Το Μετατρεπτικό Ένζυμο της Αγγειοτενσίνης (ACE, E.C. 3. 4. 15. 1) είναι μία μεταλλοπρωτεάση ψευδαργύρου που εμπλέκεται μέσω της καταλυτικής του δράσης στη λειτουργία του συστήματος Ρενίνης-Αγγειοτενσίνης (RAS), το οποίο είναι υπεύθυνο για τη ρύθμιση της αρτηριακής πίεσης. Το ACE καταλύει την υδρόλυση του βιολογικά ανενεργού δεκαπεπτιδίου Αγγειοτενσίνη Ι, αποσπώντας τo C-τελικό του διπεπτίδιο, μετατρέποντας το στο βιοδραστικό οκταπεπτίδιο Αγγειοτενσίνη ΙΙ. Η Αγγειοτενσίνη ΙΙ δρα στο αγγειακό σύστημα μέσω της άμεσης συστολής των αγγείων, με αποτέλεσμα την ταχεία αύξηση της αρτηριακής πίεσης. Επιπλέον, το ACE καταλύει και την υδρόλυση του αγγειοδιασταλτικού εννιαπεπτιδίου Βραδυκινίνη προς ανενεργά προϊόντα. Το ACE απαντάται στον ανθρώπινο οργανισμό σε δύο μορφές, το σωματικό και το σπερματικό τύπο. Ο σωματικός τύπος περιλαμβάνει δύο καταλυτικά κέντρα ψευδαργύρου υψηλής ομολογίας (Ν-ενεργό κέντρο και C-ενεργό κέντρο). Ο σπερματικός τύπος ένα καταλυτικό κέντρο ψευδαργύρου (C-ενεργό κέντρο). Στην παρούσα εργασία παρουσιάζεται η NMR διαμορφωτική μελέτη ενός πεπτιδίου 46 αμινοξέων αντιπροσωπευτικού του C-καταλυτικού κέντρου του ACE κατά την αλληλεπίδρασή του με το φυσικό υπόστρωμα Αγγειοτενσίνη Ι και τον αναστολέα Καπτοπρίλη, καθώς και η NMR μελέτη της αλληλεπίδρασης μέσω πειραμάτων τιτλοδότησης με σκοπό την διαπίστωση των φυσικοχημικών παραγόντων που διέπουν την αλληλεπίδραση ACE-Αγγειοτενσίνης Ι και Καπτοπρίλης. Αυτή η μελέτη βασίστηκε στη σύνθεση του πεπτιδίου των 46 αμινοξέων, η οποία έλαβε χώρα στο εργαστήριο Φαρμακογνωσίας & Χημείας Φυσικών Προϊόντων του Τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών. Ακολούθησε η ταυτοποίηση και αναγνώριση των αμινοξέων μέσω της συνδυασμένης ανάλυσης των 2D 1H-1H TOCSY και NOESY φασμάτων για το ACE σε ελεύθερη κατάσταση, σε σύμπλεξη με τον ψευδάργυρο, σε σύμπλεξη με τον ψευδάργυρο παρουσία Καπτοπρίλης, παρουσία Αγγειοτενσίνης Ι, παρουσία Αγγειοτενσίνης Ι και Καπτοπρίλης, καθώς και για την Αγγειοτενσίνη σε ελεύθερη κατάσταση, κατά την αλληλεπίδρασή της με το ACE και κατά την αλληλεπίδρασή της με το ACE παρουσία Καπτοπρίλης. Επίσης υπολογίστηκαν τα 3D μοντέλα της Αγγειοτενσίνης Ι σε ελεύθερη κατάσταση, κατά την αλληλεπίδρασή της με το ACE, κατά την αλληλεπίδρασή της με το ACE παρουσία Καπτοπρίλης, καθώς και το 3D μοντέλο του ACE κατά την αληλεπίδρασή του με την Αγγειοτενσίνη Ι. Τέλος, πραγματοποιήθηκε ανάλυση της διαταραχής των χημικών μετατοπίσεων. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης παρέχουν χρήσιμες πληροφορίες για τα αμινοξέα, τα οποία επηρεάζονται περισσότερο κατά την αλληλεπίδραση του C- καταλυτικού κέντρου του ACE και τα οποία πιθανότατα διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στον προσανατολισμό και τη δέσμευση είτε του αναστολέα Καπτοπρίλη είτε του φυσικού υποστρώματος Αγγειοτενσίνη Ι. Επομένως, θα μπορούσαν να αξιοποιηθούν στο σχεδιασμό νέων υποκαταστατών με ισχυρή συγγένεια δέσμευσης. / Angiotensin Converting Enzyme (ACE, E.C. 3. 4. 15. 1) is a zinc metalloprotease that is involved in the function of the Renin-Angiotensin System (RAS). The RAS system is responsible for the modulation of arterial blood pressure. ACE catalyzes the hydrolysis of the biologically inactive decapeptide Angiotensin I, by cleaving its C-terminal dipeptide converting it into the bioactive octapeptide Angiotensin II. Angiotensin II acts at the vessel system through the immediate contraction of blood vessels resulting into the rapid increase of arterial blood pressure. Furthermore, ACE catalyzes the hydrolysis of the vasodilator nonapeptide Bradykinin into non active products. ACE exists in the human organism in two isoforms. These are the somatic form and the testicular form. The first one contains two catalytic sites of high homology (Ncatalytic site and C-catalytic site). The second contains one catalytic site (C-catalytic site). The present dissertation reports the NMR conformational study of a 46 aminoacids peptide, which is representative of the C-catalytic site of ACE during its interaction with the natural substrate Angiotensin I and the inhibitor Captopril. It also presents the NMR study of the interaction by titration experiments in order to ascertain the physicochemical factors which govern the interaction between ACE-Angiotensin I and Captopril. This study is based on the synthesis of the 46 aminoacids peptide, which took place in the laboratory of Pharmacognosy & Chemistry of Natural Products at the Department of Pharmacy at the University of Patras. The following step of the dissertation is the assignment and identification of the aminoacids through combined analysis of the 2D 1H-1H TOCSY and NOESY spectrums of ACE in its free state, during its interaction with the zinc metal, during its interaction with the zinc metal in the presence of Captopril, in the presence of Angiotensin I, in the presence of both Angiotensin I and Captopril and also of Angiotensin I in its free state, during its interaction with ACE and during its interaction with ACE in the presence of Captopril. Moreover, the 3D models of Angiotensin I in its free state, during its interaction with ACE and during its interaction with ACE in the presence of Captopril are calculated, as well as the 3D model of ACE during its interaction with Angiotensin I. Finally, analysis of chemical shift perturbation is conducted. The results of this study provide useful information for aminoacids which are influenced the most during the interaction of the C-catalytic site of ACE and are possibly of crucial importance for the orientation and binding of either the inhibitor Captopril or the natural substrate Angiotensin I. As a result, all the above can be exploited in order to design new ligands with high binding affinity.

Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να αξιολογηθεί το αγγειομετατρεπτικό ένζυμο στον ορό των ασθενών με πνευμονία, ως διαγνωστικός ή/και προγνωστικός δείκτης της νόσου και γενικά να μελετηθούν οι διάφοροι προγνωστικοί παράγοντες στις λοιμώξεις του κατώτερου αναπνευστικού συστήματος. / Objective: The aim of this study was to determine prognostic factors of outcome in patients with lower respiratory tract infections (LRTIs). LRTIs are an heterogeneous group of disorders, including acute bronchitis, pneumonia, superinfection of chronic bronchitis and flu. The recent publications of several prognostic factors of outcome address specific conditions such as pneumonia or bronchitis, while general practitioners cannot usually differentiate between these conditions in current practice. Methodology: A total of 616 patients with LRTIs were retrospectively reviewed with regard to epidemiological, clinical, laboratory and radiographic data. The prognostic analysis included an univariate as well as a multivariate approach, in order to identify parameters associated with death. Results: The parameters found to be significantly different between survivors and non survivors in the univariate analysis, were respiratory rate (p<0,01), oxygen partial pressure (PaO2) (p<0,001), heart rate (p<0,0003), systolic and diastolic blood pressure (p<0,047 and (p<0,022, respectively), platelet count (p<0,045), urea (p<0,002), creatinine Objective: The aim of this study was to determine prognostic factors of outcome in patients with lower respiratory tract infections (LRTIs). LRTIs are an heterogeneous group of disorders, including acute bronchitis, pneumonia, superinfection of chronic bronchitis and flu. The recent publications of several prognostic factors of outcome address specific conditions such as pneumonia or bronchitis, while general practitioners cannot usually differentiate between these conditions in current practice. Methodology: A total of 616 patients with LRTIs were retrospectively reviewed with regard to epidemiological, clinical, laboratory and radiographic data. The prognostic analysis included an univariate as well as a multivariate approach, in order to identify parameters associated with death. Results: The parameters found to be significantly different between survivors and non survivors in the univariate analysis, were respiratory rate (p<0,01), oxygen partial pressure (PaO2) (p<0,001), heart rate (p<0,0003), systolic and diastolic blood pressure (p<0,047 and (p<0,022, respectively), platelet count (p<0,045), urea (p<0,002), creatinine (p<0,002), previous admission in the hospital the last year (p<0,033), and cavitations in chest radiograph (p<0,047). In multivariate analysis, the only statistically significant risk factors were PaO2 (odds ratio (OR) =0,8574; 95% confidence interval (CI) 0,7499-0,9802 in non survivors compared to survivors) and heart rate (OR=1,063; 95% CI 1,0052-1,1241 in non survivors compared to survivors). Conclusions: LRTIs remain a widespread problem and have a significant impact on primary healthcare resources. The great variability seen in rates of hospital admission and lengths of stay in part reflects uncertainty among physicians in assessing the severity of the illness. According to our data, PaO2 and heart rate, were most closely associated with death in patients with LRTIs. These predictor variables are all explicitly defined and can be readily assessed at the time of patient presentation.

Το σύνδρομο πολυκυστικών ωοθηκών (PCOS) αποτελεί την πιο συχνή ενδοκρινολογική διαταραχή των γυναικών αναπαραγωγικής ηλικίας που χαρακτηρίζεται από κεντρικού τύπου παχυσαρκία, ακμή , υπερτρίχωση και διαταραχές των εμμηνορησιακών κύκλων που οφείλονται στην υπερανδρογοναιμία και την χρόνια ανωοθυλακιορρηξία. Οι γυναίκες με PCOS αναπτύσσουν και μεταβολικού τύπου διαταραχές όπως η υπερινσουλιναιμία λόγω αντίστασης στην ινσουλίνη, η υπέρταση, ο σακχαρώδης διαβήτης, η δυσλιπιδαιμία και το μεταβολικό σύνδρομο. Σημαντικό ρόλο στην παθοφυσιολογία της των παραπάνω μεταβολικών διαταραχών ασκεί το σύστημα Ρενίνης-Αγγειοτενσίνης-Αλδοστερόνης (Renin-Angiotensin-Aldosterone System – RAAS) που διακρίνεται σε ενδοκρινές κι ιστικό. Στο ιντρόνιο 16 του γονιδίου του ενζύμου ACE(17q23) έχει βρεθεί ο πολυμορφισμός I/D που προκύπτει από την παρουσία ( Insertion– I) ή την απουσία (Deletion–D) μιας Αlu αλληλουχίας μήκους 287 bp, δημιουργώντας τρείς διακριτούς γονότυπους: II, ID και DD Με δεδομένο το ρόλο του συστήματος RAAS σε σχέση με τους παράγοντες κινδύνου για καρδιαγγειακή νόσο και κυρίως με την αντίσταση στην ινσουλίνη, ο ρόλος του πολυμορφισμού ACE I/D έχει καταστεί αντικείμενο μελέτης ως προς την εκδήλωση καρδιαγγειακών συμβαμάτων. Στην παρούσα μελέτη προσδιορίστηκε ο πολυμορφισμός ACE I/D σε 156 φυσιολογικές γυναίκες και σε 212 γυναίκες με την πιο βαριά μορφή του συνδρόμου πολυκυστικών ωοθηκών που είναι η ύπαρξη βιοχημικής υπερανδρογοναιμίας και χρόνιας ανωοθυλακιορηξίας. Το συμπέρασμα μετά τη στατιστική ανάλυση ήταν ότι ο γονότυπος ΙΙ συνδέεται στατιστικώς σημαντικά με την την αντίσταση στην ινσουλίνη κι ο γονότυπος ΙD με τα επίπεδα της 17-OH προγεστερόνης, πρόδρομης ορμόνης κατά την βιοσύνθεση των ανδρογόνων που ίσως σημαίνει με τοπικά αυξημένη ενεργότητα του RAS. Tα ευρήματα αυτά ανάγουν τον πολυμορφισμό της ACE σε ένα πιθανά πολύτιμο δείκτη αυξημένου καρδιαγγειακού κινδύνου στις γυναίκες με PCOS. / The polycystic ovary syndrome (PCOS) is the most common endocrine disorder of women of reproductive age, characterized by central obesity, acne, hirsutism and disorders menstrual cycles due to hyperandrogonemia and chronic anovulation. Women with PCOS develop type and metabolic disorders such as hyperinsulinemia due to insulin resistance, hypertension, diabetes mellitus, dyslipidemia and metabolic syndrome. Important role in the pathophysiology of these metabolic disorders has the renin-angiotensin-aldosterone system (Renin-Angiotensin-Aldosterone System - RAAS), which is divided into endocrine and tissue. In intron 16 of the gene of the enzyme ACE (17q23) has found a polymorphism I / D resulting from the presence (Insertion-I) or absence (Deletion-D) of an Alu sequence length of 287 bp, creating three distinct genotypes: II,ID,DD. Given the role of the RAAS system in relation to risk factors for cardiovascular disease and especially with insulin resistance, the role of polymorphism ACE I / D has become a subject of study as to the occurrence of cardiovascular events. This study identified a polymorphism ACE I / D in 156 healthy women and 212 women with the most severe form of polycystic ovarian syndrome is the presence of biochemical hyperandrogonemia and chronic anovulation. The conclusion after statistical analysis was that the II genotype is associated statistically significant with insulin resistance and ID genotype with levels of 17-OH progesterone hormone precursor in the biosynthesis of androgens which it might means locally increased activity of RAS. These findings suggest the polymorphism of the ACE in a potentially valuable indicator of increased cardiovascular risk in women with PCOS.

Το γονίδιο του ανθρώπινου μετατρεπτικού ενζύμου της αγγειοτενσίνης ACE περιέχει έναν πολυμορφισμό δύο αλληλομόρφων που αποτελείται είτε από την παρουσία (I) είτε από την απουσία (D) ενός τμήματος 287 ζευγών βάσεων (bp). Πρόσφατες μελέτες έχουν προτείνει ότι το αλληλόμορφο Ι, μπορεί να σχετίζεται με απόδοση σχετιζόμενη με τη μυϊκή αντοχή. Αντιθέτως, το αλληλόμορφο D γονίδιο έχει συσχετισθεί με απόδοση σχετιζόμενη με τη μυϊκή ισχύ. Επιπλέον, έχει καταδειχθεί ότι η δραστικότητα του κυκλοφορούντος ACE (cACE) συσχετίζεται ευθέως με τη μυική ισχύ σε υγιείς ενήλικες. Η φυσιολογία και η βιοχημεία των αναπνευστικών μυών είναι παρόμοια με αυτή των σκελετικών μυών. Επομένως, η λειτουργικότητα των αναπνευστικών μυών και ιδίως του διαφράγματος, του πλέον σημαντικού αναπνευστικού μυ, μπορεί να επηρεάζεται αναλόγως. Η κόπωση των αναπνευστικών μυών μπορεί να οδηγεί σε αδυναμία διατήρησης του απαραίτητου κυψελιδικού αερισμού. Διάφορες μέθοδοι έχουν χρησιμοποιηθεί για να αξιολογηθούν οι ιδιότητες αντοχής των αναπνευστικών μυών. Ο διαφραγματικός δείκτης πίεσης-χρόνου (PTIdi) και ο μη επεμβατικός δείκτης πίεσης-χρόνου των αναπνευστικών μυών (PTImus), είναι δύο μέθοδοι εκτίμησης της αντοχής του διαφράγματος και των αναπνευστικών μυών, αντίστοιχα. Έχουν χρησιμοποιηθεί σε ενήλικες και παιδιά και έχουν τεκμηριωθεί σε νεογνά. Η διαφραγματική ισχύς και η ισχύς των αναπνευστικών μυών στα νεογνά μπορεί να αξιολογηθούν ειδικά με τη μέτρηση της μέγιστης δια-διαφραγματικής πίεσης (Pdimax) και της μεγίστης εισπνευστικής πίεσης αεραγωγών (Pimax), αντίστοιχα. Σκοπός. Να εξετασθεί η πιθανή συσχέτιση του πολυμορφισμού I/D του ACE και του κυκλοφορούντος ACE με την λειτουργικότητα του διαφράγματος και των αναπνευστικών μυών σε νεογνά. Δευτερεύων σκοπός ήταν ο προσδιορισμός της κατανομής του πολυμορφισμού I/D του ACE στον συγκεκριμένο πληθυσμό και η συσχέτισή του με την δραστικότητα του cACE. Υλικό και Μέθοδοι. Μελετήθηκαν νεογνά που είχαν εισαχθεί στην Μονάδα Εντατικής Νοσηλείας Νεογνών- Παιδιατρική κλινική του Πανεπιστημίου Πατρών. Τα Ι και D αλληλόμορφα του γονιδίου του ACE προσδιορίστηκαν με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR amplification) σε DNA το οποίο εξήχθη από 0,5 mL ολικού αίματος. Η δραστηριότητα του ACE ορού αξιολογήθηκε με τη χρησιμοποίηση μιας UV κινητικής μεθόδου. Η αντοχή του διαφράγματος και των αναπνευστικών μυών εκτιμήθηκαν με μέτρηση του διαφραγματικού δείκτη πίεση-χρόνου (PTIdi) και του δείκτη πίεσης-χρόνου των αναπνευστικών μυών (PTImus), αντίστοιχα. Η διαφραγματική ισχύς και η ισχύς των αναπνευστικών μυών στα νεογνά αξιολογήθηκαν με μέτρηση της μέγιστης δια-διαφραγματικής πίεσης (Pdimax) και της μεγίστης εισπνευστικής πίεσης αεραγωγών (Pimax), αντίστοιχα. Αποτελέσματα. Συνολικά εξετάστηκαν 171 νεογνά. Στην πρώτη μελέτη της διατριβής μελετήθηκαν 148 νεογνά, στην δεύτερη μελέτη 132 και στην τρίτη μελέτη 110 νεογνά. Η κατανομή του πολυμορφισμού του ACE στο συγκεκριμένο πληθυσμό βρέθηκε κοντά σε προηγούμενα αναφερόμενα στοιχεία. Τα νεογνά με Ι/Ι γονότυπο είχαν χαμηλότερο PTIdi και PTImus από τα νεογνά με γονοτύπους είτε D/D ή I/D. Η ανάλυση των επιμέρους στοιχείων των PTIdi και PTImus έδειξε ότι μόνο οι λόγοι Pdimean (μέση διαδιαφραγματική πίεση) προς Pdimax και Pimean (μέση πίεση αεραγωγών) προς Pimax, αντίστοιχα, ήταν χαμηλότεροι σε νεογνά με γονότυπο I/I έναντι των νεογνών με γονοτύπους είτε D/D είτε I/D. Οι Pdimax και Pimax δεν ήταν στατιστικά διαφορετικές ανάμεσα στις τρείς ομάδες. Ανάλυση βηματικής παλινδρόμησης κατέδειξε σημαντική συσχέτιση των γονότυπων του ACE με τις τιμές του PTIdi και του PTImus, ανεξαρτήτως παραγόντων που θα μπορούσαν να επηρεάσουν την λειτουργικότητα του διαφράγματος και των αναπνευστικών μυών. Νεογνά με το D/D γονότυπο είχαν αυξημένη δραστικότητα ACE ορού σε σχέση με νεογνά με I/I ή I/D γονοτύπους. Η δραστικότητα του cACE σχετιζόταν σημαντικά ευθέως με τη Pimax και αντιστρόφως με το PTImus. Συμπεράσματα. Στις μελέτες αυτής της διατριβής ανεδείχθη συσχέτιση ανάμεσα στους γονοτύπους του ACE και την αντοχή του διαφράγματος και γενικότερα των αναπνευστικών μυών όπως αξιολογείται με τη μέτρηση των PTIdi και PTImus, αντίστοιχα, σε νεογνά. Δεν ανεδείχθη συσχέτιση ανάμεσα στους γονοτύπους του ACE και την ισχύ του διαφράγματος και γενικότερα των αναπνευστικών μυών όπως αξιολογείται με τη μέτρηση των Pdimax και Pimax, αντίστοιχα, σε αυτό τον πληθυσμό. Εντούτοις, κατεδείχθη μια θετική συσχέτιση μεταξύ της δραστικότητας του ACE ορού και της ισχύος των αναπνευστικών μυών, όπως αυτή αξιολογείται από μετρήσεις της Pimax , και μια αρνητική συσχέτιση ανάμεσα στη δραστικότητα του ACE ορού και του PTImus. Επιπλέον, δείχθηκε μια συσχέτιση του αλληλόμορφου D γονιδίου του γονοτύπου ACE με την αυξημένη δραστικότητα του cACE στα νεογνά. / The human ACE (angiotensin converting enzyme) gene contains a polymorphism consisting of either the presence (insertion, I) or absence (deletion, D) of a 287 base pair (bp) fragment. Recent studies have suggested that the I-allele may be associated with endurance performance. Conversely, D-allele has been associated with power-oriented performance. Moreover, it has been suggested that circulating ACE (cACE) activity is correlated with muscle strength in healthy adults. The physiological and biochemical properties of the respiratory and skeletal muscles are quite similar. Therefore, respiratory muscle and specific diaphragmatic function, may be similarly influenced. Fatigue of respiratory muscles may result in inability to maintain adequate alveolar ventilation. Several methods have been used to assess the endurance properties of respiratory muscles. Diaphragmatic pressure-time index (PTIdi) and the non-invasive pressure-time index of respiratory muscles (PTImus), are two methods of assessment of diaphragmatic and respiratory muscle endurance, respectively. They have been validated in both adults and infants. Diaphragmatic and respiratory muscle strength in infants can be assessed specifically, by measurement of maximum transdiaphragmatic pressure (Pdimax) and maximum inspiratory pressure (Pimax), respectively. Aims. To examine the possible association of the I/D genotypes of ACE and cACE, with diaphragmatic and respiratory muscle performance, in infants. Secondary aims were to identify the distribution of the I/D genotypes of ACE in the specific population and its association with cACE activity. Material and methods. Infants cared for at the Neonatal Intensive Care Unit- Paediatric Department of the University General Hospital of Patras, Greece, were eligible for the study. ACE genotyping was performed by polymerase chain reaction amplification on DNA, extracted from 0,5 ml of whole blood. Serum ACE activity was assayed by using a UV-kinetic method. The endurance of the diaphragm and the respiratory muscles was assessed by measurement of diaphragmatic pressure-time index (PTIdi) and pressure-time index of the respiratory muscles (PTImus), respectively. Diaphragmatic and respiratory muscle strength was assessed by measurement of maximum transdiaphragmatic (Pdimax) and maximum inspiratory (Pimax) pressures, respectively. Results. One hundred seventy one infants were recruited. One hundred fourty eight infants were included in the first study, one hundred thirty two in the second study and one hundred ten in the third study of this thesis. The distribution of the I/D genotypes of ACE in the specific population was close to previous reported data. Infants with I/I ACE genotype had lower PTIdi and PTImus than infants with either D/D or I/D genotypes. Analysis of the components of the PTIdi and PTImus has shown that the ratios of Pdimean to Pdimax and Pimean to Pimax , only, were lower in infants with the I/I genotype, compared to infants with either the D/D or I/D genotypes. Neither Pdimax, nor Pimax were statistically different between the three groups. A stepwise regression analysis revealed that ACE genotypes were significantly related to the PTIdi and PTImus measurements, independent of other factors that may affect diaphragmatic and respiratory muscle function. Infants with D/D genotype had significantly higher serum ACE activity than infants with I/I or I/D genotypes. Circulating ACE activity was significantly related to Pimax and inversely related to PTImus. Conclusions. In the studies of this thesis, an association between ACE genotypes and the endurance of the diaphragm and the respiratory muscles, assessed by measurement of PTIdi and PTImus, respectively, was demonstrated, in infants. No such association was demonstrated between ACE genotypes and strength of the diaphragm and the respiratory muscles, assessed by measurement of Pdimax and Pimax, respectively, in the specific population. However, a positive correlation between serum ACE activity and respiratory muscle strength, assessed by measurement of Pimax and and a negative correlation between serum ACE activity and PTImus, was shown. Moreover, an association of D-allele of ACE genotype with increased circulating ACE activity in infants, was demonstrated.

Το μετατρεπτικό ένζυμο της αγγειοτενσίνης (ACE) είναι μία διπεπτιδυλκαρβοξυπεπτιδάση ψευδαργύρου που ανήκει στην οικογένεια των gluzincin πεπτιδασών της οποίας η θερμολυσίνη θεωρείται ως πρωτότυπο μέλος. Το ένζυμο πήρε το όνομά του από τη δυνατότητά του να μετατρέπει το βιολο- γικώς ανενεργό δεκαπεπτίδιο αγγειοτενσίνη-Ι στο οκταπεπτίδιο αγγειοτεν- σίνη-ΙΙ, το οποίο εμφανίζει ισχυρή αγγειοσυσπαστική δράση. Μία άλλη βασική δυνατότητα του ACE είναι η αδρανοποιήση του εννεαπεπτιδίου βραδυκινίνη που έχει αγγειοδιασταλτική δράση. Αυτές οι δύο σημαντικές ιδιότητες του ACE το καθιστούν ένα από τα σημαντικότερα συστατικά του συστήματος ρενίνης-αγγειοτενσίνης-αλδοστερόνης. Υπάρχουν δύο ισομορφές του ACE που μεταγράφονται από το ίδιο γονίδιο κατά τρόπο ιστοειδικό. Η σωματική ισομορφή του ACE, η οποία εμφανίζεται στην επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων, είναι μία γλυκοπρωτεΐνη η οποία αποτελείται από μία ενιαία, πολυπεπτιδική αλυσίδα 1306 αμινοξέων. Η σπερματική ισομορφή που εμφανίζεται στους όρχεις και στα κύτταρα σπέρματος είναι μία χαμηλότερης-μοριακής μάζας γλυκοπρωτεΐνη 732 αμινοξέων. Η σωματική ισομορφή αποτελείται από δύο ομόλογες περιοχές (περιοχή Ν και C). Κάθε περιοχή περιέχει ένα ενεργό κέντρο με ένα συντηρημένο δεσμευτικό μοτίβο ψευδαργύρου HEXXH, όπου οι δύο ιστιδίνες είναι οι δύο πρώτοι υποκαταστάτες του ιόντος ψευδαργύρου. Μετά από 24 αμινοξέα στην αλληλουχία του μορίου, βρίσκεται ένα γλουταμινικό οξύ που είναι ο τρίτος υποκαταστάτης του ιόντος ψευδαργύρου. Η ύπαρξη αυτών των Ν- και C- περιοχών είναι πιθανότατα το αποτέλεσμα ενός αρχέγονου γεγονότος διπλασιασμού γονιδίων το οποίο έλαβε χώρα κατά την διάρκεια της εξέλιξης των σπονδυλωτών. Οι δύο περιοχές εμφανίζουν εκλεκτικότητα έναντι διαφόρων υποστρωμάτων, αναστολέων και διαφορές στην απαιτούμενη συγκέντρωση ιόντων χλωρίου προκειμένου να έχουν καταλυτική δραστικότητα. Υπάρχουν δύο υποστρώματα τα οποία εμφανίζουν εκλεκτικότητα έναντι του Ν-ενεργού κέντρου: το Ν-ακετυλ-σερυλασπαραγυλο-λυσυλ-προλυλ πεπτίδιο, το οποίο ρυθμίζει τη διαφοροποίηση και τον πολλαπλασιασμό των πολυδύναμων αιμοποιητικών κυττάρων και το πεπτίδιο αγγειοτενσίνη-(1-7) που είναι το αποτέλεσμα της δράσης της βραδυκινίνης. Αφ' ετέρου, τα ενεργά κέντρα και των δύο περιοχών καταλύουν την υδρόλυση της αγγειοτενσίνης-Ι και τη βραδυκινίνης με παρόμοια αποτελασματικότητα. Εντούτοις, η αναστολή του Ν-ενεργού κέντρου με το φωσφινικό πεπτίδιο RXP407 δεν έχει καμία επίδραση στην ρύθμιση της αρτηριακής πίεσης. Διαγονιδιακά ποντίκια τα οποία εκφράζουν μόνο το Ν-ενεργό κέντρο εμφανίζουν φαινότυπο παρόμοιο με αυτόν που εμφανίζεται σε ποντίκια στα οποία το γονιδίο του ACE έχει απαλειφθεί πλήρως. Κατά συνέπεια, το C-ενεργό κέντρο φαίνεται να είναι απαραίτητο και σημαντικό για τον έλεγχο της αρτηριακής πίεσης και της καρδιαγγειακής λειτουργίας. Η σπερματική ισομορφή του ACE είναι πανομοιότυπη με την C-περιοχή της σωματικής εκτός από μία μοναδική ακολουθία 36 αμινοξέων που βρίσκεται στο Ν-τελικό άκρο του. Επίσης έχει αποδειχθεί ότι η σπερματική ισομορφή του ACE διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην ωρίμανση του σπέρματος και στη δέσμευση αυτού στο επιθήλιο του ωαγωγού των ωοθηκών. Ο στόχος αυτής της διατριβής ήταν α) η υπερέκφραση, σε βακτηριακά κύτταρα, ο καθαρισμός και η λήψη σε διαλυτή μορφή δύο πεπτιδίων του ACE μεγέθους 108 αμινοξέων(Ala361-Gly468 (ACE_N), Ala959-Ser1066 (ACE_C)). Αυτή η πειραματική προσέγγιση επελέγη λόγω της ευκολίας χειρισμού και καλλιέργειας που εμφανίζουν τα βακτηριακά κύτταρα και λόγω της δυνατότητας της χρήση επισημασμένων με 15Ν ή/και 13C θρεπτικών μέσων. β) Η κατοχή ενός τόσο μεγάλου πεπτιδίου σε διάλυμα, επισημασμένο ή μη, δίνει τη δυνατότητα μελέτης του ως προς τα δομικά χαρακτηριστικά του χρησιμοποιώντας τη φασματοσκοπία κυκλικού διχροϊσμού ή/και πυρηνικού μαγνητικού συντονισμου (NMR). Τα προαναφερθέντα πρωτεϊνικά τμήματα υπερεκφράστηκαν σε βακτηριακά κύτταρα και ελήφθησαν σε καθαρή μορφή. Η καθαρότητά τους ήταν μεγαλύτερη από 99%. Η απόδοση για το πρωτεϊνικό τμήμα ACE_N ήταν 9mg και για το πρωτεϊνικό τμήμα ACE_C ήταν 6mg από 1L καλλιέργειας βακτηριακών κυττάρων. Τα τμήματα αυτά μελετήθηκαν ως προς την δευτεροταγή τους διαμόρφωση με φασματοσκοπία κυκλικού διχρωϊσμού. Τα αποτελέσματα της μελέτης αυτής έδειξαν ότι παρουσία 1,1,1-τριφθοροαιθανόλης, σε συγκέντρωση μεγαλύτερη από 60% και τα δύο τμήματα λαμβάνουν διαμόρφωση η οποία βρίσκεται σε συμφωνία με τη θεωρητικώς υπολογιζόμενη και με αυτή που έχει βρεθεί από κρυσταλλογραφικές μελέτες του ενζύμου. Το αποτέλεσμα αυτό μερικώς επιβεβαιώθηκε για το πρωτεϊνικό τμήμα ACE_N με τη μελέτη αυτού με φασματοσκοπία Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμόυ. Η πλήρης επιβεβαίωση δεν κατέστει δυνατή λόγω της αδυναμίας λήψης καλής ποιότητας φάσματος 2D-NOESY. Συμπερασματικά, η περιγραφόμενη σε αυτή τη Διατριβή μεθοδολογία εμφανίζει πλεονεκτήματα όσον αφορά την ταχύτητα παραγωγής, τη δυνατότητα καθαρισμού των παραγομένων πεπτιδίων, καθώς και καλή επαναληψιμότητα. Οι in vitro επαναδιατεταγμένες ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες εμφάνισαν χαρακτηριστικά δευτεροταγούς δομής, όμοια σχεδόν με αυτά που έχουν αποκαλυφθεί από την κρυσταλλογραφική μελέτη του ACE, έχοντας υψηλό ποσοστό σε α-έλικα. Κατά συνέπεια, αυτή η μελέτη περιγράφει ένα αποτελεσματικό σύστημα για την παραγωγή μεγάλων ποσοτήτων καθαρών πεπτιδίων του ACE που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για διάφορες μελέτες. / Angiotensin converting enzyme (ACE) is a gluzincin zinc dipeptidyl carboxypeptidase I, of which thermolysin is considered the prototypical member. This enzyme took its name from its ability to convert the decapeptide Angiotensin-I to octapeptide Angiotensin-II, which is a highly potent vasoconstrictor. Another basic ability is to inactivate bradykinin, a vasodilatory peptide. These two major activities render ACE through the renin– angiotensin–aldosterone system. There are two isoforms of ACE that are transcribed from the same gene in a tissue-specific manner. Somatic ACE, which is present in brush-border epithelial cells and endothelial cells, exists as a glycoprotein composed of a single, large polypeptide chain of 1,306 amino acids, whereas in sperm cells it is a lower-molecular-mass glycoform of 732 amino acids. The somatic form consists of two homologous domains (N and C domain). Each domain contains an active site with a conserved HEXXH zinc binding motif, where the two histidines are zinc ligands, with a glutamate 24 residues downstream forming the third ligand. These N- and C-domains most likely are the result of an ancient gene duplication event that occurred during vertebrate evolution. The two domains differ in their substrate specificities, inhibitor, chloride activation profiles, and physiological functions. There are two N-domainspecific substrates: the peptide N-acetyl-serylaspartyl-lysyl-proline, which regulates haematopoietic stem cell differentiation and proliferation; and the bradykinin-potentiating peptide angiotensin-(1-7). On the other hand, the active sites of both domains catalyse the hydrolysis of angiotensin I and the vasodilator bradykinin with similar efficiency. However, inhibition of the N domain with a phosphinic peptide RXP407 has no effect on blood pressure regulation and expression in transgenic mice of the N domain alone produces a phenotype similar to that seen in complete ACE knockout mice. Thus, the C domain seems to be necessary and sufficient for controlling blood pressure and cardiovascular function, suggesting that the C domain is the dominant angiotensin-converting site. Testis ACE is identical to the Cterminal half of somatic ACE, except for a unique 36-residue sequence constituting its amino terminus. It has also been shown that testis ACE is thought to play a role in sperm maturation and the binding of sperm to the oviduct epithelium. Objective of this thesis was the overexpression, in bacterial cells, purification and solubilazation of two ACE peptides of 108 aa (Ala361-Gly468 (ACE_N), Ala959-Ser1066 (ACE_C)). This experimental approach was chosen because of the ease of culturing bacterial cells and the advantage of using label mediums with 15N and/or 13C. Such large peptides labelled or nonlabelled, can be studied for their structural features using circular dichroism and/or NMR spectroscopy. The above mentioned protein fragments overexpressed in bacteria and purified. Their purity was greater than 99%. The yield was 9mg for ACE_N and 6mg for ACE_C protein fragment from 1L bacterial culture. Their secondary structure was studied using circular dichroism spectroscopy. Deconvolution of ACE_N and ACE_C CD spectra had shown that the presence of trifluoroethanol, at concentrations of 60% or higher, is necessary for the correct folding of the protein. This result was partially confirmed for ACE_N protein fragment by Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy. Complete conformation was not succeded due to the inability of recording the 2DNOESY spectrum of ACE_N. Conclusively, the described procedure in this research proved to be advantageous in speed and facility of purification. It demonstrated good reproductively for ACE peptides during purification. The in vitro refolded recombinant proteins had almost identical secondary features compared with these found using crystallographic data, with a high content in a-helix secondary structure motif. Thus, this study offers an effective system for producing large amounts of pure ACE peptides which can be used for several studies.