Η βρουκέλλα, ένα προαιρετικώς ενδοκυττάριο βακτήριο που προκαλεί μελιταίο πυρετό, ενδοκαρδίτιδα, αρθρίτιδα και οστεομυελίτιδα στους ανθρώπους, εγκαθιστά χρόνιες λοιμώξεις μολύνοντας, επιβιώνοντας και πολλαπλασιαζόμενη σε διαφόρους τύπους κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των μονοκυττάρων και των δενδριτικών κυττάρων. Οι B. abortus, B. melitensis και B. suis είναι τα κύρια είδη που προκαλούν βρουκέλλωση στους ανθρώπους και η B. melitensis προκαλεί την πλειονότητα των περιστατικών και την πιο βαριά συμπτωματολογία. Η ικανότητα της βρουκέλλας να παραμένει στα μολυσμένα κύτταρα εξαρτάται από την ιδιότητά της να αποφεύγει ή να αλληλεπιδρά με στοιχεία των απαντήσεων της φυσικής και επίκτητης ανοσίας. Η αρχική άμυνα του ξενιστή έναντι βακτηριακών λοιμώξεων διεγείρεται από PAMP, που αναγνωρίζονται από τον ξενιστή. Πληθώρα αποδείξεων εμπλέκουν διαφορετικά μέλη της οικογένειας των TLR στην αναγνώριση της βρουκέλλας και/ή στην εκκαθάριση της λοιμώξεως. Ένας απαραίτητος κλάδος των σηματοδοτικών οδών που ξεκινά από τους TLR είναι η οικογένεια των MAP κινασών. Οι MAP κινάσες διαμεσολαβούν κυτταρικές απαντήσεις σε ποικιλία εξωτερικών διεγέρσεων, όπως το φυσικό στρες, οι φλεγμονώδεις κυτταροκίνες, οι αυξητικοί παράγοντες και συστατικά των βακτηρίων. Αντικείμενο της μελέτης ήταν η διερεύνηση της ενορχήστρωσης των απαντήσεων της φυσικής ανοσίας έναντι ζωντανών παθογόνων κλινικών στελεχών B. melitensis σε ανθρώπινα μονοκύτταρα από τις MAP κινάσες. Αρχικά απεδείχθη ότι η βρουκέλλα προκάλεσε ισχυρή προφλεγμονώδη απάντηση με αποτέλεσμα την απελευθέρωση υψηλών επιπέδων IL-1β, IL-6 και TNF-α και ταυτοχρόνως πυροδότησε έντονη, μικρής διαρκείας αντιφλεγμονώδη απάντηση. Δηλαδή, η ζωντανή βρουκέλλα δεν αποφεύγει την αρχική αναγνώριση και κινητοποιεί ισχυρή προφλεγμονώδη απάντηση από τη φυσική ανοσία. Επιπλέον, η παραγωγή TNF-α, IL-6 και IL-10 που προκλήθηκε από τη βρουκέλλα ανεστάλη παρουσία αντι-TLR2, ενώ παρέμεινε ανεπηρέαστη παρουσία αντι-TLR4 αντισώματος. Η IL-1β δεν επηρεάστηκε από την εξουδετέρωση είτε του TLR2 ή του TLR4. Η διακοπή της σηματοδότησης διαμέσου του TLR2, αλλά όχι του TLR4, μείωσε σημαντικά την ενεργοποίηση αμφοτέρων των p38 και ERK ως απάντηση στη μόλυνση με βρουκέλλα. Επιπρόσθετα, η παραγωγή IL-1β από μονοκύτταρα μολυσμένα με βρουκέλλα παρέμεινε ανεπηρέαστη από την προσθήκη αναστολέων των MAP κινασών. Αναστολή της p38 ελάττωσε σημαντικά την παραγωγή IL-6 και εμπόδισε σχεδόν πλήρως την απελευθέρωση TNF-α, ενώ αναστολή της ERK1/2 μείωσε αξιοσημείωτα και τις δύο. Αναστολή της JNK δεν επηρέασε την παραγωγή TNF-α και IL-6. Η παραγωγή IL-10 μειώθηκε σημαντικά από αναστολή των p38 ή JNK, αλλά όχι από αυτήν της MAP2K. Τα συγκεκριμένα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η ενεργοποίηση των MAP κινασών είναι σημαντικό ενδοκυττάριο στάδιο στην παραγωγή κυτταροκινών στην πορεία της βρουκελλώσεως. Τέλος, η ενεργοποίηση των MAP κινασών επηρεάζει την επιβίωση της βρουκέλλας εντός των ανθρωπίνων μονοκυττάρων. Η αναστολή της p38 ή της JNK κατέστειλε σχεδόν πλήρως την αύξηση της βρουκέλλας, ενώ αναστολή της ERK δεν μείωσε τον πολλαπλασιασμό της. Συμπερασματικά, καταδεικνύεται ότι η λοίμωξη με B. melitensis προκαλεί όψιμη ενεργοποίηση των ERK και p38 η οποία επηρεάζει την απελευθέρωση κυτταροκινών διαμέσου του TLR2. Ακόμη, η δράση των MAP κινασών είναι επωφελής για τον πολλαπλασιασμό της βρουκέλλας εντός των ανθρωπίνων μονοκυττάρων. Οι MAP κινάσες ενδέχεται να επηρεάζουν διαφορετικούς μηχανισμούς που εμπλέκονται στην ενδοκυττάρια επιβίωση της B. melitensis. Επί παραδείγματι, εμπλέκονται στη μεταφορά στο πρώιμο ενδόσωμα, την πρώιμη οξίνιση του φαγοσώματος, τη σηματοδότηση της επαγωγής του εκκριτικού συστήματος τύπου IV VirB ή τη ρύθμιση της σηματοδότησης της αυτοφαγίας. Τρέχουσες έρευνες του εργαστηρίου εξετάζουν τα συγκεκριμένα ενδεχόμενα. / Brucella, a facultative intracellular bacterium that causes undulant fever, endocarditis, arthritis and osteomyelitis in humans, establishes chronic infections by infecting, surviving and replicating in different cell types, including macrophages and dendritic cells. B. abortus, B. melitensis and B. suis are the main species that cause human brucellosis, with B. melitensis causing the majority of cases and the most severe symptoms. The capacity of Brucella to persist in infected cells depends on its stealthy strategy to avoid or interfere with components of the host innate and acquired immune responses. Initial host defenses against bacterial infection are stimulated by PAMPs, which are recognized by the host. Ample evidence implicates the different members of TLR family in recognition of Brucella and/or clearance of infection. One essential branch of signaling cascades initiated by TLR is the ubiquitously expressed family of MAPKs. MAPKs mediate cellular responses to a variety of extracellular stimuli, such as physical stress, inflammatory cytokines, growth factors and bacterial components. Object of the study was the investigation of MAPK orchestration of the innate immune response against pathogenic live clinical strains of B. melitensis in fresh human monocytes. Initially it has been shown that Brucella induced a strong pro-inflammatory response resulting in the release of high levels of IL-1β, IL-6 and TNF-α and simultaneously triggered a strong anti-inflammatory response that lasted for a short time. Namely, live Brucellae do not avoid the initial recognition and trigger a strong inflammatory response. Moreover, TNF-α, IL-6 and IL-10 production induced by Brucella was strongly inhibited in the presence of anti-TLR2, whereas it remained unaffected by the presence of anti-TLR4. IL-1β was not influenced either by TLR2 or TLR4 neutralization. Blocking by anti-TLR2, but not anti-TLR4, markedly reduced both p38 and ERK activation to basal levels in response to Brucella infection. Additionally, IL-1β production by Brucella-infected monocytes remained unaffected by the addition of MAPK inhibitors. Inhibition of p38 significantly diminished IL-6 production and almost completely prevented TNF-α release, whereas inhibition of ERK1/2 significantly reduced both. JNK inhibition had no effect on TNF-α and IL-6 production. IL-10 production was markedly reduced by p38 or JNK inhibition, but not MAP2K. These results suggest that MAPK activation is an important intracellular event leading to cytokine production in the course of Brucella infection. Finally, MAPK activation affects the survival of Brucella in human monocytes. Inhibition of p38 or JNK almost completely repressed Brucella growth, whereas inhibition of ERK did not reduce the multiplication rate of Brucella. In conclusion, it has been demonstrated that infection with B. melitensis induces a late activation of ERK and p38 that affects cytokine release in a TLR2-dependent manner. Moreover, MAPK activity is beneficial for replication of Brucella inside human monocytes. MAPK activation could affect a number of mechanisms involved in the intracellular survival of B. melitensis. MAPK activity is involved in the transport to the early endosome, early acidification of the phagosome, signaling for induction of the VirB Type IV secretion system, or regulation of the autophagic pathway. Current studies in our laboratory investigate these possibilities.

Τα τελευταία χρόνια μελετώνται εκτενώς οι μηχανισμοί της κυτταροφαγίας που εμπλέκονται στην άμυνα τόσο των θηλαστικών όσο και των εντόμων και οι οποίοι είναι συντηρημένοι εξελικτικά. Στο εργαστήριο της Βιολογίας Κυττάρου έχουν γίνει αρκετά και μεγάλα βήματα προς την κατεύθυνση της διερεύνησης του μηχανισμού της κυτταροφαγίας από τα αιμοκύτταρα των εντόμων, αλλά σίγουρα η πλήρης κατανόηση του μηχανισμού αυτού χρειάζεται πολλά πειράματα ακόμη. Πρόσφατα δεδομένα του εργαστηρίου μας φανέρωσαν πως το σύστημα ενεργοποίησης της προφαινολοξειδάσης στην επιφάνεια των αιμοκυττάρων, κατέχει κυρίαρχο ρόλο στην διαδικασία της κυτταροφαγίας. Η φαινολοξειδάση είναι το τελευταίο προϊόν του συστήματος ενεργοποίησης της προφαινολοξειδάσης. Συνθέτεται στα αιμοκύτταρα και παρουσιάζεται στην επιφάνεια των αιμοκυττάρων ως ανενεργό ζυμογόνο. Η αναστολή της δράσης της φαινολοξειδάσης έχει ως αποτέλεσμα μια σημαντική μείωση της κυτταροφαγίας. Η φαινολοξειδάση συμμετέχει επίσης στη διαδικασία της μελανοποίησης (μέσω της μετατροπής της τυροσίνης σε Dopa) και το σχηματισμό των οζιδίων ως μηχανισμού άμυνας. Τα δεδομένα αυτά, μας ώθησαν να μελετήσουμε αν η αποκαρβοξυλάση της Dopa που μετατρέπει την Dopa σε ντοπαμίνη, βρίσκεται και αυτή στην επιφάνεια των αιμοκυττάρων της μύγας της Μεσογείου και αν συμμετέχει στις διαδικασίες της κυτταροφαγίας, του σχηματισμό οζιδίων και της μελανοποίησης, που είναι μηχανισμοί εγγενούς άμυνας των εντόμων. Επίσης, μελετήσαμε και κατά πόσο η αιμολίνη, μια πρωτεΐνη αναγνώρισης μοριακών προτύπων που έχει δειχτεί ότι βρίσκεται σε ορισμένα λεπιδόπτερα, υπάρχει και στα αιμοκύτταρα της μύγας της Μεσογείου και συμμετέχει στην κυτταροφαγία των παθογόνων. / -

Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να αξιολογηθεί το αγγειομετατρεπτικό ένζυμο στον ορό των ασθενών με πνευμονία, ως διαγνωστικός ή/και προγνωστικός δείκτης της νόσου και γενικά να μελετηθούν οι διάφοροι προγνωστικοί παράγοντες στις λοιμώξεις του κατώτερου αναπνευστικού συστήματος. / Objective: The aim of this study was to determine prognostic factors of outcome in patients with lower respiratory tract infections (LRTIs). LRTIs are an heterogeneous group of disorders, including acute bronchitis, pneumonia, superinfection of chronic bronchitis and flu. The recent publications of several prognostic factors of outcome address specific conditions such as pneumonia or bronchitis, while general practitioners cannot usually differentiate between these conditions in current practice. Methodology: A total of 616 patients with LRTIs were retrospectively reviewed with regard to epidemiological, clinical, laboratory and radiographic data. The prognostic analysis included an univariate as well as a multivariate approach, in order to identify parameters associated with death. Results: The parameters found to be significantly different between survivors and non survivors in the univariate analysis, were respiratory rate (p<0,01), oxygen partial pressure (PaO2) (p<0,001), heart rate (p<0,0003), systolic and diastolic blood pressure (p<0,047 and (p<0,022, respectively), platelet count (p<0,045), urea (p<0,002), creatinine Objective: The aim of this study was to determine prognostic factors of outcome in patients with lower respiratory tract infections (LRTIs). LRTIs are an heterogeneous group of disorders, including acute bronchitis, pneumonia, superinfection of chronic bronchitis and flu. The recent publications of several prognostic factors of outcome address specific conditions such as pneumonia or bronchitis, while general practitioners cannot usually differentiate between these conditions in current practice. Methodology: A total of 616 patients with LRTIs were retrospectively reviewed with regard to epidemiological, clinical, laboratory and radiographic data. The prognostic analysis included an univariate as well as a multivariate approach, in order to identify parameters associated with death. Results: The parameters found to be significantly different between survivors and non survivors in the univariate analysis, were respiratory rate (p<0,01), oxygen partial pressure (PaO2) (p<0,001), heart rate (p<0,0003), systolic and diastolic blood pressure (p<0,047 and (p<0,022, respectively), platelet count (p<0,045), urea (p<0,002), creatinine (p<0,002), previous admission in the hospital the last year (p<0,033), and cavitations in chest radiograph (p<0,047). In multivariate analysis, the only statistically significant risk factors were PaO2 (odds ratio (OR) =0,8574; 95% confidence interval (CI) 0,7499-0,9802 in non survivors compared to survivors) and heart rate (OR=1,063; 95% CI 1,0052-1,1241 in non survivors compared to survivors). Conclusions: LRTIs remain a widespread problem and have a significant impact on primary healthcare resources. The great variability seen in rates of hospital admission and lengths of stay in part reflects uncertainty among physicians in assessing the severity of the illness. According to our data, PaO2 and heart rate, were most closely associated with death in patients with LRTIs. These predictor variables are all explicitly defined and can be readily assessed at the time of patient presentation.

Η ανοσολογική απάντηση και κυρίως η κυτταρική ανοσία, κατέχει σημαντικό ρόλο στην παθογένεια της λοίμωξης τόσο από τον ιό της ηπατίτιδας Β όσο και από τον ιό της ηπατίτιδας C. Στην παρούσα μελέτη εκτιμήθηκε η κυτταρική ανοσία, όπως αυτή εκφράζεται από τους Τ λεμφοκυτταρικούς υποπληθυσμούς (CD3, CD4, CD8) στο περιφερικό αίμα και στον ηπατικό ιστό ασθενών με χρόνια ηπατίτιδα Β (ΧΗΒ) και χρόνια ηπατίτιδα C (XHC). Οι ασθενείς με ΧΗΒ χωρίσθηκαν σε δύο κατηγορίες, ανάλογα με την ενεργότητα της νόσου (ασθενείς με χρόνια ενεργό ηπατίτιδα και ασυμπτωματικοί φορείς της νόσου). Επίσης μετρήθηκαν οι κυτταροκίνες του περιφερικού αίματος ( IFN-γ, TNF-a, IL-10, IL-5, IL-12, IL-6, IL-1b, IL-4, IL-8, IL-2) στις παραπάνω ομάδες ασθενών. Μέτρηση των Τ λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών και των κυτταροκινών έγινε στους ασθενείς με ενεργό ΧΗΒ και XHC πριν και μετά την έναρξη της αντιϊκής αγωγής. Όσο αφορά τους Τ κυτταρικούς υποπληθυσμούς του περιφερικού αίματος δεν προέκυψε διαφορά στους ασθενείς με ενεργό ΧΗΒ και ασυμπτωματικών φορέων της νόσου. Αντίθετα, σημαντική αύξηση των Τ κυτταρικών υποπληθυσμών, ιδιαίτερα στο επίπεδο των CD8 κυττάρων διαπιστώθηκε στους ασθενείς με XHC τόσο στο περιφερικό αίμα όσο και στο ηπατικό ιστό σε σχέση με τους ασθενείς με ΧΗΒ. Όσο αφορά τον ηπατικό ιστό υπήρξε άμεση συσχέτιση των CD3 κυττάρων με τη πυλαία φλεγμονή και τη λοβιακή δραστηριότητα και στις δύο ομάδες ασθενών, ενώ άμεση συσχέτιση των CD8 κυττάρων με τη πυλαία φλεγμονή και τη λοβιακή δραστηριότητα παρατηρήθηκε μόνο στους ασθενείς με XHC. Από τη μέτρηση των κυτταροκινών του περιφερικού αίματος προκύπτει αύξηση της IFN-γ, TNF-a, IL-10, IL-5 στους ασυμπτωματικούς φορείς της ηπατίτιδας β σε σχέση με τους ασθενείς με ενεργότητα ενώ σχετικά με τους ασθενείς με XHC και ενεργό ηπατίτιδα β, σημαντική αύξηση του TNF-a και μείωση της IL-4 και IL-12 στους ασθενείς με XHC. Δεν παρατηρήθηκε διαφορά στους Τ κυτταρικούς πληθυσμούς και στις κυτταροκίνες του περιφερικού αίματος στους ασθενείς με ΧΗΒ και XHC πριν και μετά την έναρξη αντιϊκής αγωγής. Από τα αποτελέσματα της μελέτης προκύπτει ότι οι ασθενείς με ΧΗΒ και XHC επιδεικνύουν διαφορετικό ανοσολογικό προφίλ όσο αφορά τους Τ κυτταρικούς υποπληθυσμούς στο περιφερικό αίμα και στον ηπατικό ιστό. Φαίνεται ότι η ανάπτυξη ανεπαρκούς ανοσολογικής απάντησης είναι υπεύθυνη για τη μη αποτελεσματική ιϊκή κάθαρση και την εξέλιξη της ηπατικής βλάβης στους ασθενείς με ΧΗΒ, ενώ αντίθετα στους ασθενείς με XHC η νόσος εξελίσσεται παρά την παρουσία ανοσολογικής απάντησης που είναι πιο έντονη στο επίπεδο των CD8 κυττάρων. Παρόμοια αποτελέσματα προκύπτουν και από τη μέτρηση των κυτταροκινών του περιφερικού αίματος. Έτσι, όσο αφορά την XHC φαίνεται ότι η νόσος εξελίσσεται παρά την παρουσία μιας έντονης Th1 απάντησης, ενώ στους ασθενείς με ενεργό ΧΗΒ φαίνεται ότι υπερτερεί η Th2 απάντηση. Στους ασθενείς με χρόνια ηπατίτιδα β, φαίνεται ότι το υψηλό ιικό φορτίο μπορεί να οδηγήσει σε διαταραχή της λειτουργικότητας των Τ λεμφοκυττάρων, όσο αφορά την παραγωγή IFN-γ που οδηγεί σε εξέλιξη της νόσου και ενεργό ιϊκό πολλαπλασιασμο. / The aim of this study was to evaluate the immune response in peripheral blood and liver, through the measurement of T cell subsets and serum cytokines, in patients with chronic active hepatitis B, asymptomatic HBV carriers and chronic hepatitis C. Thirty four patients with chronic hepatitis B (21 with active hepatitis and 13 asymptomatic carriers) and twenty one patients with chronic hepatitis C were enrolled in the study. We also evaluated 21 biopsies from patients with active CHB and 21 biopsies from patients with CHC. We measured CD3, CD4, CD8 T cell lymphocytes in peripheral blood and liver tissue as well serum cytokines (IFN-γ, TNF-a, IL-10, IL-5, IL-12, IL-6, IL-1b, IL-4, IL-8, IL-2) in these patients. We also evaluated the T – cell subsets and serum cytokines in patients with active CHB and CHC before and after the onset of antiviral therapy. We found no differences in the numbers of all T cells lymphocytes in peripheral blood between patients with active CHB and asymptomatic carriers. In contrast, we found a significant increase in the numbers of T cell subsets in CHC compared to CHB patients. We also found a significant increase in the number of T cell subsets in the area of portal tracts and lobules in CHC patients compared to CHB patients. In both groups there was a direct correlation between CD3 cells in portal tracts and lobules and HAI score but a direct correlation between CD8 cells and HAI score was found only in CHC patients. Regarding cytokine profile, patients with chronic active disease presented significantly decreased levels of IFN-γ, TNF-alpha, IL-10 and IL-5 as compared to inactive carriers. Also, a significant negative correlation between serum hepatitis B viral load and IFN-γ levels was noted. No correlation was found between viral load and the other cytokines. Patients with CHC presented significantly increased levels of TNF-alpha and significantly decreased levels of IL-12 and IL-4 as compared to patients with active hepatitis b infection. We found no difference in T – cell subsets and serum cytokines before and after the onset of antiviral therapy. Insufficient cellular immune response is critical for the ineffective virus clearance and liver damage in active CHB, while in CHC, immune response is present in peripheral blood and liver. However, there is an immunological escape of HCV, which seems to survive in the presence of an adequate immune response. Also, patients with active hepatitis B and HBsAg inactive carriers seem to display different cytokine profile. Decreased Th1 response observed in patients with active hepatitis B could be implicated in the persistence of virus replication and ongoing progression of liver disease. Hepatitis B viral load seems to be an important factor for T cell dysfunction, as expressed through reduced IFN-γ production.