Στην παρούσα εργασία αξιολογήθηκε η χρήση των μικροδορυφορικών δεικτών για τη μελέτη της γενετικής δομής και των φυλογενετικών σχέσεων των φυσικών πληθυσμών της Atherina boyeri που προέρχονταν τόσο από θαλάσσιες όσο και λιμναίες/λιμνοθαλάσσιες περιοχές της Ελλάδας. Προηγούμενες μελέτες βασιζόμενες κυρίως σε μιτοχονδριακούς και RAPD δείκτες έχουν υποδείξει την πιθανή παρουσία τριών ομάδων πληθυσμών στην Atherina boyeri με τόσο υψηλές γενετικές αποστάσεις μεταξύ τους που θα μπορούσαν να τις καθιστούν ακόμα και διαφορετικά είδη. Οι ομάδες αυτές είναι: οι θαλάσσιοι πληθυσμοί τύπου Ι (μη εστιγμένοι),οι θαλάσσιοι πληθυσμοί τύπου ΙΙ (εστιγμένοι) και οι λιμναίοι/λιμνοθαλάσσιοι πληθυσμοί. Η ανάλυση στην παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε με χρήση 11 μικροδορυφορικών δεικτών που σχεδιάστηκαν από τους Milana et al. (2009). Οι μικροδορυφορικοί δείκτες θεωρούνται εξαιρετικό εργαλείο μελέτης των φυλογενετικών σχέσεων μεταξύ πρόσφατα διαχωρισμένων ειδών δεδομένου ότι είναι άφθονοι, πυρηνικοί, διάσπαρτοι στο γονιδίωμα, υψηλά πολυμορφικοί και ταχέως εξελισσόμενοι. Τα αποτελέσματα έδειξαν πολύ υψηλό βαθμό πολυμορφισμού στους υπό ανάλυση πληθυσμούς και μεγάλη γενετική διαφοροποίηση μεταξύ των ελληνικών πληθυσμών του είδους όπως αυτή εκφράζεται από τις διαφορές στις συχνότητες των αλληλομόρφων των μικροδορυφορικών δεικτών. Φαίνεται επίσης να επιβεβαιώνεται η διάκριση μεταξύ των δυο θαλάσσιων τύπων της Atherina boyeri, ωστόσο οι λιμναίοι/λιμνοθαλάσσιοι πληθυσμοί παρουσιάζουν τόσο διαφορετικό γενετικό πρότυπο που θεωρείται εξαιρετικά δύσκολο να συνιστούν μια ενιαία ομάδα πληθυσμών. Οι δείκτες αυτοί δεν ήταν δυνατό να χρησιμοποιηθούν στην ανάλυση όλων των διαθέσιμων πληθυσμών, κυρίως λόγω της παρουσίας μη ενισχυόμενων (null) αλληλομόρφων, καθώς επίσης και πολλαπλών ή/και ασθενών ζωνών, γεγονός που επίσης υποδεικνύει την ύπαρξη μεγάλων γενετικών διαφοροποιήσεων, που πιθανώς ξεπερνούν τα όρια του είδους. Προκείμενου να ξεπεραστούν τα ανωτέρω προβλήματα απαιτείται η βελτιστοποίησή τους ανά ομάδα πληθυσμών, μέσω α) αλλαγών στις συνθήκες των PCR αντιδράσεων και β) κλωνοποίησης και αλληλούχισης των δεικτών αυτών από άτομα των πληθυσμών στα οποία ήταν λειτουργικοί, ώστε να επιτευχθεί ο σχεδιασμός νέων ζευγών εκκινητών, ειδικών για επιμέρους ομάδες πληθυσμών. / The present study aims at the measure of the genetic differentiation and the resolution of the phylogenetic relationships among A.boyeri populations originating from lakes/lagoons and marine sites of Greece. Previously studies based on RAPD and mitochondrial markers suggest the existence of three forms of populations of A.boyeri which could represent three different species. These three types are: marine type I, which includes almost all marine populations (non-punctuated), excluding specimens collected from Preveza, Evoia and Kos, which form the marine type II (punctuated) and the “lagoon” type which consists of all the lagoon/lake populations. In the present study, eleven microsatellite markers designed by Milana et al. (2009), were used. Microsatellite markers are supposed to be great tools in phylogenetic studies among recently separated species because they are abundant, nuclear, dispersed around the genome, highly polymorphic and rapidly evolving. Our results showed very high degree of polymorphism in the analyzed populations and extended genetic differentiation among Greek populations of the species as expressed by differences in allele frequencies of the microsatellite markers. They also seems to confirm the distinction between the two marine types of A.boyeri, but the lagoon/lake populations present different allele paterns, pointing to the possible existence of differentiated groups among them. Some of the markers could not be used in the analysis of all the available populations. This is mainly attributed to the presence of null alleles for some of the populations and to scoring difficulties raising from the presence of multiple and/or weak amplicons. This also indicates the existence of great genetic variations, which possibly exceed species limit. To overcome the above difficulties, optimization per marker is required, including a) optimization of PCR conditions and b) cloning and sequencing of these markers from individuals of the population that were functional to achieve the design of new prime pairs, specific for each group of populations .

Η οικογένεια Tephritidae των Διπτέρων εντόμων περιλαμβάνει είδη με μεγάλη οικονομική σημασία. Τα περισσότερα αποτελούν σημαντικά παράσιτα γεωργικών καλλιεργειών προκαλώντας μεγάλες καταστροφές στην παραγωγή φρούτων και λαχανικών παγκοσμίως. Τα σημαντικότερα παράσιτα ανήκουν στα γένη Anastrepha, Bactrocera, Ceratitis, Dacus και Rhagoletis. Η μελέτη των ειδών αυτών στο επίπεδο της γενετικής και της μοριακής βιολογίας θα μπορούσε να συμβάλλει σημαντικά στην ανάπτυξη μεθόδων βιολογικού ελέγχου των πληθυσμών τους. Με εξαίρεση τη Μεσογειακή μύγα, Ceratitis capitata, που θεωρείται ο καλύτερα μελετημένος οργανισμός της οικογένειας, η πληροφορία για άλλα είδη είναι πολύ περιορισμένη. Στη παρούσα μελέτη εξετάσθηκε η πιθανότητα δια-ειδικής ενίσχυσης μικροδορυφορικών δεικτών που αναπτύχθηκαν στο εργαστήριό μας για τη Μεσογειακή μύγα σε είδη των γενών Anastrephα, Bactrocera και Rhagoletis καθώς και στο είδος C. fasciventris με κύριο στόχο την ανάπτυξη κατάλληλων γενετικών δεικτών που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν σε γενετικές ή και πληθυσμιακές μελέτες των ειδών αυτών. Από τους 102 μικροδορυφορικούς δείκτες που αναλύθηκαν μέσω της PCR, οι 31 (31%) έδωσαν δια-ειδική ενίσχυση σε τουλάχιστον ένα από τα εξεταζόμενα είδη έκτος του γένους Ceratitis. Το αντίστοιχο ποσοστό για την C. fasciventris ήταν 67,75%. Το μέγεθος των προϊόντων αυτών ήταν παρόμοιο ή και ταυτόσημο με το αναμενόμενο στη Μεσογειακή μύγα. Τα αποτελέσματα από την αλληλούχιση των προϊόντων PCR και τη σύγκριση τους με τις αντίστοιχες περιοχές της Μεσογειακής Μύγας δείχνουν ότι η δομή των μικροδορυφορικών μοτίβων αλλά και των μοναδικών περιοχών που τους περιβάλλουν φαίνεται να διατηρείται στη πλειοψηφία των περιπτώσεων για τη C. fasciventris. Σε όλες τις περιπτώσεις που εξετάσθηκαν βρέθηκαν επαναλαμβανόμενα μοτίβα. Η συγκριτική ανάλυση των αλληλουχιών αυτών μπορεί να προσφέρει πολύτιμους γενετικούς δείκτες για τα είδη αυτά αλλά και πληροφορίες για τις φυλογενετικές τους σχέσεις. / Tephritidae family of Diptera includes species of great economical importance. Most of them are significant parasites of agriculture causing severe damages by attacking fruits and vegetables world wide.The most important pests belong to the genera Anastrepha, Bactrocera, Ceratitis, Dacus and Rhagoletis. Studies of these species on genetic and molecular level could contribute significantly to the development of methods for their biological control. Except for the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata, which is the best understood fruit fly pest at the genetic/molecular level, limited information exists for other species. In the present work we examined the possibility of cross-species amplification of microsatellite markers that were developed in our laboratory for C. capitata. Cross-species analyses were performed on species belonging to the genera Anastrepha, Bactrocera and Rhagoletis as well as C. fasciventris, aiming at the development of suitable markers that could be used in genetic and/or population studies of these species. A total of 102 microsatellites markers were examined through PCR. Thirty one of them (31%) showed cross-species amplification in at least one of the analyzed species. The percentage for C. fasciventris was 67.75%. The majority of the products were similar or identical in size to those expected in C. capitata. Sequencing analyses of the PCR products are when compared to the Medfly markers demonstrate that the structures of the repeat motifs and their flanking sequences are maintained in most studied cases that involve C. fasciventris. In every case studied repeat motifs were found. This analysis can provide not only useful genetic markers for the analyzed species but also information for their phylogenetic relationships.

Ο δάκος της ελιάς, Bactrocera oleae, αποτελεί το κυριότερο παράσιτο του καρπού της ελιάς. Λόγω της μεγάλης οικονομικής σημασίας της ελιάς, ιδιαίτερα για τις Μεσογειακές χώρες, ο αποτελεσματικότερος έλεγχος του εντόμου αυτού είναι απαραίτητος. Η εφαρμογή μεθόδων ολοκληρωμένης διαχείρισης του παρασίτου αυτού, μεθόδων δηλαδή φιλικών προς το περιβάλλον, επιβάλλει την καλύτερη γνώση της βιολογίας του και ιδιαίτερα της γενετικής και της γενετικής δομής των φυσικών πληθυσμών του. Στα πλαίσια αυτά, στόχος της παρούσας μελέτης ήταν η ανάπτυξη στο δάκο DNA δεικτών, των μικροδορυφόρων, οι οποίοι είναι άφθονοι στα γονιδιώματα και επιπλέον υψηλά πολυμορφικοί, για την ανάλυση φυσικών πληθυσμών του. Για την απομόνωση των μικροδορυφορικών δεικτών ακολουθήθηκαν τρεις διαφορετικές στρατηγικές: η κατασκευή και διαλογή γονιδιωματικών βιβλιοθηκών, η κατασκευή εμπλουτισμένων σε μικροδορυφόρους βιβλιοθηκών και ο έλεγχος ζευγών εκκινητών που είχαν σχεδιαστεί για την ενίσχυση μικροδορυφόρων στα συγγενικά είδη B. tyroni και C. capitata για το κατά πόσο ενισχύουν τις αντίστοιχες περιοχές και στο γονιδίωμα του εντόμου B. oleae (cross-species amplification). Από τις βιβλιοθήκες απομονώθηκαν συνολικά 69 κλώνοι που περιείχαν μικροδορυφόρους. Ακολούθησε ο σχεδιασμός ζευγών εκκινητών στις μοναδικές περιοχές που περιβάλλουν τους μικροδορυφόρους. Συνολικά σχεδιάστηκαν 42 ζεύγη εκκινητών. Οι εκκινητες αυτοί ελέγχθηκαν για το αν ενισχύουν το αναμενόμενο προϊόν. Ο έλεγχος έγινε με PCR και ηλεκτροφόρηση των προϊόντων σε πήκτωμα αγαρόζης. Παράλληλα ελέγχθηκαν είκοσι ζεύγη εκκινητών που είχαν σχεδιαστεί για μικροδορυφόρους του εντόμου B. tryoni και 42 ζεύγη εκκινητών που είχαν σχεδιαστεί για μικροδορυφόρους του εντόμου C. capitata. Οι τρεις διαδικασίες απομόνωσης έδωσαν συνολικά 67 λειτουργικά ζεύγη εκκινητών. Στη συνέχεια ελέγχθηκε μέσω PCR ο πολυμορφισμός των εκκινητών αυτών και το αν ενισχύουν διακριτά αλληλόμορφα, με μήτρα DNA γενετικό υλικό εννέα ατόμων. Τα προϊόντα της PCR αναλύθηκαν σε πήκτωμα ακρυλαμιδίου. Από τα 49 ζεύγη εκκινητών που ελέχθησαν, τα 28 έδωσαν πολύ καθαρό σήμα, ενώ τα 25 από αυτά βρέθηκαν πολυμορφικά. Μια πρώτη πληθυσμιακή ανάλυση έγινε με τη χρησιμοποίηση 24 από αυτούς τους δείκτες για την ανάλυση μικρού δείγματος ατόμων. Βασικός σκοπός της ανάλυσης αυτής ήταν να ελεγχθεί η ποιότητα των δεικτών και οδήγησε στον αποκλεισμό έξι δεικτών: ο ένας ήταν μονομορφικός, ένας δεύτερος έδειξε ασθενή ενίσχυση και μικρή επαναληψιμότητα και άλλοι τέσσερις εμφάνισαν απόκλιση από την ισορροπία κατά H-W, πιθανότητα λόγω της παρουσίας null αλληλομόρφων. Δώδεκα από τους υπόλοιπους δεκαοκτώ δείκτες χρησιμοποιήθηκαν για μια εκτεταμένη ανάλυση των πληθυσμών του δάκου στην Ευρωπαϊκή πλευρά της λεκάνης της Μεσογείου. Αναλύθηκαν δεκαεννέα δείγματα, μεγέθους εννέα ως πενήντα ατόμων, από έξι διαφορετικές χώρες (Ελλάδα, Κύπρος, Τουρκία, Ιταλία, Ισπανία και Πορτογαλία). Η ανάλυση αποκάλυψε σχετικά μικρές γενετικές αποστάσεις, που έδειχναν όμως μια στατιστικά σημαντική διαφοροποίηση σε τρεις υποπληθυσμούς. Ο πρώτος αποτελείτο από τα δείγματα της Κύπρου, ο δεύτερος από τα δείγματα Ελλάδας, Τουρκίας και Ισπανίας και ο τρίτος από τα δείγματα της Ιβηρικής χερσονήσου. Οι στατιστικές αναλύσεις που έγιναν έδειξαν τη σημαντική επίδραση της γεωγραφικής απόστασης στη δημιουργία αυτών των ομαδοποιήσεων. Οι τρεις αυτές ομάδες χαρακτηρίζονται από διαφορά και στο επίπεδο του πολυμορφισμού, εμφανίζοντας μια καθαρή μείωσή του από την Ανατολή προς τη Δύση. Η μείωση αυτή είναι στατιστικά σημαντική και με βάση την υπόθεση ότι η πορεία εποικισμού ενός είδους συνοδεύεται από μείωση του πολυμορφισμού, δίνει σημαντικές ενδείξεις για μία προς Δυσμάς πορεία εποίκισης του είδους στον Ευρωπαϊκό χώρο, με πρώτο κέντρο εξάπλωσης την Ανατολική λεκάνη της Μεσογείου. Τα πειράματα δια-ειδικής ενίσχυσης έδειξαν στενές φυλογενετικές σχέσεις των ειδών που εξετάστηκαν και κυρίως μεταξύ B. tryoni - B. oleae και B.oleae - C. capitata. Τα πειράματα αυτά υποστηρίζουν την χρησιμότητα των δεικτών που απομονώθηκαν σε ενδεχόμενες φυλογενετικές μελέτες στα είδη αυτά, καθώς και σε άλλα συγγενικά είδη. Η εύρεση ενός μεγάλου ποσοστού συντηρημένων μικροδορυφόρων σε είδη που έχουν διαχωριστεί εδώ και πολλά εκατομμύρια χρόνια ενισχύει την υπόθεση ότι οι μικροδορυφόροι δεν είναι γενετικό υλικό χωρίς ρόλο (junk DNA), αλλά επιτελούν συγκεκριμένες λειτουργίες στο γονιδίωμα. Η ανάλυση πολυμορφισμού που έγινε στις ατομικές διασταυρώσεις ατόμων από εργαστηριακούς ήταν ιδιαίτερα ενθαρρυντική. Ο υψηλός πολυμορφισμός που βρέθηκε δείχνει την δυνατότητα χρησιμοποίησης τους και στη γενετική χαρτογράφηση του είδους. / The olive fruit fly, Bactrocera oleae, is the main pest of the olive fruit. Because of its great economic importance, especially for the Mediterranean countries, there is a need for a more effective control method. The application of an integrated, environmental friendly, management of this pest requires a better knowledge of its biology and of the genetic structure of its natural populations. The aim of the present study was the development of DNA microsatellite markers for the analysis of the natural populations of the olive fruit fly. These markers are abundant in the genome of any species studied so far and highly polymorphic. Three different strategies were used for the isolation of microsatellite markers. The first was the construction and screening of genomic libraries of the insect, the second was the construction of genomic libraries, enriched for microsatellites and the third was the use of primer pairs that were designed for the amplification of microsatellite markers in the closely related species Bactrocera oleae and Ceratitis capitata(cross-species amplification). A total of 69 microsatellite containing clones were isolated from libraries. The next step was the design of primer pairs in the microsatellite flanking sequences. A total of 42 primer pairs was designed and tested for their abillty to amplify the expected product. Test was performed through PCR and analysis of the PCR products through electrophoresis on agarose gel. Twenty primer pairs designed for the amplification of Bactrocera tryoni’ s microsatellites and 42 primer pairs designed for the amplification of Ceratitis capitata microsatellites were also tested. All three strategies gave 67 primer pairs that amplified the expected product. The degree of polymorphism of these primer pairs and their ability to amplify easily resolvable alleles was tested through PCR with DNA template of nine individuals. PCR products were analysed through polyacrylamide gel electrophoresis. Twenty eight out of the 49 primer pairs tested produced clear bands and twenty five of them were polymorphic. A small scale population analysis was then performed, using tventy four of the markers available. The main purpose of this analysis was to demonstate the quality of the markers and lead to the exclusion of six markers: one of them was monomorphic, another didn’t show reproducible results and four more showed deviations from H-W equilibrium, probably because of the presence of null alleles. Twelve of the remaining loci were used in a large scale analysis of B. oleae’s populations in the European part of the Mediterranean basin. Nineteen samples, varying from nine to fifty individuals, were analysed. These samples were collected from six different countries (Greece, Cyprus, Turkey, Italy, Spain and Portugal). The analysis revealed relatively low genetic distances, which, however, demonsrated a statistically important differentiation of the samples in three subpopulations. The first consisted of the samples from Cyprus, the second of the samples from Greece, Turkey and Italy and the third of the samples from the Iberian Peninsula. The statistical analyses performed showed the statistically important contribution of geographic distance to the generation of genetic distance. These three groups of samples also demonstrate a clear loss of polymorphism towards West. This loss is statistically important and, if we take into account the hypothesis that the colonization process of a species is followed by a loss in polymorphism, it suggests a colonization process of the olive fruit fly towards West in the European part of the Mediterranean basin, with a first expansion area in the Eastern part of the Mediterranean basin. Cross-species amplification experiments indicate close phylogenetic relationships among the species studied, mainly between B. tryoni-B. oleae and B. oleae-C. capitata. These results support the usefulness of the markers isolated in phylogenetic studies in these species, as well as in other, closely related species. The identification of a high percentage if conserved microsatellites in species that have been well separated for millions of years is in agreement with the hypothesis that microsatellites are not useless genomic regions (junj DNA) but they perform specific functions in the genome. Polymorphism analysis in the crosses of individuals from laboratory strains was very encouraging. The high degree of polymorpism showes that they can be used in genetic mapping of the species

Η μεσογειακή μύγα αποτελεί το κύριο παράσιτο πολλών καλλιεργούμενων φρούτων προκαλώντας ετησίως μεγάλες καταστροφές σε γεωργικές καλλιέργειες. Η μελέτη του εντόμου τόσο σε γενετικό όσο και σε πληθυσμιακό επίπεδο μπορεί να συμβάλλει σημαντικά στην ανάπτυξη ή και τη βελτίωση αποτελεσματικών και φιλικών προς το περιβάλλον μεθόδων ελέγχου. Οι μικροδορυφόροι είναι απλές επαναλήψεις ενός νουκλεοτιδικού μοτίβου που αποτελείται 1-6 ζεύγη βάσεων. Αποτελούν πολύ χρήσιμους γενετικούς δείκτες διότι είναι άφθονοι και διάσπαρτοι στο γονιδίωμα των ευκαρυωτκών οργανισμών. Επιπλέον είναι υψηλά πολυμορφικοί, κληρονομούνται ως συνυπερέχοντες Μεντελικοί δείκτες και αναλύονται εύκολα μέσω PCR, χαρακτηριστικά που τους καθιστούν πολύτιμα εργαλεία για πληθυσμιακές και εξελικτικές μελέτες. Από τους μικροδορυφορικούς δείκτες που αναπτύχθηκαν στο εργαστήριό μας, επιλέχθηκαν 10 με βάση το βαθμό πολυμορφισμού που έδειξαν σε εργαστηριακά στελέχη. Οι δείκτες αυτοί χρησιμοποιήθηκαν στην ανάλυση 481 ενηλίκων ατόμων που προέρχονταν από 19 διαφορετικά δείγματα φρούτων που συλλέχθηκαν από εννέα διαφορετικές περιοχές της Δυτικής Ελλάδας και της Βόρειας Πελλοπονήσου. Η γενοτυπική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR για κάθε γενετικό δείκτη σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου και επακόλουθη αυτοραδιογραφία. Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων, με τη βοήθεια υπολογιστικών προγραμμάτων αποκάλυψε σημαντική γενετική διαφοροποίηση μεταξύ των δειγμάτων, που αποδίδεται εκτός των άλλων παραγόντων (κλιματολογικές συνθήκες, γεωγραφική προέλευση) στο είδος του ξενιστή. / C. capitata, is the main pest of many cultivable fruits and responsible for a significant loss in annual products, resulting in great economic damage. Studies on the genetic and population analysis will make a contribution towards the development or the improvement of environmental friendly control methods. Microsatellites are tandem simple sequence repeats of short (1-6) nucleotide motifs. They are very important genetic markers because they are dispersed and abundant in most eukaryotic genomes. They are highly polymorphic, inherited as co-dominant Mendelian markers and easily scored by PCR. Consequently, they have become one of the most popular molecular markers with application in many genetic studies, including genetic analysis of natural populations and evolutionary studies. From the available microsatellites in our laboratory, were selected ten (10), based on their polymorphism in laboratory strains. They were used for the screening of 481 adult flies in the medfly, collected from nineteen (19) different samples of fruits from nine (9) different areas in west Greece and north Peloponnesus. Analysis of genotype composition in the samples was achieved by polyacrylamide electrophoresis of the PCR products, for every genetic marker and then autoradiography. The statistic analysis of our results using software programs, revealed an important genetic differentiation in samples. Except for many factors (climatic conditions, geographic origin), the host origin will be responsible for this genetic differentiation.