Το Μετατρεπτικό Ένζυμο της Αγγειοτενσίνης (ACE, E.C. 3. 4. 15. 1) είναι μία μεταλλοπρωτεάση ψευδαργύρου που εμπλέκεται μέσω της καταλυτικής του δράσης στη λειτουργία του συστήματος Ρενίνης-Αγγειοτενσίνης (RAS), το οποίο είναι υπεύθυνο για τη ρύθμιση της αρτηριακής πίεσης. Το ACE καταλύει την υδρόλυση του βιολογικά ανενεργού δεκαπεπτιδίου Αγγειοτενσίνη Ι, αποσπώντας τo C-τελικό του διπεπτίδιο, μετατρέποντας το στο βιοδραστικό οκταπεπτίδιο Αγγειοτενσίνη ΙΙ. Η Αγγειοτενσίνη ΙΙ δρα στο αγγειακό σύστημα μέσω της άμεσης συστολής των αγγείων, με αποτέλεσμα την ταχεία αύξηση της αρτηριακής πίεσης. Επιπλέον, το ACE καταλύει και την υδρόλυση του αγγειοδιασταλτικού εννιαπεπτιδίου Βραδυκινίνη προς ανενεργά προϊόντα. Το ACE απαντάται στον ανθρώπινο οργανισμό σε δύο μορφές, το σωματικό και το σπερματικό τύπο. Ο σωματικός τύπος περιλαμβάνει δύο καταλυτικά κέντρα ψευδαργύρου υψηλής ομολογίας (Ν-ενεργό κέντρο και C-ενεργό κέντρο). Ο σπερματικός τύπος ένα καταλυτικό κέντρο ψευδαργύρου (C-ενεργό κέντρο). Στην παρούσα εργασία παρουσιάζεται η NMR διαμορφωτική μελέτη ενός πεπτιδίου 46 αμινοξέων αντιπροσωπευτικού του C-καταλυτικού κέντρου του ACE κατά την αλληλεπίδρασή του με το φυσικό υπόστρωμα Αγγειοτενσίνη Ι και τον αναστολέα Καπτοπρίλη, καθώς και η NMR μελέτη της αλληλεπίδρασης μέσω πειραμάτων τιτλοδότησης με σκοπό την διαπίστωση των φυσικοχημικών παραγόντων που διέπουν την αλληλεπίδραση ACE-Αγγειοτενσίνης Ι και Καπτοπρίλης. Αυτή η μελέτη βασίστηκε στη σύνθεση του πεπτιδίου των 46 αμινοξέων, η οποία έλαβε χώρα στο εργαστήριο Φαρμακογνωσίας & Χημείας Φυσικών Προϊόντων του Τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών. Ακολούθησε η ταυτοποίηση και αναγνώριση των αμινοξέων μέσω της συνδυασμένης ανάλυσης των 2D 1H-1H TOCSY και NOESY φασμάτων για το ACE σε ελεύθερη κατάσταση, σε σύμπλεξη με τον ψευδάργυρο, σε σύμπλεξη με τον ψευδάργυρο παρουσία Καπτοπρίλης, παρουσία Αγγειοτενσίνης Ι, παρουσία Αγγειοτενσίνης Ι και Καπτοπρίλης, καθώς και για την Αγγειοτενσίνη σε ελεύθερη κατάσταση, κατά την αλληλεπίδρασή της με το ACE και κατά την αλληλεπίδρασή της με το ACE παρουσία Καπτοπρίλης. Επίσης υπολογίστηκαν τα 3D μοντέλα της Αγγειοτενσίνης Ι σε ελεύθερη κατάσταση, κατά την αλληλεπίδρασή της με το ACE, κατά την αλληλεπίδρασή της με το ACE παρουσία Καπτοπρίλης, καθώς και το 3D μοντέλο του ACE κατά την αληλεπίδρασή του με την Αγγειοτενσίνη Ι. Τέλος, πραγματοποιήθηκε ανάλυση της διαταραχής των χημικών μετατοπίσεων. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης παρέχουν χρήσιμες πληροφορίες για τα αμινοξέα, τα οποία επηρεάζονται περισσότερο κατά την αλληλεπίδραση του C- καταλυτικού κέντρου του ACE και τα οποία πιθανότατα διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στον προσανατολισμό και τη δέσμευση είτε του αναστολέα Καπτοπρίλη είτε του φυσικού υποστρώματος Αγγειοτενσίνη Ι. Επομένως, θα μπορούσαν να αξιοποιηθούν στο σχεδιασμό νέων υποκαταστατών με ισχυρή συγγένεια δέσμευσης. / Angiotensin Converting Enzyme (ACE, E.C. 3. 4. 15. 1) is a zinc metalloprotease that is involved in the function of the Renin-Angiotensin System (RAS). The RAS system is responsible for the modulation of arterial blood pressure. ACE catalyzes the hydrolysis of the biologically inactive decapeptide Angiotensin I, by cleaving its C-terminal dipeptide converting it into the bioactive octapeptide Angiotensin II. Angiotensin II acts at the vessel system through the immediate contraction of blood vessels resulting into the rapid increase of arterial blood pressure. Furthermore, ACE catalyzes the hydrolysis of the vasodilator nonapeptide Bradykinin into non active products. ACE exists in the human organism in two isoforms. These are the somatic form and the testicular form. The first one contains two catalytic sites of high homology (Ncatalytic site and C-catalytic site). The second contains one catalytic site (C-catalytic site). The present dissertation reports the NMR conformational study of a 46 aminoacids peptide, which is representative of the C-catalytic site of ACE during its interaction with the natural substrate Angiotensin I and the inhibitor Captopril. It also presents the NMR study of the interaction by titration experiments in order to ascertain the physicochemical factors which govern the interaction between ACE-Angiotensin I and Captopril. This study is based on the synthesis of the 46 aminoacids peptide, which took place in the laboratory of Pharmacognosy & Chemistry of Natural Products at the Department of Pharmacy at the University of Patras. The following step of the dissertation is the assignment and identification of the aminoacids through combined analysis of the 2D 1H-1H TOCSY and NOESY spectrums of ACE in its free state, during its interaction with the zinc metal, during its interaction with the zinc metal in the presence of Captopril, in the presence of Angiotensin I, in the presence of both Angiotensin I and Captopril and also of Angiotensin I in its free state, during its interaction with ACE and during its interaction with ACE in the presence of Captopril. Moreover, the 3D models of Angiotensin I in its free state, during its interaction with ACE and during its interaction with ACE in the presence of Captopril are calculated, as well as the 3D model of ACE during its interaction with Angiotensin I. Finally, analysis of chemical shift perturbation is conducted. The results of this study provide useful information for aminoacids which are influenced the most during the interaction of the C-catalytic site of ACE and are possibly of crucial importance for the orientation and binding of either the inhibitor Captopril or the natural substrate Angiotensin I. As a result, all the above can be exploited in order to design new ligands with high binding affinity.

Στην παρούσα διατριβή μελετάται η ροή βιομαγνητικών ρευστών υπό την επίδραση μαγνητικού πεδίου. Ως βιομαγνητικό ορίζεται ένα ρευστό το οποίο υπάρχει σε έναν έμβιο οργανισμό και η ροή του επηρεάζεται πάντοτε από την παρουσία μαγνητικού πεδίου. Χαρακτηριστικό βιομαγνητικό ρευστό θεωρείται το αίμα και αυτό χρησιμοποιείται για να δωθούν τιμές στις παραμέτρους που εμφανίζονται στα προβλήματα που μελετώνται.... / - / The flow of biomagnetic fluids in the presence of an applied magnetic field is studied in the present thesis. As biomagnetic is defined a fluid that exists in a living creature (biofluid) and its flow is affected by the presence of a magnetic field. The most characteristic biofluid is the blood. The Newtonian viscous laminar incompressible blood flow is considered in the present thesis for the estimation of the parameters appearing in the problems under consideration. An introduction is made at the first chapter of the thesis concerning fundamental concepts of the magnetic fluids such as the magnetization and equilibrium flow. Experimental applications in the biomedicine are also given as well as the mathematical model describing the flow of biological fluids under the influence of an applied magnetic field. In order to investigate the effect of the magnetic field in the next three chapters basic flow problems of biomagnetic fluid (blood) are studied. In the second chapter the flow over a stretching sheet under the influence of an applied magnetic field is studied. The physical problem is described by a coupled system of non linear partial differential equations (pdes) with their appropriate boundary conditions. For the variation of the magnetization with the temperature and/or the magnetic field intensity two cases are considered (I and II). The arising system describing the physical problem is transformed into corresponding coupled systems of non linear ordinary differential equations (ods) after the introduction of proper non dimensional variables. For the numerical solution, finite differences are used for the case I, whereas a spectral method with Chebyshev polynomials is also used for the case II. It is apparent that the application of the magnetic field increases the skin friction and the pressure on the surface, whereas the heat transfer is reducing. A comparison is also made between the two numerical methods used in the case II. The efficiency and the accuracy of the spectral method over against the finite differences method are demonstrated. The superiority of the spectral method is apparent especially when high accuracy solution is desired. In the third chapter the fundamental problem of the biomagnetic fluid flow taking place in a rectangular duct under the influence of an applied magnetic field is studied. For the numerical solution of the problem, which is described by a coupled and non linear system of PDEs, with their appropriate boundary conditions, the stream function-vorticity formulation is adopted and the solution is obtained developing an efficient numerical technique based on the upwind finite differences joint with a line by line implicit method. Results concerning the velocity and temperature field, skin friction and rate of heat transfer indicate that the presence of magnetic field appreciable influence the flow field. The three dimensional, fully developed flow of a biomagnetic fluid in an impermeable rectangular duct under the influence of an applied magnetic field is numerically studied in the fourth chapter. The system of the partial differential equations, resulting after the introduction of appropriate non-dimensional variables, is solved applying an efficient numerical technique based on a pressure-linked pseudotransient method on a collocated grid. Results concerning the existence and the uniqueness of the solution are also given. The obtained results, for different values for the parameters entering into the problem under consideration, show that the flow is appreciably influenced by the presence of the magnetic field in the sense of reduction of the axial velocity and the formation of two vortices at the transverse plane. These first results indicate that the magnetic field significantly influences the blood flow and encourage further study in more complex geometries, oscillatory flow or including the non-Newtonian behaviour of blood in order to demonstrate applications in biomechanics and biomedicine.

Το μετατρεπτικό ένζυμο της αγγειοτενσίνης (ACE) είναι μία διπεπτιδυλκαρβοξυπεπτιδάση ψευδαργύρου που ανήκει στην οικογένεια των gluzincin πεπτιδασών της οποίας η θερμολυσίνη θεωρείται ως πρωτότυπο μέλος. Το ένζυμο πήρε το όνομά του από τη δυνατότητά του να μετατρέπει το βιολο- γικώς ανενεργό δεκαπεπτίδιο αγγειοτενσίνη-Ι στο οκταπεπτίδιο αγγειοτεν- σίνη-ΙΙ, το οποίο εμφανίζει ισχυρή αγγειοσυσπαστική δράση. Μία άλλη βασική δυνατότητα του ACE είναι η αδρανοποιήση του εννεαπεπτιδίου βραδυκινίνη που έχει αγγειοδιασταλτική δράση. Αυτές οι δύο σημαντικές ιδιότητες του ACE το καθιστούν ένα από τα σημαντικότερα συστατικά του συστήματος ρενίνης-αγγειοτενσίνης-αλδοστερόνης. Υπάρχουν δύο ισομορφές του ACE που μεταγράφονται από το ίδιο γονίδιο κατά τρόπο ιστοειδικό. Η σωματική ισομορφή του ACE, η οποία εμφανίζεται στην επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων, είναι μία γλυκοπρωτεΐνη η οποία αποτελείται από μία ενιαία, πολυπεπτιδική αλυσίδα 1306 αμινοξέων. Η σπερματική ισομορφή που εμφανίζεται στους όρχεις και στα κύτταρα σπέρματος είναι μία χαμηλότερης-μοριακής μάζας γλυκοπρωτεΐνη 732 αμινοξέων. Η σωματική ισομορφή αποτελείται από δύο ομόλογες περιοχές (περιοχή Ν και C). Κάθε περιοχή περιέχει ένα ενεργό κέντρο με ένα συντηρημένο δεσμευτικό μοτίβο ψευδαργύρου HEXXH, όπου οι δύο ιστιδίνες είναι οι δύο πρώτοι υποκαταστάτες του ιόντος ψευδαργύρου. Μετά από 24 αμινοξέα στην αλληλουχία του μορίου, βρίσκεται ένα γλουταμινικό οξύ που είναι ο τρίτος υποκαταστάτης του ιόντος ψευδαργύρου. Η ύπαρξη αυτών των Ν- και C- περιοχών είναι πιθανότατα το αποτέλεσμα ενός αρχέγονου γεγονότος διπλασιασμού γονιδίων το οποίο έλαβε χώρα κατά την διάρκεια της εξέλιξης των σπονδυλωτών. Οι δύο περιοχές εμφανίζουν εκλεκτικότητα έναντι διαφόρων υποστρωμάτων, αναστολέων και διαφορές στην απαιτούμενη συγκέντρωση ιόντων χλωρίου προκειμένου να έχουν καταλυτική δραστικότητα. Υπάρχουν δύο υποστρώματα τα οποία εμφανίζουν εκλεκτικότητα έναντι του Ν-ενεργού κέντρου: το Ν-ακετυλ-σερυλασπαραγυλο-λυσυλ-προλυλ πεπτίδιο, το οποίο ρυθμίζει τη διαφοροποίηση και τον πολλαπλασιασμό των πολυδύναμων αιμοποιητικών κυττάρων και το πεπτίδιο αγγειοτενσίνη-(1-7) που είναι το αποτέλεσμα της δράσης της βραδυκινίνης. Αφ' ετέρου, τα ενεργά κέντρα και των δύο περιοχών καταλύουν την υδρόλυση της αγγειοτενσίνης-Ι και τη βραδυκινίνης με παρόμοια αποτελασματικότητα. Εντούτοις, η αναστολή του Ν-ενεργού κέντρου με το φωσφινικό πεπτίδιο RXP407 δεν έχει καμία επίδραση στην ρύθμιση της αρτηριακής πίεσης. Διαγονιδιακά ποντίκια τα οποία εκφράζουν μόνο το Ν-ενεργό κέντρο εμφανίζουν φαινότυπο παρόμοιο με αυτόν που εμφανίζεται σε ποντίκια στα οποία το γονιδίο του ACE έχει απαλειφθεί πλήρως. Κατά συνέπεια, το C-ενεργό κέντρο φαίνεται να είναι απαραίτητο και σημαντικό για τον έλεγχο της αρτηριακής πίεσης και της καρδιαγγειακής λειτουργίας. Η σπερματική ισομορφή του ACE είναι πανομοιότυπη με την C-περιοχή της σωματικής εκτός από μία μοναδική ακολουθία 36 αμινοξέων που βρίσκεται στο Ν-τελικό άκρο του. Επίσης έχει αποδειχθεί ότι η σπερματική ισομορφή του ACE διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην ωρίμανση του σπέρματος και στη δέσμευση αυτού στο επιθήλιο του ωαγωγού των ωοθηκών. Ο στόχος αυτής της διατριβής ήταν α) η υπερέκφραση, σε βακτηριακά κύτταρα, ο καθαρισμός και η λήψη σε διαλυτή μορφή δύο πεπτιδίων του ACE μεγέθους 108 αμινοξέων(Ala361-Gly468 (ACE_N), Ala959-Ser1066 (ACE_C)). Αυτή η πειραματική προσέγγιση επελέγη λόγω της ευκολίας χειρισμού και καλλιέργειας που εμφανίζουν τα βακτηριακά κύτταρα και λόγω της δυνατότητας της χρήση επισημασμένων με 15Ν ή/και 13C θρεπτικών μέσων. β) Η κατοχή ενός τόσο μεγάλου πεπτιδίου σε διάλυμα, επισημασμένο ή μη, δίνει τη δυνατότητα μελέτης του ως προς τα δομικά χαρακτηριστικά του χρησιμοποιώντας τη φασματοσκοπία κυκλικού διχροϊσμού ή/και πυρηνικού μαγνητικού συντονισμου (NMR). Τα προαναφερθέντα πρωτεϊνικά τμήματα υπερεκφράστηκαν σε βακτηριακά κύτταρα και ελήφθησαν σε καθαρή μορφή. Η καθαρότητά τους ήταν μεγαλύτερη από 99%. Η απόδοση για το πρωτεϊνικό τμήμα ACE_N ήταν 9mg και για το πρωτεϊνικό τμήμα ACE_C ήταν 6mg από 1L καλλιέργειας βακτηριακών κυττάρων. Τα τμήματα αυτά μελετήθηκαν ως προς την δευτεροταγή τους διαμόρφωση με φασματοσκοπία κυκλικού διχρωϊσμού. Τα αποτελέσματα της μελέτης αυτής έδειξαν ότι παρουσία 1,1,1-τριφθοροαιθανόλης, σε συγκέντρωση μεγαλύτερη από 60% και τα δύο τμήματα λαμβάνουν διαμόρφωση η οποία βρίσκεται σε συμφωνία με τη θεωρητικώς υπολογιζόμενη και με αυτή που έχει βρεθεί από κρυσταλλογραφικές μελέτες του ενζύμου. Το αποτέλεσμα αυτό μερικώς επιβεβαιώθηκε για το πρωτεϊνικό τμήμα ACE_N με τη μελέτη αυτού με φασματοσκοπία Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμόυ. Η πλήρης επιβεβαίωση δεν κατέστει δυνατή λόγω της αδυναμίας λήψης καλής ποιότητας φάσματος 2D-NOESY. Συμπερασματικά, η περιγραφόμενη σε αυτή τη Διατριβή μεθοδολογία εμφανίζει πλεονεκτήματα όσον αφορά την ταχύτητα παραγωγής, τη δυνατότητα καθαρισμού των παραγομένων πεπτιδίων, καθώς και καλή επαναληψιμότητα. Οι in vitro επαναδιατεταγμένες ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες εμφάνισαν χαρακτηριστικά δευτεροταγούς δομής, όμοια σχεδόν με αυτά που έχουν αποκαλυφθεί από την κρυσταλλογραφική μελέτη του ACE, έχοντας υψηλό ποσοστό σε α-έλικα. Κατά συνέπεια, αυτή η μελέτη περιγράφει ένα αποτελεσματικό σύστημα για την παραγωγή μεγάλων ποσοτήτων καθαρών πεπτιδίων του ACE που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για διάφορες μελέτες. / Angiotensin converting enzyme (ACE) is a gluzincin zinc dipeptidyl carboxypeptidase I, of which thermolysin is considered the prototypical member. This enzyme took its name from its ability to convert the decapeptide Angiotensin-I to octapeptide Angiotensin-II, which is a highly potent vasoconstrictor. Another basic ability is to inactivate bradykinin, a vasodilatory peptide. These two major activities render ACE through the renin– angiotensin–aldosterone system. There are two isoforms of ACE that are transcribed from the same gene in a tissue-specific manner. Somatic ACE, which is present in brush-border epithelial cells and endothelial cells, exists as a glycoprotein composed of a single, large polypeptide chain of 1,306 amino acids, whereas in sperm cells it is a lower-molecular-mass glycoform of 732 amino acids. The somatic form consists of two homologous domains (N and C domain). Each domain contains an active site with a conserved HEXXH zinc binding motif, where the two histidines are zinc ligands, with a glutamate 24 residues downstream forming the third ligand. These N- and C-domains most likely are the result of an ancient gene duplication event that occurred during vertebrate evolution. The two domains differ in their substrate specificities, inhibitor, chloride activation profiles, and physiological functions. There are two N-domainspecific substrates: the peptide N-acetyl-serylaspartyl-lysyl-proline, which regulates haematopoietic stem cell differentiation and proliferation; and the bradykinin-potentiating peptide angiotensin-(1-7). On the other hand, the active sites of both domains catalyse the hydrolysis of angiotensin I and the vasodilator bradykinin with similar efficiency. However, inhibition of the N domain with a phosphinic peptide RXP407 has no effect on blood pressure regulation and expression in transgenic mice of the N domain alone produces a phenotype similar to that seen in complete ACE knockout mice. Thus, the C domain seems to be necessary and sufficient for controlling blood pressure and cardiovascular function, suggesting that the C domain is the dominant angiotensin-converting site. Testis ACE is identical to the Cterminal half of somatic ACE, except for a unique 36-residue sequence constituting its amino terminus. It has also been shown that testis ACE is thought to play a role in sperm maturation and the binding of sperm to the oviduct epithelium. Objective of this thesis was the overexpression, in bacterial cells, purification and solubilazation of two ACE peptides of 108 aa (Ala361-Gly468 (ACE_N), Ala959-Ser1066 (ACE_C)). This experimental approach was chosen because of the ease of culturing bacterial cells and the advantage of using label mediums with 15N and/or 13C. Such large peptides labelled or nonlabelled, can be studied for their structural features using circular dichroism and/or NMR spectroscopy. The above mentioned protein fragments overexpressed in bacteria and purified. Their purity was greater than 99%. The yield was 9mg for ACE_N and 6mg for ACE_C protein fragment from 1L bacterial culture. Their secondary structure was studied using circular dichroism spectroscopy. Deconvolution of ACE_N and ACE_C CD spectra had shown that the presence of trifluoroethanol, at concentrations of 60% or higher, is necessary for the correct folding of the protein. This result was partially confirmed for ACE_N protein fragment by Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy. Complete conformation was not succeded due to the inability of recording the 2DNOESY spectrum of ACE_N. Conclusively, the described procedure in this research proved to be advantageous in speed and facility of purification. It demonstrated good reproductively for ACE peptides during purification. The in vitro refolded recombinant proteins had almost identical secondary features compared with these found using crystallographic data, with a high content in a-helix secondary structure motif. Thus, this study offers an effective system for producing large amounts of pure ACE peptides which can be used for several studies.