Οι ανησυχητικές διαστάσεις που έχει λάβει τα τελευταία χρόνια η περιβαλλοντική ρύπανση και ιδιαίτερα η ρύπανση του θαλάσσιου περιβάλλοντος, καθιστούν επιτακτική την ανάγκη εύρεσης και εγκαθίδρυσης νέων βιοδεικτών που μπορούν να συμβάλουν δραστικά στην έγκαιρη αναγνώριση της κατάστασης της υγείας του θαλάσσιου οικοσυστήματος και συνεπώς στη λήψη βελτιωτικών μέτρων για την αποκατάστασή του. Κυρίαρχο ρόλο ανάμεσα στους θαλάσσιους ρύπους κατέχουν τα βαρέα μέταλλα, τα οποία λόγω της ικανότητάς τους να επάγουν ή να προκαλούν οξειδωτικό στρες μπορούν να προκαλέσουν σημαντικές, ακόμη και θανατογόνες βλάβες στους θαλάσσιους οργανισμούς. Η έκθεση σε μέταλλα προκαλεί την απορρύθμιση πολλών κυτταρικών διαδικασιών και κυρίως αυτών που διεξάγονται από μακρομοριακά σύμπλοκα, όπως η μεταφραστική μηχανή, τα οποία είναι ιδιαίτερα ευαίσθητα σε συνθήκες stress. Οι αλλαγές που προκαλούνται από το κυτταρικό stress στη διαδικασία της μετάφρασης καλύπτουν ένα ευρύ φάσμα αποκρίσεων, που μπορεί να περιλαμβάνει μείωση της ολικής μετάφρασης ή αύξηση της μετάφρασης ειδικών mRNAs. Ένας αποτελεσματικός τρόπος εκτίμησης των μεταφραστικών αποκρίσεων ενός οργανισμού στο περιβαλλοντικό stress είναι ο προσδιορισμός του μεταφραστικά ενεργού ριβοσωματικού κλάσματος των πολυσωμάτων. Επίσης, καθώς ρυθμιστικά γεγονότα μπορεί να συμβούν σε οποιοδήποτε βήμα της μετάφρασης, έγινε μία σειρά πειραμάτων, που αφορούν στον έλεγχο της μεταφραστικής λειτουργίας του μυδιού Mytilus galloprovincialis, οργανισμού που χρησιμοποιείται συχνά ως βιομάρτυρας, σε εργαστηριακές συνθήκες, υπό την επίδραση τριών μετάλλων, του υδραργύρου, του χαλκού και του καδμίου. Για την εκτίμηση της κατάστασης της υγείας των εκτεθειμένων μυδιών έγινε προσδιορισμός ορισμένων κλασικών, ευρέως χρησιμοποιούμενων βιοδεικτών, καθώς και βιοδεικτών οξειδωτικού στρες. Ο έλεγχος των μεταφραστικών αποκρίσεων των εκτεθειμένων μυδιών περιλάμβανε εκτίμηση του ποσοστού πολυσωμάτων και προσδιορισμό της επίδρασης των μετάλλων τόσο στο προπαρασκευαστικό στάδιο της μετάφρασης, δηλαδή την αμινοακυλίωση των υποστρωμάτων, όσο και στα τρία κύρια στάδια της μετάφρασης, δηλαδή την έναρξη, την επιμήκυνση και τον τερματισμό. Τα δεδομένα της μελέτης αυτής αποκαλύπτουν ότι τόσο ο υδράργυρος, όσο και ο χαλκός προκαλούν το ίδιο πρότυπο αλλαγών στη μεταφραστική λειτουργία των εκτεθειμένων μυδιών, οδηγώντας σε απορρύθμιση όλων των σταδίων και των ενδιάμεσων βημάτων της πρωτεϊνοσύνθεσης. Οι διαταραχές αυτές οφείλονται στο οξειδωτικό στρες που προκαλείται από τα μέταλλα αυτά και στην παράλληλη αδυναμία του συστήματος αντιοξειδωτικής άμυνας των κυττάρων να το αντιμετωπίσει. Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων επιβεβαιώνει την αρνητική επίδραση του οξειδωτικού στρες που προκαλείται από τα μέταλλα στη μετάφραση, με μία στατιστικά σημαντική συσχέτιση το ποσοστού πολυσωμάτων με τους βιοδείκτες οξειδωτικού στρες. Από την άλλη, τα αποτελέσματα της έκθεσης των μυδιών στο κάδμιο διαφοροποιούνται σημαντικά. Αρχικά, η έκθεση των μυδιών στο μέταλλο αυτό προκαλεί μία έντονη διαταραχή στην πρωτεϊνοσυνθετική διαδικασία, οφειλόμενη στην πρόκληση οξειδωτικού στρες. Με την πάροδο όμως το χρόνου, τα κύτταρα καταφέρνουν να διεγείρουν τους αντιοξειδωτικούς μηχανισμούς, που σε αυτή την περίπτωση αντιπροσωπεύονται κυρίως από τις μεταλλοθειονίνες, με αποτέλεσμα να καταφέρνουν να ανταπεξέλθουν στη δύσκολες συνθήκες και να αναχαιτίσουν την αρνητική επίδραση του καδμίου, γεγονός που οδηγεί σε ανάκαμψη της μεταφραστικής ικανότητας των μυδιών αυτών, στο τέλος της περιόδου έκθεσης. Το διφασικό προφίλ της επίδρασης του καδμίου αντανακλάται στην έλειψη συσχέτισης μεταξύ του ποσοστού πολυσωμάτων των εκτεθειμένων στο κάδμιο μυδιών και των βιοδεικτών οξειδωτικού στρες αλλά και των λοιπών βιοδεικτών. / The alarming levels of the environmental and especially the marine pollution in recent years constitute an urgent need of finding and establishing new biomarkers which may contribute to the early detection of the health status of the marine ecosystem leading to ameliorating measures towards its restoration. Heavy metals, which are capable of causing severe or even leathal defects to marine organisms, through their ability to induce or produce oxidative stress, posess a leading role among the marine pollutants. Exporure to heavy metals may cause the deregulation of many cellular processeses, mainly of those that are carried out by macromolecular complexes, such as the translational machinery, which are particularly sensitive to stress conditions. The alterations induced by the cellular stress in the translation may cover a broad range of responses, including a decline of the global translation or an increase of the translation of certain mRNAs. An effective way to reveal translational responses of an organism to environmetal stress is the evaluation of the translationally active ribosomal fraction of polysomes. Moreover, considering the fact that regulatory events may occur at any step of the translational process, a set of experiments was carried out, concerning the examination of the translational function of the mussel Mytilus galloprovindialis, which is commonly used as a bioindicator, in laboratory conditions, under the influence of three metals, mercury, copper and cadmium. In order to evaluate the health condition of the exposed mussels, a battery of standard biomarkers was applied, including biomarkers of oxidative stress. The determination of the translational responses of the treated mussels included measurement of the polysome content and assessment of the metal effect on the preparative stage of protein synthesis, the aminacylation of the substrates, as well as on the three main stages of translation, that is the initiation, the elongation and the termination. The data of the study reveal that mercury as well as copper cause the same patern of alterations in the translational function of the exposed mussels, leading to a deregulation of every stage and intermediate step of protein synthesis. These perturbations are a consequence of the metal induced oxidative stress, followed by a failure of the antioxidant defense system to confront it. Statistical analysis of the results confirms the negative effect of the metals on the translation, with a statistically important correlation of the polysome content with the oxidative stress biomarkers. On the other hand, the results of the cadmium exposed mussels follow a different pattern. First, the exposure of mussels to the metal causes a severe perturbation of the translational process, due to the oxidative stress induction. Finally, cells stimulate antioxidant mechanisms, in this case represented by metallotheioneins, managing to cope with the difficult conditions and to block the negative effect of cadmium, which leads to a restoration of the translational capacity of the mussels, at the end of the exposure period.The two-phase profile of the cadmium effect is reflected on the absence of statistical correlation between the polysomal content and biomarkers of oxidative stress, as well as other biomarkers.

Η κλινδαμυκίνη αποτελεί μέλος της οικογενείας των MLS αντιβιοτικών, με ευρύτατες εφαρμογές στην Ιατρική. Προσδεδενόμενη στο κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης, δρα ως αναστολέας της πρωτεϊνικής σύνθεσης. Η ακριβής θέση δράσης της δεν έχει πλήρως διασαφηνισθεί. Διάφορες μελέτες έχουν δείξει πως δρα στην Α θέση, ενώ άλλες στην Ρ θέση της μεγάλης ριβοσωματικής υπομονάδας. Στην παρούσα εργασία γίνεται λεπτομερής κινητική ανάλυση της αναστολής του σχηματισμού του πεπτιδικού δεσμού από την κλινδαμυκίνη σε ιοντικό περιβάλλον που πλησιάζει το φυσιολογικό του κυττάρου (4,5 mM Mg2+, 150 mM NH4+). Συγκεκριμένα, η δράση της κλινδαμυκίνης μελετήθηκε σε ένα σύστημα ελεύθερο-κυττάρων του εντεροβακτηρίου Escherichia coli, όπου ένας πεπτιδικός δεσμός σχηματίζεται μεταξύ πουρομυκίνης και AcPhe-tRNA, προσδεδενόμενου στην Ρ-θέση ριβοσωμάτων προγραμματισμένων με poly(U). Η πουρομυκίνη δρα ως ανάλογο του 3΄ άκρου ενός αμινοακυλο-tRNA ενώ το τριμερές AcPhe-tRNA∙ poly(U)∙ ριβόσωμα, σύμπλοκο C, ως ανάλογο του εναρκτήριου μεταφραστικού συμπλόκου. Η κινητική ανάλυση αποκάλυψε ότι η κλινδαμυκίνη συμπεριφέρεται ως αναστολέας βραδείας δεσμεύσεως. Μετά από μια παροδική αλληλεπίδραση με την Α-θέση, εγκαθίσταται κοντά στην Ρ-θέση του ριβοσώματος με αποτέλεσμα να επηρεάζει την ταχύτητα σχηματισμού του πεπτιδικού δεσμού. Στην συνέχεια μελετήθηκε η επίδραση των πολυαμινών στην αλληλεπίδραση της κλινδαμυκίνης με το σύμπλοκο C. Τα αποτελέσματα έδειξαν πως η σπερμίνη παρεμποδίζει την επίδραση της κλινδαμυκίνης στην Ρ-θέση, όμως επηρεάζει ευνοϊκά και σε μεγαλύτερο βαθμό, την αρχική δέσμευση του φαρμάκου στην Α-θέση ελαττώνοντας το εντροπικό κόστος. Η επίδραση αυτή δεν μεταβλήθηκε όταν αντί της σπερμίνης χρησιμοποιήθηκαν ριβοσώματα επισημασμένα μ’ένα φωτοδραστικό ανάλογο της σπερμίνης, την Ν1-αζιδοβενζαμιδινο-σπερμίνη, ή όταν στο διάλυμα επώασης προστέθηκε μείγμα σπερμίνης και σπερμιδίνης. Πειράματα σταυρο-σύνδεσης έδειξαν ότι η σπερμίνη προσδένεται πλησίον της θέσης δέσμευσης της κλινδαμυκίνης. Η παρατήρηση αυτή οδήγησε στην υπόθεση, ότι οι πολυαμίνες δεσμευόμενες πλησίον της θέσης πρόσδεσης της κλινδαμυκίνης επηρεάζουν την αλληλεπίδραση του αντιβιοτικού με το ριβόσωμα, επάγοντας αλλαγές διαμόρφωσης στο ριβοσωμικό σύμπλοκο. Η υπόθεση αυτή βρίσκεται σε συμφωνία με πειράματα χημικής προστασίας, που έδειξαν, ότι οι πολυαμίνες επηρεάζουν σημαντικά την τριτοταγή δομή του ριβοσώματος. Από άποψη φαρμακευτικών εφαρμογών η παρούσα μελέτη εισηγείται ότι, κάθε φορά που ένα αντιβιοτικό, με μοριακό στόχο το ριβόσωμα, είναι προς σχεδιασμό, η επίδραση του ιοντικού περιβάλλοντος πρέπει να λαμβάνεται σοβαρά υπόψη. / Clindamycin is a representative antibiotic of the MLS family, widely used in clinical practice. It inhibits protein synthesis by binding to the peptidyltransferase center of the ribosome. Clindamycin’s exact site of action is not known. Several studies have shown that it is an inhibitor of the A-site. However, there are also stydies that suggest that clindamycin acts at the P-site of the large ribosomal subunit. In this study, we re-examined the mechanism by which the antibiotic inhibits the formation of peptide bond in an ionic environment that resembles in vivo conditions (4.5 mM Mg2+, 150 mM NH4+). Clindamycin was investigated in a cell-free system derived from Escherichia coli, in which a peptide bond is formed between puromycin and AcPhe-tRNA bound at the P-site of poly (U) –programmed ribosomes. Puromycin can be considered as an analogue of the 3’-end of aminoacyl-tRNA, while the ternary complex AcPhe-tRNA∙poly(U)∙ ribosome (complex C) as an analogue of the initiation translation complex. Kinetics revealed that clindamycin behaves as a slow – binding inhibitor. After a transient interaction with the A-site of ribosomes, it slowly accommodates near the P-site so that peptide bond is still formed but with a lower velocity. Next, we investigated the influence of polyamines to the interaction of clindamycin with complex C. It was found that spermine hinders the accommodation of clindamycin to the P-site, but exerts a beneficial, more pronounced, effect on the potency of the drug by lowering the entropic cost of clindamycin binding to the A-site. Polyamine effect was not substantially altered when ribosomes labeled with a photoreactive analogue of spermine, N1-azidobenzamidino-spermine, were used or when a mixture of spermine and spermidine was added in the incubation mixture, instead of spermine alone. Cross-linking experiments have demonstrated that spermine binds to the vicinity of the antibiotic binding pocket. This observation temped us to suppose that polyamines bound adjacently to the binding site of clindamycin modulate the interaction of this drug with the ribosome by inducing conformational changes in the elongating ribosomal complex. Such a hypothesis is in agreement with chemical protection data revealing that polyamines influence significantly the tertiary structure of ribosomes. From the stand point of pharmaceutical applications, the present work postulates that when a drug is designed to target to the ribosome, the influence of the ionic environment should be taken into account.