Η Ωκυτοκίνη (ΟΤ) είναι ένα κυκλικό εννιαπεπτίδιο του υποθαλάμου, η οποία απελευθερώνεται στη γενική κυκλοφορία από τον οπίσθιο λοβό της υπόφυσης. Οι κύριες φυσιολογικές δράσης της είναι η επαγωγή συσπάσεων του μυομητρίου και η έκθλιψη του γάλακτος. Εν τούτοις, η μεγάλη διασπορά των υποδοχέων της ΟΤ στον εγκέφαλο αποδίδουν στην ορμόνη το ρόλο του νευροδιαβιβαστή, ο οποίο ρυθμίζει τις αναπαραγωγικές και κοινωνικές συμπεριφορές. Ο ρόλος της ΟΤ στην πρόκληση του πρόωρου τοκετού οδήγησε την έρευνα για το σχεδιασμό και τη σύνθεση πεπτιδικών ανταγωνιστών της ορμόνης ως δραστικούς τοκολυτικούς παράγοντες. Πλήθος τέτοιων αναλόγων συντέθηκε και εξετάστηκε, αλλά μόλις για ένα, το Atosiban, και μόνο στην Ευρώπη, επετράπη η κυκλοφορία για την πρόληψη του πρόωρου τοκετού με την εμπορική ονομασία Tractocile™. Ο σχεδιασμός νέων αναλόγων της ΟΤ βασίζεται στα συμπεράσματα δομής-δραστικότητας. Η ανταγωνιστική δράση εξαρτάται από τη διαμόρφωση και την υδροφοβικότητα του αμινοξέος στη θέση 2. Επιπρόσθετα, η απαλοιφή της τελικής αμινομάδας προσδίδει στο πεπτίδιο παράταση της δράσης. Ιδιαίτερη σημασία στην εκλεκτική πρόσδεση της ΟΤ στον υποδοχέα της έχει η Ιle στη θέση 3, μιας και είναι το μόνο αμινοξύ στο οποίο διαφέρει στον εικοσαμελή δακτύλιο η ΟΤ από το συγγενές μόριο της, τη Βασοπρεσίνη (VP). Βασιζόμενοι στα ανωτέρω συμπεράσματα και για διερεύνηση του ρόλου της θέσης 3 της ορμόνης, συνθέσαμε δεκατέσσερα νέα ανάλογα της ΟΤ. Όλα τα ανάλογα περιέχουν β-μερκαπτοπροπιονικό οξύ (Mpa) στη θέση 1 και D-O-αιθυλ-τυροσίνη [D-Tyr(Et)] ή D-1-ναφθυλ-αλανίνη [D-Nal(1)] στη θέση 2. Η ισολευκίνη (Ile) στη θέση 3 έχει υποκατασταθεί με γ-αμινοϊσοβουτυρικό οξύ (Aib), L- ή D-α-τερτβουτυλ-γλυκίνη [L-/D-Gly(But)], L- ή D-3-πυριδυλ-αλανίνη [L-/D-Pal(3)] και L- ή D-β-(2-θεϊενυλ)-αλανίνη (L-/D-Thi). Τα φάσματα μάζας των αναλόγων συμφωνούν με τα αναμενόμενα αποτελέσματα. Τα δεκατέσσερα ανάλογα εξετάστηκαν ως προς την ωκυτόκιο δράση σε απομονωμένο ιστό μήτρας αρουραίου, ως προς τη δράση επί της πίεσης και ως προς τη συγγένεια με τον ανθρώπινο ωκυτόκιο υποδοχέα. Επιπλέον, τα ανάλογα [Mpa1, D-Tyr(Et)2, Thi3]OT, [Mpa1, D-Tyr(Et)2, D- Thi3]OT], [Mpa1, D-Nal(1)2, Thi3]OT και [Mpa1, D-Nal(1)2, D- Thi3]OT] εξετάστηκαν και ως προς τη δράση τους επί του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυτταρικών σειρών MDA-MB-468 και MCF-7. Όλα τα ανάλογα δρουν ως ανταγωνιστές της φυσικής ορμόνης. Συγκεκριμένα, τα ανάλογα [Mpa1, D-Nal(1)2, Gly(But)3]OT και [Mpa1, D-Nal(1)2, Thi3]OT έχουν ισχυρή αντι-ωκυτόκιο δράση (pA2=8.34±0.30 και 8.50±0.24, αντίστοιχα). Όσο αφορά τα αποτελέσματα των βιολογικών δοκιμών επί του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων,αυτά δεν οδηγούν σε ασφαλή συμπεράσματα για τη δράση των αναλόγων. / Oxytocin (OT) is a cyclic nonapeptide hormone of hypothalamus that is released into the general circulation from the posterior lobe of the pituitary gland. Its major physiological roles are: a) the ability to induce uterine constructions and b) milk injection. However, widespread distribution of OT receptors in the brain and specific behavioral effects of centrally applied OT, have firmly established a role of OT as a neurotransmitter modulating reproductive and social behaviors. The role of OT in preterm labor led to the search for and design of synthetic peptide antagonists as potential tocolytic agents. A number of those OT analogues synthesized and studied. However, only Atosiban was approved, in Europe only, under the trade name Tractocile™ for the treatment of preterm labor. The design of new OT analogues is based on consequences from structure-activity studies. Antagonistic activity depends on the configuration and the hydrophobicity of the amino acid in position 2. Additionally, the deficiency of the amino-group in position 1 leads to prolongation of the activity. Furthermore, Ile3 is important for the selective binding of OT to its receptor. Based on these findings and for the investigation of the role of position 3 on biological activities, we synthesized by the Fmoc/But solid phase methodology fourteen new analogues of OT. All the analogues contain β-mercaptopropionic acid (Mpa) position 1 and D-O-ethyl-tyrosine [D-Tyr(Et)] or D-1-naphthyl-alanine [D-Nal(1)] in position 2. Isoleucine (Ile) in position 3 has substituted by γ-aminoisobutyric acid (Aib), L- or D-α-tertbutyl-glycine [L-/D-Gly(But)], L- or D-3-pyridyl-alanine [L-/D-Pal(3)] and L- or D-β-(2-thienyl)-alanine (L-/D-Thi). Electro-spray MS was in agreement with the expected results. The analogues were tested for uterotonic activity in the rat uterus in vitro test, for pressor activity in the rat pressor assay and for the affinity to human OT receptor using [3H]OT. Also, the analogues [Mpa1, D-Tyr(Et)2, Thi3]OT, [Mpa1, D-Tyr(Et)2, D- Thi3]OT], [Mpa1, D-Nal(1)2, Thi3]OT and [Mpa1, D-Nal(1)2, D- Thi3]OT] were tested for the activity on the proliferation of MDA-MB-468 and MCF-7 cells. All the new analogues are antagonists of the hormone. In particular, the analogues [Mpa1, D-Nal(1)2, Gly(But)3]OT and [Mpa1, D-Nal(1)2, Thi3]OT have potent anti-uterotonic activity (pA2=8.34±0.30 and 8.50±0.24, respectively). As regards the tests of proliferation, we are unable to come to a sfe conclusion as far as the activity of the analogues is concerned.

Στην παρούσα διατριβή παρουσιάζεται η σύνθεση εικοσιεπτά νέων αναλόγων της ωκυτοκίνης (ΟΤ), τα οποία περιέχουν πέραν της Gly(But)8 ή/και Gly(But)9 και Gly(But)3 ή/και Gly(But)7, D-Cys6;ή Pen6, το μη φυσικό αμινοξύ α-αμινοϊσοβουτυρικό οξύ (Aib), το ιμινοξύ 1,2,3,4- τετραϋδροκινολινο-3-καρβοξυλικό οξύ (Tic) στη D- μορφή του στις θέσεις 7 ή/και 9 και τέλος τα παράγωγα D-Tyr(Et) και D-Nal(1) στη θέση 2. H σύνθεση των νέων αναλόγων έγινε σύμφωνα με την Fmoc/But μεθοδολογία σύνθεσης επί στερεάς φάσεως σε στερεό υπόστρωμα Rink Bernatowitz 2-χλωροτριτυλο-ρητίνη.Τα πεπτίδια δοκιμάστηκαν όσον αφορά στην ωκυτόκειο δράση in vitro, σε απομονωμένο ιστό μήτρας επίμυος ενώ η δοκιμή επί της πιέσεως πραγματοποιήθηκε σε επίμυες οι οποίοι είχαν επεξεργαστεί με φαινοξυβενζαμίνη. Τα νέα ανάλογα δοκιμάστηκαν και όσον αφορά στη συγγένεια τους με τον ανθρώπινο ωκυτόκειο υποδοχέα, η δοκιμή πραγματοποιήθηκε σε ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρικά κύτταρα (HEK) τα οποία υπερεκφράζουν τον υποδοχέα. Επιπρόσθετα, κάποια από τα ανάλογα αυτά δοκιμάστηκαν όσον αφορά στην επίδρασή τους στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του μαστού (MCF-7). Από τα προκαταρκτικά βιολογικά αποτελέσματα φαίνεται ότι τα συντεθέντα ανάλογα παρουσιάζουν στο σύνολό τους ανταγωνιστικές ιδιότητες, 10 εκ των οποίων παρουσίασαν ιδιαίτερα ισχυρή ανταγωνιστική δράση και εκλεκτικότητα εφ’ όσον στη δοκιμή επί της πιέσεως δεν εμφάνισαν δράση. Τα 10 αυτά ανάλογα εμφανίζουν ανταγωνιστική ισχυρότερη από αυτήν του Atosiban (pA2=8,29±0,05) και είναι εκλεκτικά. Επιπλέον, τρία από τα νέα ανάλογα (MOPACIN I,II και III) βρίσκονται σε διαδικασία κατοχύρωσης. Όσον αφορά την συγγένεια με τον ανθρώπινο υποδοχέα υπήρξε μια διαφοροποίηση μεταξύ των αποτελεσμάτων από τη βιολογική δράση και την συγγένεια με τον υποδοχέα, αφού ανάλογα με ισχυρή ανταγωνιστική δράση (π.χ. ανάλογο 23 με τιμή pA2 =8,31 και συγγένεια με τον υποδοχέα περισσότερο από 100 φορές χαμηλότερη σε σύγκριση με αυτή της φυσικής ορμόνης) εμφάνισαν χαμηλή συγγένεια με τον υποδοχέα. Η διαφοροποίση αυτή ίσως οφείλεται στις διαφορές μεταξύ των ειδών. Επιπρόσθετα, κάποια από τα ανάλογα αυτά δοκιμάστηκαν όσον αφορά στην επίδρασή τους στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του μαστού (MCF-7). Τα αποτελέσματα αυτών αποτελούν ένδειξη της βιολογικής δράσης των συνθετικών πεπτιδίων. Όμως χρειάζεται περισσό-τερη διερεύνηση ο ρόλος τους για την εξαγωγή ασφαλών συμπερασμάτων.Εν κατακλείδι, τα συμπεράσματα στα οποία καταλήγουμε, όσον αφορά στην παρούσα διατριβή προσφέρουν νέα δεδομένα όσον αφορά στη σύνθεση και τον σχεδιασμό νέων αναλόγων της ωκυτοκίνης τα οποία πιθανότατα θα αποτελέσουν και καλούς ανταγωνιστές με ενδεχόμενη θερα-πευτική/φαρμακευτική εφαρμογή. Επιπλέον, το εύρημα ότι η ωκυτοκίνη καθώς και τα ανάλογα αυτής μπορεί να εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό των νεοπλασματικών κυττάρων μπορεί να βρει εφαρμογή στην ραδιοαπεικόνιση διαφόρων νεοπλασμάτων, καθώς και στη θεραπεία αυτών. Επίσης ανάλογα της ωκυτοκίνης τα οποία παρουσιάζουν υψηλή συγγένεια με τον υποδοχέα μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως ραδιοϊχνηθέτες ή ως χημειοθεραπευτικοί φορείς. / In the present study we present the synthesis and pharmacological investigation of twenty seven newly synthesized oxytocin analogues. Basic modification at positions 7, 8 and 9 (in-troduction of α,α-dialkyl amino acid, α-aminoisobutyric acid [Aib] or the unnatural imino acid D-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-3-carboxylic acid [D-Tic] or tert-butyl-glycine [(But)Gly]) was combined with D-Cys6/Pen6, D-Tyr(Et)2, and D-Nal(1)2, Mpa1/Pen1 modifications and their various combinations.The new analogues were synthesized by Fmoc solid phase methodology utilizing a 2-chlorotrityl chloride resin as solid support bearing a Rink-Bernatowitz linker to provide the peptidic amide. The analogues were tested for their potency in two pharmacological tests, i.e. uterotonic in vitro test in the absence of magnesium ions on an isolated strip of rat uterus and in the pressοr test on phenoxybenzamine treated male rats. Parallel determination of binding affinity of the analogues to cloned human oxytocin recep-tors on HEK cell membranes using tritiated oxytocin from NEN Life Science, Boston, MA, USA was performed.We obtained a satisfactory number of quite potent and selective (as it concerns the binding with the vasopresor receptor V1a) oxytocin antagonists. Ten of these analogues showed higher antagonistic affinity than Atosiban (pA2=8.29) and they were completely inactive as far as it concerns the rat pressor test. Three of them (MOPACIN I, II and III) are under patent procedure. On the other hand, as it concerns the binding affinity and the biological evaluation, we observed a paradox phenomenon. Despite the high antagonistic potencies the affinity to the receptor was lower than oxytocin. This may be attributed to the species difference. Furthermore, some of the analogues were tested as far as it concerns their ability to in-crease or decrease the growth of MCF-7 breast cancer cells. The results indicate the ability of some analogues to decrease the growth of the MCF-7 breast cancer cells, but these re-sults need further investigation due to extract safe conclusions.Finally, the results from the presence study may aid in the design of novel and selective antagonists of oxytocin with pharmacological/pharmaceutical use. Furthermore, the evi-dence that some analogues have the ability to decrease the growth of MCF-7 cells, may find future applications in the radioimaging of different neoplasms, as wel as in their therapy, using oxytocin analogues that conserve high oxytocin receptor affinity as either radiotracers or chemiotherapeutic vectors.