους υδατάνθρακες D-γαλακτοζο-β- (1,3)-Ν-ακετυλο-D-γαλακτοζαμίνη, β-D-γαλακτόζη, α-D-N-ακετυλο-D- γαλακτοζαμίνη και α-D-μανόζη, α-D-γλυκόζη. Οι αλλαγές αυτές στην γλυκοζυλίωση συμπίπτουν χρονικά με την έναρξη του σταδίου της θυλακικής κερατινοποίησης και πιθανώς να σχετίζονται με την - απαραίτητη για τη μορφογένεση των τριχικών θυλάκων και άλλων δομών - σύνθετη αλληλεπίδραση επιδερμίδας-χορίου. Η ερμηνεία των παρατηρηθέντων μεταβολών της υδατανθρακικής σύστασης των κυτταροπλασματικών μεμβρανών κατά τη μορφογένεση της επιδερμίδας είναι επί του παρόντος δυσχερής, δεδομένου ότι οι μηχανισμοί συνθέσεως και μεταφοράς των υδατανθράκων στα επιδερμιδικά κύτταρα παραμένουν άγνωστοι. Η σύγκριση των ευρημάτων της παρούσης μελέτης με τις ολιγάριθμες και αποσπασματικές προγενέστερες σχετικές εργασίες, δείχνει ταύτηση σε πολλά σημεία αλλά και σημαντικές διαφορές. Για την ερμηνεία των διαφορών αυτών θα πρέπει να ληφθεί υπόψη ο πολύ μικρός αριθμός παρασκευασμάτων που χρησιμοποιήθηκε στις προγενέστερες εργασίες, ο συγκριτικά πολύ μεγάλος αριθμός παρασκευασμάτων που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη, οι διαφορές στις θέσεις λήψεως των βιοψιών του δέρματος μεταξύ των μελετών, αλλά και οι διαφορές στις τεχνικές που χρησιμοποιήθηκαν. Τα ευρήματα της παρούσης μελέτης, στην οποία αναλύεται για πρώτη φορά σε τέτοιο βαθμό πληρότητας (ηλικιακό φάσμα, αριθμός παρασκευασμάτων), η υδατανθρακική σύσταση των κυτταροπλασματικών μεμβρανών κατά την μορφογένεση, θα μπορούσαν να αξιοποιηθούν για τη διερεύνηση της παθογένειας δερματικών νοσημάτων, καθώς και για τη μελλοντική ανάπτυξη διαγνωστικών και θεραπευτικών εφαρμογών. / Carbohydrates are essential structure components of plasma cell membranes since they are constituents of the molecules of glycoproteins, glycosaminoglycans and glycolipids. It is known that carbohydrates do not simply represent energy sources but molecules of cardinal functional importance, which are involved in the regulatory mechanisms of the mitotic activity and differentiation of cells and participate in cell recognition and adhesion, signal transduction, receptor function, antigen formation and other key biochemical and immunological events. Lectins are proteins or glycoproteins of plant or animal origin, which are capable of specifically and reversibly binding to carbohydrate residues of the cell surface, intercellular matrix or free glycolipids and glycoproteins. Specifically labelled lectins represent a useful tool for the study and manipulation of carbohydrate composition of plasma cell membranes. Despite the recent significant progress in molecular anatomy, our knowledge and understanding of the mechanisms underlying the morphogenesis of human skin are limited. Particularly very little is known about the carbohydrate composition of plasma cell membranes of human embryonic epidermis, its alterations during epidermal morphogenesis and its differences, as compared to the adult epidermis. The number of studies dealing with this subject is small, the examined skin specimens are limited, the spectrum of the gestational age groups they originated from is narrow and the corresponding results mostly contradictory. We found it, therefore, of interest to : a) Investigate in the present study the carbohydrate composition of plasma cell membranes during morphogenesis of human epidermis, using six different biotinylated lectins (PNA, DBA, WGA, RCA, Con A and UEA) in a large number of specimens derived from different gestational age-groups. b) To comparatively evaluate our findings with the available data on embryonic and adult human epidermis and c) To search for possible diagnostic or therapeutic applications of our results. A total number of 152 tibial skin specimens (10-23 weeks EGA) were studied by lectin histochemistry. The positive reaction of periderm and intermediate layer (10th to the 20th week EGA) points towards a persistent occurrence of D-galactose-β-(1,3)-N-acetyl-D-galactosamine in the plasma cell membranes of these layers. The basal layer revealed negative reaction to PNA in all specimens (10th to 20th week EGA), whereas, basement membrane demonstrated positive staining in the specimens of the 10th to 13th week EGA. In the specimens of the 23th week EGA, the keratin and basal layer and the basement membrane showed no staining with PNA, whereas, the plasma cell membranes in the granular and spinous layers showed a moderately positive reaction. The identical-PNA binding pattern indicates the lack of any differences between the embryonic (23 weeks EGA) and adult epidermis with regard to D-galactose- β-(1,3)-N-acetyl-D-galactosamine plasma cell membrane composition. In all specimens of the 10th to 20th week EGA, periderm and intermediate layer showed a positive reaction to RCA of variable intensity. This finding indicates that β-D-galactose is an obligatory constituent of plasma cell membranes in embryonic epidermis. Low β-D-galactose concentrations were found in the plasma cell membranes of the basal layer in the specimens of the 10th to 12th and 18th to 20th week EGA, whereas, this carbohydrate was not detected in the specimens of 13th to 17th week EGA and in the basement membrane beyond the 15th week EGA. In the specimens of the 23th week it was absent in the keratin and basal layer, whereas its concentrations progressively increased from the basal to the spinous layers. The RCA-binding pattern of specimens of the 23th week EGA is very similar to that of the adult epidermis. Periderm showed positive reaction to DBA in the specimens of the 10th to 20th week EGA, indicating the occurrence of α-D-N-acetyl-D-galactosamine in the periderm until its apoptosis. However, this carbohydrate was completely absent in the plasma cell membranes of the keratinocytes in the intermediate and basal layers from the 10th to the 20th week EGA, but was detected in the basement membrane only in the specimens of the 10th to the 12th week EGA. In embryonic epidermis (23 weeks EGA) this carbohydrate was completely absent in the basement membrane and in all layers but the basal, in which it was focally detected in 40% of the specimens. Thus, the DBA-binding profile and concequently the pattern of α-D-N-acetyl-D-galactosamine distribution in the embryonic epidermis (23 weeks EGA) is identical to those of the adult epidermis. DBApositive keratinocytes of the basal layer are thought to represent early forms of post-mitotic differentiated keratinocytes. For the movement and translocation of these cells to the suprabasal layers the disappearance of β1-integrins from the cell surface is a prerequisite and related to the inhibition of β1-integrin subunit glycosylation and its accumulation in the Golgi apparatus. It is, therefore, possible that the presence of a-D-N acetyl-D-galactosamine could represent an inhibitory signal for β1- integrin translocation to the cell surface. Periderm and intermediate layer in the specimens of the 10th to the 20th week EGA positively reacted to Con A. The intensity of this reaction and concequently the concentration of α-D-glucose and α-D-mannose were variable. The plasma cell membranes of the basal layer stained with Con A only in the specimens of the 10th to 12th week EGA , whereas the basement membrane positively reacted only in the specimens of the 10th to 14th week EGA. It seems, therefore, that the occurrence of α-D-glucose and α-D-mannose in the keratinocyte membranes of the basal layer during the early stages of epidermal morphogenesis is a unique property of embryonic epidermis not shared by other embryonic epithelia that indicates a specific role of these carbohydrate residues in the critical initial stage of epidermal differentiation. In the embryonic epidermis, (23th week EGA), α-D-glucose and α-D-mannose were detected only in the plasma cell membranes of the keratinocytes of the granular and spinous layers, whereas its lack in the basal layer constitutes the only difference, as compared to the adult epidermis. Apart from the UEA negative basal layer (and the basement membrane) in the specimens of the 10th to the 20th week EGA, all other epidermal layers positively stained with this lectin. However, the intensity of the staining and consequently the concentration of α-L-fucose revealed dramatic variations. In the embryonic epidermis of the specimens of the 23rd week EGA only the plasma cell membranes of the keratinocytes in the granular and spinous layer positively reacted to UEA, a binding pattern identical to that found in the adult epidermis. The lack of α-Lfucose in the plasma cell membranes of basal keratinocytes constitutes a significant difference between the embryonic epidermis and other embryonic epithelia in humans. The occurrence of this monosaccharide in the surface of keratinocytes in the intermediate layer during the early age gestational roups indicate that it may play a significant role in the early stages of epidermal differentiation. A characteristic feature of embryonic epidermis (10th –20th week EGA) was the variable binding of the periderm and the plasma cell membranes of keratinocytes in the intermediate and basal layer to WGA, whereas the basement membrane (after the 13th week EGA) revealed a negative reaction. These findings clearly reflect corresponding variations of the plasma cell β(1,4)-D-N-acetyl-D-glucosamine composition. With regard to binding to WGA the embryonic epidermis (23rd week EGA) revealed a negative reaction, a feature also shared by the adult epidermis. It is of importance to note that in all specimens (13rd-15th week EGA) the basement membrane developed a negative reaction to D-galactose-β- (1,3)-Ν-acetyl-D-galactosamine, β-D-galactose, α-D-N-acetyl-D-galactosamine, α-D-glucose and α-D-mannose. These changes in plasma cell membrane glycosylation simultaneously occurred with the initiation of hair follicle keratinization and may be related to the complex interaction of epidermis and dermis, which is of essential importance for the morphogenesis of hair follicles. The interpretation of the observed alterations in the carbohydrate residue composition of the plasma cell membranes during epidermal morphogenesis is difficult at this juncture, since the mechanisms by which the synthesis and transport of these molecules within epidermal keratinocytes remain are mediated unknown. Our findings keep up with several results of previous investigations but contradict others, probably due to differences in the number and origin of the skin specimens and in the used techniques. The findings of the present study, in which the carbohydrate residue composition of keratinocyte plasma cell membranes was determined for the first time in a large number of specimens derived from different gestational age groups, could be utilized in the investigation of the pathogenesis, the prenatal diagnosis and the management of a vast variety of dermatoses.