Η κατανόηση των φαινομένων που λαμβάνουν χώρα κατά την αλληλεπίδραση κυττάρου βιοϋλικού και η συσχέτιση μηχανικών παραμέτρων του κυττάρου με πολύπλοκες διεργασίες στο εξωκυττάριο (ECM) περιβάλλον οδηγεί το μέλλον στο σχεδιασμό των βιοϋλικών. Σκοπός της διατριβής ήταν η διερεύνηση της προσκόλλησης και των μεταβολών των μηχανικών ιδιοτήτων οστεοβλαστών στους αρχικούς χρόνους προσκόλλησης σε υπόστρωμα του βιοπολυμερούς χιτοζάνης. Η προετοιμασία υποστρωμάτων χιτοζάνης έγινε με ομοιοπολική πρόσδεση του βιοπολυμερούς σε επιφάνεια γυαλιού (επιφάνεια ελέγχου). Με φασματοσκοπία φωτοηλεκτρονίων από ακτίνες Χ επιβεβαιώθηκε η μεταβολή της επιφανειακής χημικής σύστασης. Η μέση επιφανειακή τραχύτητα, με χρήση Μικροσκοπίας Ατομικής Δύναμης, βρέθηκε 4 φορές μεγαλύτερη στη χιτοζάνη σε σύγκριση με το γυαλί, ενώ η μέση γωνία διαβροχής ήταν περίπου 3 φορές μεγαλύτερη στη χιτοζάνη. Ο αριθμός και η μέση επιφάνεια εξάπλωσης των προσκολλημένων κυττάρων, προσδιορίστηκαν από φωτογραφίες ηλεκτρονιακού μικροσκοπίου σάρωσης και χρήση λογισμικού ανάλυσης εικόνας. Μέχρι τα 30 λεπτά, ο αριθμός ήταν μεγαλύτερος στη χιτοζάνη, ενώ μετά τα 45 λεπτά, στο γυαλί. Σε όλους τους χρόνους, η μέση επιφάνεια εξάπλωσης ήταν μεγαλύτερη στη χιτοζάνη. Για την ποσοτικοποίηση της προσκόλλησης, χρησιμοποιήθηκε η τεχνική της μικροπιπέττας σε πειράματα αποκόλλησης μεμονωμένων οστεοβλαστών. Υπολογίστηκε η “ώθηση αποκόλλησης”, I, ως το ολοκλήρωμα της εφαρμοζόμενης δύναμης στο χρόνο (I=SFdt) για την πλήρη αποκόλληση ενός κυττάρου και βρέθηκε στατιστικά μεγαλύτερη στη χιτοζάνη σε όλους τους χρόνους. Με την τεχνική Ποσοτικής Αλυσιδωτής Αντίδρασης Πολυμεράσης, η έκφραση των γονιδίων ιντεγκρινών αν, α4, β1 και β3 βρέθηκε σημαντικά αυξημένη στη χιτοζάνη από τα 30 στα 120 λεπτά. Με συνεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης, παρατηρήθηκε αυξημένη έκφραση της κινάσης εστιακής προσκόλλησης στη χιτοζάνη στα 30 και στα 120 λεπτά. Τέλος, χρησιμοποιήθηκε η τεχνική της μικροπιπέττας σε πειράματα εφελκυσμού και ερπυσμού των οστεοβλαστών και υπολογίστηκαν οι μεταβολές του μέτρου Young, Ε, και του φαινόμενου ιξώδους, η. Οι μέσες τιμές βρέθηκαν αυξημένες στην πορεία της προσκόλλησης στις δύο επιφάνειες, παρουσιάζοντας υψηλότερες τιμές στη χιτοζάνη. Η παρούσα διατριβή είναι μια ολοκληρωμένη φαινομενολογική προσέγγιση της μηχανικής συμπεριφοράς της οστεοβλάστης κατά την προσκόλληση. Η προσκόλληση στη χιτοζάνη συνοδεύεται από μεταβολές στη μηχανική συμπεριφορά και συνδέεται με κρίσιμες βιοχημικές διεργασίες. / The understanding of the phenomena that take place during cell-biomaterial interaction and the correlation of cell mechanical parameters with complicated processes at the extracellular environment (ECM) is driving the future of biomaterial design. The aim of the present study was the investigation of attachment and of alterations of mechanical properties of osteoblasts during the initial phase of attachment on chitosan biopolymer substrate. The preparation of the chitosan substrates was done with covalent immobilization of the biopolymer on glass surface (control substrate). X-Ray photolelectron spectroscopy confirmed the alteration of the surface chemical composition. Mean surface roughness, as measured by Atomic Force Microscopy, was increased 4-fold compared to glass, while the mean contact angle was found 3 times higher on chitosan substrate. The mean number and spreading area of the attached cells, were determined by Scanning Electron Microscopy images and the use of image processing program. Up to 30 minutes, the number of attached cells was higher on chitosan, while after 45 minutes, it was on glass. At all time points, the mean spreading area was greater on chitosan. To quantify attachment, the micropipette aspiration technique was used at experiments of detachment of individual osteoblasts. The ‘’detachment impulse’’, I, was calculated, as the integral of the applied force at time required (I=SFdt) for complete detachment of one cell, and it was found statistically higher on chitosan at all attachment times. With the quantified Polymerase Chain Reaction, the αν, α4, β1 and β3 gene integrin expression was found significantly increased from 30 to 120 minutes of attachment on chitosan. Using confocal scanning microscopy, higher expression of focal adhesion kinase was observed on chitosan at 30 and 120 minutes of attachment. Additionally, the micropipette aspiration technique was used at stretching and creep experiments so as to calculate the alterations of cell’s Young modulus, E, and apparent viscosity, η. Mean values were increased at the course of spreading for both surfaces, demonstrating greater values on chitosan. The present study is a complete phenomenological approach of the mechanical behavior of osteoblasts during attachment. Attachment on chitosan is accompanied by alterations of the mechanical behavior and is associated with critical biochemical processes.

Αντικείμενο της παρούσας διατριβής, ήταν η διερεύνηση της διεπιφάνειας ανθρώπινων μεσεγχυματικών κυττάρων (Human Mesenchymal Stem Cells, hMSCs) -Νανοσωλήνων Άνθρακα Πολλαπλού Τοιχώματος (Multi Walled Carbon Nanotubes, MWCNTs) υπό στατικές και δυναμικές συνθήκες. Οι MWCNTs έχει αποδειχθεί ότι, έχουν μοναδικές ηλεκτρικές και φυσικές ιδιότητες, μηχανική αντοχή και χαμηλή πυκνότητα, χαρακτηριστικά που τους καθιστούν εξαιρετικά ελκυστικούς για το σχεδιασμό βιοϋλικών για ορθοπαιδικές εφαρμογές. Αρχικά, μελετήθηκε η βιοσυμβατότητα των hMSCs σε επιφάνειες MWCNTs, ως προς την κυτταροτοξικότητα, τη μορφολογία, τον πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση και την οργάνωση του κυτταροσκελετού. Το υπόστρωμα των MWCNTs ευνόησε την εξάπλωση των κυττάρων, προήγαγε τον πολλαπλασιασμό και προώθησε τη διαφοροποίηση των hMSCs σε οστεοβλάστες, όπως έδειξε η έκφραση αλκαλικής φωσφατάσης, οστεοποντίνης και οστεοκαλσίνης. Μελετήθηκε η γονιδιακή έκφραση των ιντεγκρινικών υποδοχέων, υπεύθυνων για την προσκόλληση των κυττάρων στους MWCNTs. Με την τεχνική του περιστρεφόμενου δίσκου, εκτιμήθηκε η δύναμη προσκόλλησης των hMSCs στους MWCNTs και η επίδραση της κάθε ιντεγκρίνης στη μεταβολή της δύναμης προσκόλλησης. Για τη διερεύνηση της απόκρισης των οστεοβλαστών στη μηχανική φόρτιση, τα προσκολλημένα κύτταρα στους MWCNTs καταπονήθηκαν για 3 και 24 ώρες, με σύστημα μηχανικής φόρτισης βασισμένο στην Αρχή Κάμψης Τεσσάρων Σημείων. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι, η φόρτιση επηρεάζει θετικά την έκφραση γονιδίων προσκόλλησης και δεικτών διαφοροποίησης. Επιπρόσθετα, μελετήθηκε η συμπεριφορά των hMSCs ως προς την κυτταροτοξικότητα, τον πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση, την οργάνωση του κυτταροσκελετού και την έκφραση γονιδίων προσκόλλησης, σε τροποποιημένες επιφάνειες MWCNTs με υδροξυλομάδες, καρβοξυλομάδες και αμινομάδες. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι, η αμινοτροποποιημένη επιφάνεια ευνόησε σημαντικά την κυτταρική συμπεριφορά σε σύγκριση με τις άλλες δύο επιφάνειες. Τέλος, μελετήθηκε η επίδραση της τοπογραφίας με χρήση κάθετα ευθυγραμμισμένων MWCNTs, σε σύγκριση με τυχαία προσανατολισμένους MWCNTs. Η απόκριση των hMSCs στους κάθετα ευθυγραμμισμένους MWCNTs ήταν καλύτερη σε σύγκριση με τους τυχαία προσανατολισμένους, τόσο ως προς τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση, όσο και ως προς την οργάνωση του κυτταροσκελετού. Τα αποτελέσματα της διατριβής είναι υποσχόμενα για το μελλοντικό σχεδιασμό βιοϋλικών με MWCNTs, με τελικό σκοπό την εφαρμογή σε θεραπείες στις οποίες απαιτείται ανακατασκευή του οστού. / The aim of the present study was the investigation of the interface of human Mesenchymal Stem Cells (hMSCs) – Multiwalled Carbon Nanotubes (MWCNTs), under static and dynamic conditions. MWCNTs have been proven to obtain unique electric and physical properties, mechanical strength and low density, which render them highly attractive for the design of biomaterials for orthopaedic applications. Firstly, the biocompatibility of MWCNTs was studied, in terms of hMSCs cytotoxicity, morphology, proliferation, differentiation, cytoskeleton organization and toxicity. The substrate of MWCNTs favored cell spreading, increased proliferation and promoted cell differentiation, as measured by the expression of alkaline phosphatase, osteopontin and osteocalcin. The gene expression of integrin receptors responsible for cell attachment on MWCNTs was studied. Using the Spinning Disc Technique, the attachment strength of hMSCs on MWCNTs was evaluated, as well as the impact of each integrin to the alteration of attachment strength. In order to investigate the cell response to mechanical loading, the attached cells on MWCNTs were stressed for 3 and 24 hours, using a system for mechanical loading based on the 4-point bending principle. Results showed that loading positively induces the expression of genes associated with attachment and differentiation markers. Additionally, the cell behavior concerning proliferation, differentiation, cytoskeleton organization, apoptosis and gene expression associated with attachment, was studied on MWCNTs after surface modification with hydroxyl-, carboxyl-, and amino- groups. The findings indicated that the amino- modified surface significantly favored the cell behavior, compared to the other two surfaces. Lastly, the topography effect was studied using vertically aligned MWCNTs. Cell response was found better on the vertically compared to the randomly oriented, in terms of proliferation, differentiation and cytoskeleton organization. The findings of the study are promising for the future design of biomaterials of MWCNTs, aiming for application in therapies where bone reconstruction is demanded.