Οι Heat Shock Proteins (Hsps) αποτελούν πολλές διαφορετικές οικογένειες που επάγονται προς απάντηση μιας ευρείας σειράς φυσιολογικών και περιβαλλοντικών ερεθισμάτων. Μια τέτοια πρωτεΐνη, η οποία επάγεται ιδιαίτερα κατά τη διάρκεια της απάντησης σε stress, είναι η Hsp27, με ΜΒ:27kDa, της οποίας η έκφραση φαίνεται να σχετίζεται με αυξημένη επιβίωση των κυττάρων όταν επιδρούν σε αυτά κυτταροτοξικά ερεθίσματα. Έχει φανεί ότι εμποδίζει τον κυτταρικό θάνατο μέσω αλληλεπίδρασης με ποικιλία παραγόντων που προκαλούν απόπτωση. Η Hsp27 είναι μια μοριακή πρωτεΐνη chaperone με ικανότητα να αλληλεπιδρά με μεγάλο αριθμό πρωτεϊνών. Πρόσφατα στοιχεία έχουν δείξει ότι η Hsp27 ρυθμίζει την απόπτωση, χάρη στην ικανότητα που έχει να διαντιδρά με μόρια ¨κλειδιά¨ στο μονοπάτι μεταβίβασης σημάτων της απόπτωσης και ιδιαίτερα, με εκείνα που ενέχονται στην ενεργοποίηση των κασπασών. Οι άλλοι δυο ρόλοι της Hsp27 κατά τη διάρκεια του stress που αποσκοπούν στην κυτταροπροστασία, είναι αφενός να αλληλεπιδρά και να σταθεροποιεί τον κυτταροσκελετό, αφετέρου να ρυθμίζει το ενδοκυττάριο επίπεδο των τοξικών ριζών οξυγόνου. Όταν τα κύτταρα βρίσκονται σε stress τα επίπεδα της Hsp27 είναι γενικώς χαμηλά και αυτή υπάρχει κυρίως με τη μορφή μεγάλων ολιγομερών. Κατά τη διάρκεια της απάντησης στο stress έχουμε αύξηση στα επίπεδα έκφρασης της Hsp27, που συνδυάζεται με μια αναδιοργάνωσή της λόγω φωσφορυλίωσης. Η φωσφορυλίωση μπορεί να συμβεί σε τρεις διαφορετικές θέσεις που εντοπίζονται σερίνες (Ser15, Ser78, Ser82). Η φωσφορυλίωση της Hsp27 καταλήγει σε ανακατανομή των μεγάλων ολιγομερών σε μικρότερα σύμπλοκα. ΣΚΟΠΟΣ: Αντικείμενο της μελέτης μας είναι ακριβώς η έκφραση των φωσφορυλιωμένων μορφών της Hsp27 με μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος φυσιολογικών ενηλίκων και οι διαφορές που εμφανίζονται όταν τα κύτταρα βρίσκονται in vitro σε βασικές συνθήκες, σε συνθήκες επίδρασης θερμικού stress και σε συνθήκες επίδρασης του παράγοντα TNF-a. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ: Εφαρμόστηκε η τεχνική της SDS-PAGE ηλεκτροφόρησης και επακόλουθα της WESTERN BLOTTING για την ανίχνευση των πρωτεϊνών. Τα πρώτα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε πρωτεϊνικό εκχύλισμα της κυτταρικής σειράς λευχαιμικών κυττάρων U937 με και χωρίς τη χορήγηση Doxorubicin.Τα επόμενα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε εκχύλισμα πρωτεϊνών μονοπύρηνων κυττάρων περιφερικού αίματος προελεύσεως από ένα τυχαίο δείγμα 6 ενηλίκων ανδρών-γυναικών ηλικίας από 20-30 ετών. Τα τελευταία πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε πρωτεϊνικό εκχύλισμα μονοπύρηνων κυττάρων περιφερικού αίματος, το οποίο προερχόταν από ένα τυχαίο δείγμα 7 φυσιολογικών ανδρών-γυναικών ηλικίας 20-30 ετών. Τα κύτταρα αυτά είχαν χωριστεί σε τρεις υποπληθυσμούς ανάλογα με τις συνθήκες που είχαν υποβληθεί: βασικές συνθήκες, συνθήκες επίδρασης θερμικού stress και συνθήκες επίδρασης TNF-a. Ο αρχικός διαχωρισμός των μονοπύρηνων κυττάρων περιφερικού αίματος έγινε με Ficoll. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Τα πρώτα πειράματα έγιναν σε πρωτεϊνικό εκχύλισμα κυττάρων της σειράς U937 τα οποία είχαν δεχθεί την επίδραση TNF-a. Η Western Blotting ανάλυση ανέδειξε την παρουσία φωσφορυλιωμένης Hsp27 για τη θέση Ser78,αλλά όχι για τις θέσεις Ser15 και Ser 82. Όταν όμως η ίδια μελέτη πραγματοποιήθηκε σε πρωτεϊνικό εκχύλισμα της ίδιας σειράς που είχαν δεχθεί την επίδραση Doxorubicin αναδείχθηκε η παρουσία φωσφορυλιωμένης Hsp27 για τις θέσεις Ser15 και Ser82. Τα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν σε πρωτεϊνικό εκχύλισμα μονοπύρηνων κυττάρων υγιών ενηλίκων, τα οποία δεν είχαν υποστεί απολύτως καμμία επίδραση, ανέδειξαν την παρουσία και των τριών μορφών φωσφορυλιωμένης Hsp27 καθώς και της ολικής μη φωσφορυλιωμένης μορφής σε όλα τα δείγματα. Στα τελευταία πειράματα που έγιναν σε πρωτεϊνικό εκχύλισμα μονοπύρηνων κυττάρων περιφερικού αίματος -που είχαν διαιρεθεί σε τρεις πληθυσμούς ανάλογα με τις συνθήκες που είχαν επιδράσει- ανέδειξαν τα εξής: Η φωσφορυλιωμένη μορφή της Hsp27 για τη θέση Ser78 και τη θέση Ser82 επαγόταν και στους τρεις υποπληθυσμούς κυττάρων, δηλαδή όταν αυτά βρισκόντουσαν υπό βασικές συνθήκες, υπό συνθήκες θερμικού shock και υπό συνθήκες επίδρασης TNF-a. Όσον αφορά τη φωσφορυλιωμένη μορφή της Hsp27 για τη θέση Ser15 διαπιστώθηκε ότι επαγόταν περισσότερο η έκφρασή της σε συνθήκες επίδρασης TNF-a και θερμικού shock από ότι στις βασικές συνθήκες. Η ολική Hsp27, η μη φωσφορυλιωμένη, δεν αναδείχθηκε σε κανέναν από τους τρεις υποπληθυσμούς κυττάρων, σε όσα πειράματα πραγματοποιήθηκαν. ΣΥΖΗΤΗΣΗ: Από τα αποτελέσματα των πρώτων πειραμάτων στα κύτταρα της σειράς U937 προέκυψε η βάσιμη υποψία ότι η επίδραση κάποιου στρεσσογόνου παράγοντα είχε διαφορετική επίδραση στην Hsp27,ανάλογα με το ποιος ήταν αυτός και για πόσο διάστημα επιδρούσε. Επομένως σε διάφορες συνθήκες ανευρίσκονται διαφορετικοί συνδυασμοί της Hsp27, γιατί ακριβώς εξυπηρετούν τις απαιτούμενες διαφορετικές, ενδεχομένως, λειτουργίες αντίστοιχα. Η παρουσία όλων των μορφών της Hsp27 στα μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος υγιών ενηλίκων όταν αυτά δεν είχαν υποστεί καμμία εξωγενή επίδραση, οδήγησε στο συμπέρασμα ότι ενδεχομένως όλες αυτές οι μορφές της πρωτεΐνης να βρίσκονται σε μια δυναμική κατάσταση εναλλαγής στα κύτταρα ανάλογα με τις ενδογενείς επιδράσεις που δέχονται ανά πάσα στιγμή. Τέλος ,η παρουσία των φωσφορυλιωμένων μορφών της Hsp27 μόνο για τις θέσεις Ser78 και Ser82 σε βασικές συνθήκες αποτελεί σημαντική ένδειξη ότι σε αυτήν την περίπτωση επάγονται περισσότερο τα μεγάλα ολιγομερή της πρωτεΐνης. Αντίθετα, σε συνθήκες επίδρασης θερμικού shock και TNF-a, επάγονται και τα μικρότερα σύμπλοκα της Hsp27, αφού ανευρίσκεται επιπλέον και η φωσφορυλιωμένη μορφή της και για τη θέση Ser15. / -