Τα αρνητικά και θετικά κατά Gram βακτήρια E. coli και S. αureus αντίστοιχα αναγνωρίζονται και δεσμεύονται στην επιφάνεια των αιμοκυττάρων της C. capitata. Η πρόσδεση των βακτηρίων ενεργοποιεί τόσο τις β1 ιντεγκρίνες, όσο και σηματοδοτικά μονοπάτια που περιλαμβάνουν τα μόρια μεταγωγής σήματος Ras, FAK, Src και MAP κινάσες. Οι παραπάνω ενεργοποιήσεις, σε συνδυασμό με τη συμμετοχή του κυτταροσκελετού της ακτίνης και της τουμπουλίνης, καταλήγουν στην επαγωγή της έκκρισης μορίων απαραίτητων για την κυτταροφαγία των βακτηρίων που είναι και το τελικό αποτέλεσμα των παραπάνω διαδικασιών. Τα σφαιρίδια λάτεξ -αλλά και πιθανόν και άλλοι αβιοτικοί παράγοντες- παρότι δεν έχουν καμία προηγούμενη εξελικτική σχέση με τα αιμοκύτταρα, ως σύγχρονο προϊόν της ανθρώπινης γνώσης, αναγνωρίζονται και δεσμεύονται στην επιφάνεια των αιμοκυττάρων από άγνωστους μέχρις στιγμής υποδοχείς. Η κυτταροφαγία τους προωθείται μέσω ενεργοποίησης σηματοδοτικών μονοπατιών που περιλαμβάνουν την ενεργοποίηση των μορίων FAK, Src και MAP κινασών καθώς και με τη συμμετοχή του κυτταροσκελετού της ακτίνης και της τουμπουλίνης. Ο LPS αναγνωρίζεται και δεσμεύεται στην επιφάνεια των αιμοκυττάρων, ενεργοποιεί άγνωστους μέχρις στιγμής υποδοχείς και διαμέσου σηματοδοτικών μονοπατιών που περιλαμβάνουν τις Ras, ενεργοποιεί τις MAP κινάσες και το σύστημα της έκκρισης. Αν και ενεργοποιεί και τις τρεις MAP κινάσες, μόνο η ERK και η p38 απαιτούνται τόσο στη διαδικασία της έκκρισης, όσο και στη διαδικασία της ενδοκυττάρωσής του. Η FAK, αν και ενεργοποιείται από τον LPS, δεν εμπλέκεται στην διαδικασία της ενδοκυττάρωσής του. Τα παραπάνω δείχνουν ότι τα αιμοκύτταρα έχουν αναπτύξει διακριτούς μηχανισμούς για την κυτταροφαγία των παθογόνων, των μικρομορίων και των αβιοτικών παραγόντων, γεγονός που δείχνει την ικανότητα εξέλιξης των εντόμων έτσι ώστε να καλύπτουν τις ανάγκες της επιβίωσή τους. / Gram negative and positive bacteria E. coli and S. αureus respectively, are recognized and binded on C. capitata hemocyte surface. After binding, they activate β1 integrins and intracellular signalling pathways involving the kinases Ras, FAK, Src and MAP. This signal transduction, with the participation of the cytoskeleton of actin and tuboulin, leads to a regulated secretion that is a prerecuisite for phagocytosis. Latex beads and probably other abiotic factors, despite having no previous evolutionary relation to the hemocytes being a new product of human knowledge, are recognized and binded on hemocyte surface by so far unknown receptors. They activate intracellular signalling pathways that involves FAK, Src and MAP kinases and promote -with the participation of actin and tuboulin cytoskeleton- their phagocytosis. LPS is recognized and binded on hemocyte surface and activates so far unknown receptors and through unknown intracellular signalling pathways involving Ras, activates the MAP kinases and the regulated secretion. Although it activates all three MAPKs, only the ΕΡΚ and p38 are required not only for the secretion, but also for its internalization. Although FAK is activated by LPS, does not get involved in the process of its internalization. All the above mentioned results indicate that the hemocytes have developed distinct mechanisms for phagocytosis of pathogens, micromolecules and abiotic factors, a fact that underlines insects evolutionary adaptations, so that they can survive.

Τα τελευταία χρόνια μελετώνται εκτενώς οι μηχανισμοί της κυτταροφαγίας που εμπλέκονται στην άμυνα τόσο των θηλαστικών όσο και των εντόμων και οι οποίοι είναι συντηρημένοι εξελικτικά. Στο εργαστήριο της Βιολογίας Κυττάρου έχουν γίνει αρκετά και μεγάλα βήματα προς την κατεύθυνση της διερεύνησης του μηχανισμού της κυτταροφαγίας από τα αιμοκύτταρα των εντόμων, αλλά σίγουρα η πλήρης κατανόηση του μηχανισμού αυτού χρειάζεται πολλά πειράματα ακόμη. Πρόσφατα δεδομένα του εργαστηρίου μας φανέρωσαν πως το σύστημα ενεργοποίησης της προφαινολοξειδάσης στην επιφάνεια των αιμοκυττάρων, κατέχει κυρίαρχο ρόλο στην διαδικασία της κυτταροφαγίας. Η φαινολοξειδάση είναι το τελευταίο προϊόν του συστήματος ενεργοποίησης της προφαινολοξειδάσης. Συνθέτεται στα αιμοκύτταρα και παρουσιάζεται στην επιφάνεια των αιμοκυττάρων ως ανενεργό ζυμογόνο. Η αναστολή της δράσης της φαινολοξειδάσης έχει ως αποτέλεσμα μια σημαντική μείωση της κυτταροφαγίας. Η φαινολοξειδάση συμμετέχει επίσης στη διαδικασία της μελανοποίησης (μέσω της μετατροπής της τυροσίνης σε Dopa) και το σχηματισμό των οζιδίων ως μηχανισμού άμυνας. Τα δεδομένα αυτά, μας ώθησαν να μελετήσουμε αν η αποκαρβοξυλάση της Dopa που μετατρέπει την Dopa σε ντοπαμίνη, βρίσκεται και αυτή στην επιφάνεια των αιμοκυττάρων της μύγας της Μεσογείου και αν συμμετέχει στις διαδικασίες της κυτταροφαγίας, του σχηματισμό οζιδίων και της μελανοποίησης, που είναι μηχανισμοί εγγενούς άμυνας των εντόμων. Επίσης, μελετήσαμε και κατά πόσο η αιμολίνη, μια πρωτεΐνη αναγνώρισης μοριακών προτύπων που έχει δειχτεί ότι βρίσκεται σε ορισμένα λεπιδόπτερα, υπάρχει και στα αιμοκύτταρα της μύγας της Μεσογείου και συμμετέχει στην κυτταροφαγία των παθογόνων. / -

Ο προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος είναι μία θεμελιώδης διαδικασία τόσο για την ανάπτυξη όσο και για την άμυνα και διατήρηση της δομής και της οργάνωσης όλων των πολυκύτταρων οργανισμών. Τα αιμοκύτταρα της μύγας της Μεσογείου υφίστανται απόπτωση με φυσιολογικούς μηχανισμούς κατά την μεταμόρφωση του εντόμου από το 3ο προνυμφικό στάδιο μέχρι και την νυμφοποίηση. Η απόπτωση των αιμοκυττάρων είναι δυνατό επίσης να επάγεται από εξωγενή χημικά ή φυσικά ερεθίσματα (κυκλοεξαμίδιο, ανισομυκίνη, λιποπολυσακχαρίτη, σταυροσπορίνη, θερμοκρασιακό σοκ). Η έκφραση και φωσφορυλίωση των κινασών FAK, Src, ERK, PI-3K και Akt εξαρτάται από τo στάδιο ανάπτυξης, ενώ το μέγιστο της έκφρασης και φωσφορυλίωσής τους παρατηρείται στο στάδιο της λευκής νύμφης, όπου σημειώνεται και το μέγιστο της απόπτωσης. Η απόπτωση φαίνεται να επηρεάζεται από τα σηματοδοτικά μονοπάτια των Ras/ERK, FAK/Src και PI-3K/Akt. Ενώ ακόμα, πειράματα αποσιώπησης του RNA της κινάσης των εστιών προσκόλλησης (FAK) έδειξαν ότι στη διαδικασία της αναπτυξιακά ρυθμιζόμενης απόπτωσης σημαντική είναι η συμμετοχή της FAK καθώς και των στόχων που έπονται αυτής (downstream), τα σηματοδοτικά μόρια Src, ERK, PI-3K p85a, και Akt. Η κυτταροφαγία είναι μία βασική ενδογενής ανοσολογική απόκριση των οργανισμών έναντι των παρασίτων και άλλων παθογόνων. Τα αιμοκύτταρα των εντόμων αναγνωρίζουν μία πληθώρα «ξένων» για τον οργανισμό βιοτικών και αβιοτικών παραγόντων και αποκρίνονται ενεργοποιώντας διάφορες σηματοδοτικές οδούς μέσω των επιφανειακών υποδοχέων τους με τελικό αποτέλεσμα την κυτταροφαγία. Πειράματα αποσιώπησης της έκφρασης της β υπομονάδας των ιντεγκρινών έδειξαν ότι στα αιμοκύτταρα της μύγας της Μεσογείου η κυτταροφαγία των βακτηρίων E. coli πραγματοποιείται μέσω των ιντεγκρινών, ενώ στη συνέχεια ενεργοποιείται το σηματοδοτικό μονοπάτι FAK/MAP. Επίσης προσδιορίστηκε ότι η FAK ρυθμίζει την κυτταροφαγία των βακτηρίων E. coli μέσω των MAP κινασών και της Src. Τα σηματοδοτικά μόρια των FAK, Src και ERK βρέθηκαν να συμμετέχουν σε κοινό πρωτεϊνικό σύμπλοκο. Τελικός αποδέκτης των παραπάνω μηχανισμών σηματοδότησης που διέπουν τις ενδογενείς ανοσοαποκρίσεις των αιμοκυττάρων φαίνεται να είναι ο μεταγραφικός παράγοντας Elk-1-like, ο οποίος φωσφορυλιώνεται κατά την κυτταροφαγία των βακτηρίων E. coli καθώς και των σφαιριδίων λάτεξ. Η φωσφορυλίωση του Elk-1-like πραγματοποιείται μέσω των FAK, Src και ΜΑΡ κινασών. Πειράματα οσμωτικής ένθεσης αντισωμάτων έναντι του Elk-1 έδειξαν ότι η έκφραση της Elk-1-like πρωτεΐνης στα αιμοκύτταρα ρυθμίζει την κυτταροφαγία των βακτηρίων της E. coli. Μετά την πιστοποίηση της λειτουργικής σχέσης μεταξύ της FAK και της Elk-1-like πρωτεΐνης κατά την κυτταροφαγία, βρέθηκε ότι ο Elk-1- like μεταγραφικός παράγοντας εντοπίζεται στους ίδιους υπo-κυτταρικούς χώρους με την FAK και ότι τα δύο παραπάνω μόρια συμμετέχουν σε κοινό πρωτεϊνικό σύμπλοκο. Ακολούθησε η διερεύνηση της σχέσης των δύο παραπάνω μηνυματοφόρων μορίων, FAK και Elk-1 στα HK-2 κύτταρα του ανθρώπου. Διαπιστώθηκε ότι τα δύο μηνυματοφόρα μόρια FAK και Elk-1 συνεντοπίζονται, σχηματίζοντας πρωτεϊνικό σύμπλοκο κοντά στην περιφέρεια του πυρήνα των HK-2 κυττάρων, παρουσία υψηλής συγκέντρωσης γλυκόζης (25mM). Αναστέλλοντας την έκφραση του Elk-1 στα HK-2 κύτταρα με την τεχνική αποσιώπησης γονιδίων σημειώθηκε αύξηση της απόπτωσης καθώς επίσης και σημαντική μείωση της έκφρασης των FAK και MAP κινασών. Τα παραπάνω ευρήματα συνηγορούν στο συμπέρασμα ότι ο Elk-1 ρυθμίζει την απόπτωση όπως επίσης φαίνεται να ρυθμίζει και την έκφραση των σηματοδοτικών μορίων των FAK/Src και ΜΑΡΚ μονοπατιών στα HK-2 κύτταρα. / Programmed cell death (apoptosis) is an evolutionary conserved process, crucial for the development and maintenance of multicellular organisms. Medfly hemocytes undergo apoptosis during larval-pupal transformation. Hemocytes also undergo apoptosis in response to external chemical or physical stimuli (cycloheximide, anisomycin, lipopolysaccharide, staurosporine and heat shock). Expression and phosphorylation of FAK, Src, ERK, PI-3K and Akt appear to be dependent upon developmental stages. The maximum expression and phosphorylation of the above signalling molecules appeared in hemocytes of the white pupal stage, which is also the peak of apoptosis levels. FAK/Src, Ras/ERK and PI-3K/Akt signalling pathways are involved in the regulation of apoptosis. Furthermore, FAK silencing experiments show that FAK, as well as, its downstream targets (Src, ERK, PI-3K, Akt) are involved in the developmentally regulated apoptosis. Phagocytosis is an important innate immune response against pathogens and parasites. Insect hemocytes, responsible for cellular defense responses, recognize a variety of foreign biotic and abiotic targets and respond by activating several intracellular signalling pathways via hemocyte surface receptors, leading to phagocytosis. Integrin beta-subunit silencing experiments demonstrated that the uptake of bacteria by insect hemocytes is regulated by integrins and results to the activation of FAK/MAPKs signalling pathways. Focal adhesion kinase and its downstream targets (MAPKs and Src) are also implicated in the process of phagocytosis. In addition, experimental results strongly support a physical association between FAK, Src and ERK. The above signalling cellular innate immune responses result to the phosphorylation of Elk-1-like transcription factor in E. coli/latex beads-challenged hemocytes. Elk-1-like protein is a downstream target for FAK/Src and MAPKs pathways, which is phosphorylated via activation of MAPKs. Osmotic loading experiments using Elk-1 antibodies demonstrated the dependence of phagocytosis from Elk-1-like protein. In light of the functional association of FAK with Elk-1-like protein, confocal microscopy analysis shows that these two signalling molecules are localized in the same subcellular compartments, where co-localization also occurs. In light of the functional and physical association of FAK with Elk-1-like protein in medfly hemocytes, we explored whether an analogous functional and physical association between these two essential molecules also exists in mammalian cell systems, in particular, in HK-2 human cells. Indeed, FAK and Elk-1 are co-localized in the periphery of the nuclear membrane in glucose activated cells. Elk-1 silencing in HK-2 cells increased apoptosis, whereas the levels of FAK and MAPKs were significantly decreased. The above results suggest that Elk-1 appears to affect apoptosis via regulating the expression of FAK and MAPKs.