Η απόπτωση ή προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος είναι ένα φαινόμενο στρατηγικής σημασίας για την ανάπτυξη, διαφοροποίηση και διατήρηση της ακεραιότητος ενός ιστού. Είναι πλέον γνωστό όμως ότι τόσο η υπέρμετρη όσο και η ανεπαρκής ενεργοποίηση των αποπτωτικών μηχανισμών μπορούν να οδηγήσουν στην εκδήλωση διαφόρων παθήσεων. Η απόπτωση χαρακτηρίζεται από συγκεκριμένες μορφολογικές και βιοχημικές μεταβολές ενώ η ρύθμισή της ελέγχεται γενετικά μέσω της εκφράσεως ή καταστολής διαφόρων ογκογονιδίων. Ιδιαίτερη σημασία για την ρύθμιση της αποπτώσεως έχουν τα γονίδια της οικογένειας του bcl-2. Συγκεκριμένα το bcl-2 και το bcl-xL καταστέλλουν την απόπτωση ενώ το bax την προάγει. Η ψωρίαση είναι μία χρόνια υποτροπιάζουσα φλεγμονώδης δερματοπάθεια η οποία προσβάλλει ποσοστό 1%-3% του γενικού πληθυσμού. Η ψωρίαση κατά πλάκας αποτελεί την συχνότερη μορφή της νόσου, η οποία χαρακτηρίζεται από την εμφάνιση σε γενετικώς προδιατεθειμένα άτομα, ερυθηματολεπιδωδών πλακών με σαφή αφορισμό από το πέριξ υγιές δέρμα. Χαρακτηρίζεται από έντονη υπερπλασία της επιδερμίδος, μειωμένη ωρίμανση των κερατινοκυττάρων, φλεγμονώδη διήθηση στην επιδερμίδα (CD8+) και το χόριο (CD4+) και νεοαγγειογένεση. Πρωταρχικό ρόλο στην έναρξη και διατήρηση των ψωριασικών αλλοιώσεων παίζουν τα Τ- λεμφοκύτταρα, τα οποία εκκρίνουν πληθώρα κυτταροκινών Τh1 τύπου. Παρά τα σημαντικά βήματα προόδου που έχουν γίνει τα τελευταία χρόνια στην έρευνα της ψωριάσεως, η παθογένεια της νόσου αυτής παραμένει ακόμα αδιευκρίνιστη. Τα κύτταρα της ψωριασικής επιδερμίδας αποτελούν έναν από τους ταχύτερα αναπτυσσόμενους και πολλαπλασιαζόμενους κυτταρικούς πληθυσμούς του ανθρώπινου οργανισμού. Θεωρητικά τουλάχιστον, η ακάνθωση της ψωριασικής επιδερμίδος θα μπορούσε να προκύπτει όχι μόνο από την αυξημένη μιτωτική δραστηριότητα των κερατινοκυττάρων αλλά επίσης και από έναν μειωμένο κυτταρικό θάνατο στις ζώσες στιβάδες της επιδερμίδος. Συμπερασματικά, στην παρούσα εργασία διαπιστώθηκε ότι υπό αγωγή και με τα δύο θεραπευτικά σχήματα επέρχεται ομαλοποίηση της εκφράσεως της bcl-2 στην ψωριασική διατυπωθεί η υπόθεση ότι τα ευρήματα της παρούσης εργασίας σε σχέση με αυτές τις δύο πρωτεΐνες συνδέονται με την υποστροφή των ψωριασικών αλλοιώσεων και όχι με τους μηχανισμούς θεραπευτικής δράσεως των χορηγηθέντων φαρμάκων. Τόσο υπό ασιτρετίνη όσο και υπό ανθραλίνη + καλσιποτριόλη παρατηρήθηκε μια σημαντική μείωση της εκφράσεως της πρωτεΐνης bcl-x στα κύτταρα της ακανθωτής στιβάδος της ψωριασικής επιδερμίδος. Το εύρημα αυτό σε συνδυασμό με την αντιαποπτωτική δράση της πρωτεΐνης bcl-x στην ψωριασική επιδερμίδα έχει ιδιαίτερη σημασία, αφού η μείωση της εκφράσεως της πρωτεΐνης αυτής υπό θεραπεία ίσως να συμμετέχει στους μηχανισμούς αντιψωριασικής δράσεως των χορηγηθέντων φαρμάκων αφού συνεπάγεται την είσοδο των ψωριασικών κερατινοκυττάρων στην απόπτωση. / Apoptosis or programmed cell death is a phenomenon of crucial importance for the growth, differentiation and maintenance of the integrity of tissues. However, it is well known that excessive or insufficient activation of apoptotic mechanisms can lead to the clinical manifestation of various diseases. Apoptosis is characterized by specific morphological and biochemical alterations, whereas its regulation is genetically determined by the induction or suppression of various oncogenes. Regulatory control of apoptosis is achieved through mechanisms in which proteins encoded by the bcl-2 gene family are involved. Thus, bcl-2 and bcl-xL inhibit the apoptotic process, whereas bax is a proapoptotic protein. Psoriasis is a chronic relapsing inflammatory genodermatosis affecting 1%-3% of general population. Plaque-type psoriasis, the most common form of the disease, is clinically characterized by the appearance of well-circumscribed erythematosquamous lesions in genetically predisposed individuals. On light microscopy, psoriatic lesions reveal marked acanthosis, incomplete maturation of keratinocytes, inflammatory infiltration of the dermis (CD4+) and the epidermis (CD8+) and enhanced angiogenesis. The role of T-cell-mediated immune mechanisms in the triggering of the disease is of particular importance. Despite the considerable progress in the research on various aspects of psoriasis, the pathogenesis of this disorder still remains unclear. Psoriatic keratinocytes represent one of the most rapidly developing and proliferating cellular populations of human body. Theoretically, acanthosis of psoriatic epidermis may have been caused from both, keratinocyte hyperproliferation and decreased cell death in the living epidermal layers. In the present study a normalization of bcl-2 protein expression was observed in psoriatic epidermis under both types of treatment. After 3 and 6 weeks of treatment, the reduction in the expression of bax in the spinous layer of psoriatic epidermis was higher under acitretin, as compared to that seen under topical application of anthralin + calcipotriol, as compared to the pretreatment status. Taking into account the limited differences in the expression of bcl-2 and bax proteins between the two groups (with the intensity of staining inside the normal limits), as well as the apparent absense of contributory role of bcl-2 and bax proteins in the regulation of the apoptosis of psoriatic keratinocytes, we can suppose that the findings of the present study are related to the regression of psoriatic lesions and not to the therapeutic action of the drugs used. Under both therapeutic regimens bcl-x immunoreactivity was reduced in the spinous layer of psoriatic epidermis. This finding, in combination with the antiapoptotic action of bcl-x protein in psoriatic epidermis, is of particular importance since the reduction in the expression of this protein under treatment is possibly implicated in the mechanisms of therapeutic action of these drugs.

Η λοιμώδης ενδοφθαλμίτιδα αποτελεί μια πολύ σοβαρή επιπλοκή μετά από εγχείρηση καταρράκτη, που προβληματίζει ιδαίτερα ως προς τη θεραπευτική προσπέλαση. Ο S. epidermidis αποτελεί το συχνότερο υπεύθυνο μικροοργανισμό που απομονώνεται στις περιπτώσεις μετεγχειρητικής ενδοφθαλμίτιδας. Σκοπός της μελέτης είναι η διερεύνηση της έκφρασης των προφλεγμονωδών κυτταροκινών TNF-α, IL-1β και IFN-γ, καθώς και του ρόλου της απόπτωσης και των ρυθμιστών της Bcl-2, Bax και Fas σε πειραματική ενδοφθαλμίτιδα από S. epidermidis. Προκλήθηκε πειραματική ενδοφθαλμίτιδα στον ένα οφθαλμό σε 48 αρσενικούς αρουραίους Lewis με ενδοϋαλοειδική ένεση (25 μL) 7.000 ζώντων μικροοργα- νισμών S. epidermidis, στελέχους ATCC 35983 το οποίο παράγει εξωκυττάρια βλεννώδη στιβάδα (Slime) (πειραματική ομάδα). Στην ομάδα ελέγχου έγινε ενδοϋαλοειδική ένεση αποστειρωμένου φυσιολογικού ορού. Οι οφθαλμοί σταδιο- ποιήθηκαν καθημερινά για σημεία κλινικής φλεγμονής και εξορύχθηκαν κατά ομά- δες στις 6, 12, 24, 48, 72, και 168 ώρες μετά την ένεση. Έγινε λήψη του υαλοειδούς, στο οποίο μετρήθηκαν οι τίτλοι των κυτταροκινών TNF-α, IL-1β και IFN-γ με ELISA. Μετά από χειρουργική εξαίρεση, δείγματα αμφιβληστροειδικού ιστού σταθεροποιήθηκαν σε ουδέτερη φορμαλίνη 10% και τομές παραφίνης υποβλήθηκαν σε μέθοδο στρεπταβιδίνης-βιοτίνης-υπεροξειδάσης για την ανίχνευση των Bcl-2, Bax και Fas, καθώς και σε in situ υβριδισμό (μέθοδος TUNEL) για την ανίχνευση αποπτωτικών κυττάρων. Τα αποτελέσματα της χρώσης εκφράστηκαν σε μορφομε- τρική ανάλυση και από την αναλογία αποπτωτικών σωμάτων υπολογίστηκε ο δεί- κτης απόπτωσης. Στην πειραματική ομάδα, η κλινική φλεγμονή ήταν μέγιστη 24 ώρες μετά την ένεση και σχεδόν εξαλείφθηκε έως την έβδομη μέρα. Αυξημένα επίπεδα TNF-α, IL-1β και IFN-γ μετρήθηκαν στο υαλοειδές της πειραματικής ομάδας, με μέγιστα επίπεδα στις 12 ώρες για τις TNF-α και IL-1β και στις 48 ώρες για την IFN-γ. Ο δείκτης απόπτωσης παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντικά υψηλότερος στην πειραματική ομάδα σε σχέση με την ομάδα ελέγχου σε όλους τους τύπους κυττάρων του αμφιβληστροειδούς. Η Bcl-2 δεν εκφράστηκε, ενώ η έκφραση των Bax και Fas εμφάνισε παρόμοια διακύμανση με αυτή του δείκτη απόπτωσης, συσχετιζόμενη θετικά με αυτόν. Η μελέτη αυτή καταδεικνύει ότι η πειραματική ενδοφθαλμίτιδα από S. epidermidis επάγει την έκφραση των κυτταροκινών TNF-α, IL-1β και IFN-γ στο υαλοειδές σε στενή χρονική συσχέτιση με το επίπεδο φλεγμονής. Δείχνει επίσης ενεργοποίηση της αποπτωτικής διαδικασίας μέσω των συστημάτων Bax και Fas, με μέγιστη έκφραση σε σύντομο χρονικό διάστημα μετά την κορύφωση της φλεγμο- νώδους διεργασίας. / Infectious endophthalmitis is one of the most serious complications after intraocular surgery, constituting a therapeutic challenge. Staphylococcus epidermitis is the most common cause of acute postoperative endophthalmitis. The purpose of this study was to investigate the expression of inflammatory cytokines TNF-α, IL-1β, and IFN-γ in the vitreous and the potential involvement of the apoptosis and its regulatiors Bcl-2, Bax, and Fas within the retina in S. epidermidis experimental endophthalmitis. Endophthalmitis was induced in 48 male Lewis rats by unilateral 25-μL intravitreal injection of 7,000 viable organisms of slimeprodusing S. epidermitis strain ATCC 35983 (experimental group). Forty-eigth rats received a similar sterile normal saline injection (control group). The injected eyes were graded for clinical inflammation and were removed in groups at 6, 12, 24, 48, 72, and 168 hours post-injection. Vitreous was obtained and titers of TNF-α, IL-1β, and IFN-γ were measured with established enzyme-linked immunosorbent assays. After surgical separation, retinal tissue specimens were fixed, and paraffin sections underwent hematoxylin-eosin staining, immunohistochemistry against Bcl-2, Bax, and Fas, and TUNEL assay for detection of apoptotic cells. Following morphometric analysis, the apoptotic body index (ABI) was calculated.In the experimental group, the clinical ihnflammatory score reached maximum within 24 h, while inflammation was almost abolished by day 7. Statistically increased levels of TNF- α and IL-1β were detected in the experimental vitreous with maximum levels observed at 12 h. IFN-γ was also detected in the experimental vitreous and reached maximum levels at 48 h. While Bcl-2 expression was absent, Bax and Fas expression and apoptosis in ganglion cells, dipolar cells, and photoreceptors, were significantly higher in the experimental group compared to the control group (p<0.05). In the experimental group, inflammation peaked at 24 hours, Bax and Fas expression at 48 hours and the ABI at 72 hours post-injection.The results of this study suggest that S. epidermidis experimental endophthalmitis induces the expression of cytokines TNF-α, IL-1β and IFN-γ in the vitreous. The time course of those cytokine expression levels is closely associated to the clinical presentation of this edophthalmitis model. In addition, apoptosis is increased within the retina in S. epidermidis experimental endophthalmitis through upregulation of Bax and Fas, peaking soon after peak inflammation.

Η κιρσοκήλη αποτελεί τη συχνότερη αιτία ανδρικής υπογονιμότητας και ορίζεται ως η παθολογική κιρσοειδής διεύρυνση των φλεβών του σπερματικού τόνου (ελικοειδούς πλέγματος). Η επίπτωση της κιρσοκήλης στο γενικό πληθυσμό κυμαίνεται σε ποσοστό 15‐20%, ενώ στους υπογόνιμους άνδρες αγγίζει το 40%. Παρά το γεγονός ότι η κιρσοκήλη είναι σπάνια στα παιδία, πρόσφατες μελέτες έδειξαν πως το ποσοστό της αγγίζει το 6% σε παιδιά ηλικίας 10 ετών, ενώ στους εφήβους το αντίστοιχο ποσοστό ανέρχεται στο 16%. Πιθανότατα, προκαλείται λόγω ανεπάρκειας των φλεβικών βαλβίδων, κάτι που σαν αποτέλεσμα έχει την παλινδρόμηση του αίματος εντός των σπερματικών φλεβών. Η κιρσοκήλη εμφανίζεται κυρίως στην αριστερή πλευρά, εξαιτίας της ανατομίας των φλεβών στην περιοχή αυτή. Παρά την αυξημένη συχνότητα της, η παθοφυσιολογία της παραμένει εν πολλοίς άγνωστη. Πρόσφατες μελέτες σε κιρσοειδείς φλέβες κάτω άκρων έχουν δείξει ότι η μείωση του ρυθμού απόπτωσης σχετίζεται με την εμφάνιση πρωτοπαθούς φλεβίτιδας. Επιπλέον αυξημένη παραγωγή των συστατικών της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας, οδηγεί στις μορφολογικές αλλοίωσεις και στην απώλεια του φλεβικού τόνου που χαρακτηρίζει τους κιρσούς κάτω άκρων. Σκοπός: Θεωρώντας ότι αντίστοιχοι μηχανισμοί πρέπει να ισχύουν όχι μόνο στους κιρσούς κάτω άκρων αλλά και στην κιρσοκήλη, υποθέσαμε ότι στο τοίχωμα των κιρσοειδών έσω σπερματικών φλεβών θα παρατηρείται κατ’ αναλογία μείωση του ρυθμού απόπτωσης και αύξηση στο ρυθμό σύνθεσης των συστατικών της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας με μείωση της έκφρασης των MMPs (MMP‐1, MMP‐ 9) και αντίστοιχη αύξηση των TIMPs (TIMP‐1). Μέθοδοι: Το υλικό μελέτης αποτελούσαν 45 δείγματα έσω σπερματικών φλεβών ασθενών με κιρσοκήλη. Σαν μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν κλάδοι των κάτω επιγαστρικών φλεβών που αφαιρέθηκαν από τον κάθε ασθενή κατά τη διάρκεια χειρουργικής επέμβασης, έτσι ώστε ο κάθε ασθενής να αποτελεί και τον δικό του μάρτυρα. Προσδιορίσαμε τις μορφολογικές αλλοιώσεις στο αγγειακό τοίχωμα με ανοσοϊστοχημική χρώση έναντι της ακτίνης. Επιπλέον, μελετήσαμε την έκφραση των MMP‐1 και MMP‐9 καθώς και του TIMP‐1 στο τοίχωμα των κιρσοειδών όσο και των υγιών φλεβών. Τέλος, το σύνολο των δειγμάτων, εξετάσθηκαν ανοσοϊστοχημικά για την ανίχνευση των μεσολαβητών που ρυθμίζουν το ενδογενές (Bcl‐2, Cas‐9) και το εξωγενές (Cas‐8) μονοπάτι της απόπτωσης. Αποτελέσματα: Συγκριτικά με τις φυσιολογικές φλέβες, οι κιρσοειδείς εμφάνισαν πάχυνση του μέσου χιτώνα. Οι MMP‐1 και TIMP‐1 εκφράσθηκαν στο κυτταρόπλασμα των λείων μυϊκών κυττάρων του μέσου χιτώνα των αγγείων, τόσο στις φυσιολογικές όσο και στις κιρσοειδώς διευρυμένες, με την ένταση της έκφρασης όμως, να είναι μεγαλύτερη στους κιρσούς. Η MMP‐9 εντοπίσθηκε στο κυτταρόπλασμα των λείων μυϊκών κυττάρων του μέσου χιτώνα μόνο των κιρσών. Όσον αφορά την έκφραση των αποπτωτικών δεικτών, παρατηρήσαμε έκφραση της Cas‐9 στο πυρήνα των λείων μυϊκών κυττάρων του μέσου χιτώνα τόσο στις κιρσοειδείς φλέβες όσο και στους μάρτυρες, με την ένταση να είναι μεγαλύτερη στους κιρσούς. Σε μικρό αριθμό δειγμάτων παρατηρήσαμε πυρηνική χρώση της Cas‐ 8 στα λεία μυϊκά κύτταρα του μέσου χιτώνα στους κιρσούς. Bcl‐2 δεν ανιχνεύθηκε σε κανένα από τα δείγματα που εξετάσθηκαν.Συμπεράσματα: Τα δεδομένα μας έδειξαν υπερτροφία των λείων μυϊκών κυττάρων του μέσου χιτώνα των αγγείων στις κιρσοειδείς φλέβες. Επιπλέον παρατηρήσαμε αυξημένη έκφραση των δεικτών Cas‐9, MMP‐1, MMP‐9 και TIMP‐1 στις κιρσοκήλες σε σύγκριση με τους μάρτυρες. Η έκφραση των δεικτών αυτών ήταν ανεξάρτητη από παραμέτρους όπως ο βαθμός (Grade) της κιρσοκήλης και η ηλικία των ασθενών. Τα ευρήματα μας αυτά δεν συνάδουν με αντίστοιχα από κιρσούς κάτω άκρων υποδηλώνοντας ότι πιθανώς άλλοι μηχανισμοί εμπλέκονται στην πρόκληση των κιρσοειδώς διευρυμένων έσω σπερματικών φλεβών. / Background: Varicocele is the most common cause of male infertility, defined as the abnormal varicose enlargement of the scrotal portion of the spermatic veins (pampiniform plexus). The incidence of varicocele in the general population ranges from 15% to 20%, while in subfertile men it reaches 40%. In children the frequency of varicocele is considered to be rare but recent studies have shown its presence in 6% of children aged 10 years, while in adolescents this figure rises up to 16%. Probably caused by insufficient venous valves which cause retrograde flow into the spermatic veins. Varicocele occurs predominately on the left side because of the anatomy of the veins in this region. Despite its great frequency, its pathophysiology remains unclear. Recent studies from varicose veins in the legs have shown that the reduction of rate of apoptosis is associated with the occurrence of primary varicose veins. Furthermore an increased production of the components of the extracellular matrix, leads to morphological alterations and loss of venous tone that characterizes varicose veins in the legs. Purpose: Considering that similar mechanisms should apply not only to lower limbs varicose veins but also at vericocele, we hypothesized that the medial wall of internal spermatic veins should show correspondenly a reduction in the rate of apoptosis and an increase in the rate of synthesis of components of the extracellular matrix by reducing expression of MMPs (MMP‐1, MMP‐9) and a corresponding increase in TIMPs (TIMP‐1). Methods: The study group consisted of 45 samples of internal spermatic vein (ISV) from patients with varicocele. Normal subcutaneous veins were harvested from each patient at the time of surgery and used as control specimens, so that each patient would serve as its own control. Both pathological ISVs and normal subcutaneous veins were used to detect the mediators that regulate the instrinsic (Bcl‐2 and Caspase‐9) and extrinsic (Caspase‐8) apoptotic pathways by immunohistochemical staining. We also investigated matrix metalloproteinases (MMPs) and also their inhibitors (TIMPs) expression in the varicose ΙSV, including MMP‐1, MMP‐9 and TIMP‐1. Finally, we examined the morphological alterations of varicose veins by immunohistochemical staining of Anti‐Actin antibody. Results: Compared with normal veins, a thickening of the smooth muscle layer of the ISV, was found in patients with varicocele. MMP‐1 and TIMP‐1 were expressed within cytoplasm of smooth muscle cells in media of both normal and varicose veins, but normal veins expressed less ΜΜP‐1 and TIMP‐1 than varicoceles did. MMP‐9 was localized to cytoplasm of smooth muscle cells only in varicose veins. As for the expression of apoptotic proteins, we showed expression of Cas‐9 within nuclei of smooth muscle cells in media of both normal and varicose veins however the expression was higher in varicoceles. In small number of samples we noticed nuclear staining of Cas‐8 within nuclei of smooth muscle cells in varicoceles. Bcl‐2 was not detected with immunohistochemistry in any specimens examined. Conclusions: Our data showed vascular smooth muscle hypertrophy in the diseased vessels. We also noticed increased expression of Cas‐9, MMP‐1, MMP‐9 and TIMP‐1 in varicoceles compared with normal veins. The expression of these markers was independent on factors such as the degree of varicocele and the age of the patients. Our findings are not consistent with corresponding varicose veins from legs, suggesting that other mechanisms are probably involved in causing vericoceles.

Η απόπτωση είναι μια βασικής σημασίας βιολογική διαδικασία η οποία απαιτείται για τη διατήρηση της ακεραιότητας και της ομοιόστασης στους πολυκύτταρους οργανισμούς. Αντίθετα, δυσλειτουργία της αποπτωτικής διαδικασίας διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην παθογένεια μιας ευρείας κλίμακας ανθρώπινων παθολογικών καταστάσεων συμπεριλαμβανομένων νευροεκφυλιστικών διαταραχών και καρκίνο. Η αποπτωτική διαδικασία περιλαμβάνει την ενεργοποίηση ενός αρκετά συντηρημένου μεταξύ των οργανισμών βιοχημικού μονοπατιού, στο τελευταίο στάδιο του οποίου βρίσκεται η ενεργοποίηση μιας οικογένειας πρωτεασών που ονομάζονται κασπάσες. Οι πρωτεάσες αυτές κατατμούν μεγάλο αριθμό πρωτεϊνών – στόχων, η κατάτμηση των οποίων και η αλλαγή των λειτουργικών χαρακτηριστικών τους προάγει τον αποπτωτικό φαινότυπο. Στις πρωτεΐνες-στόχους της αποπτωτικής διαδικασίας περιλαμβάνονται δομικές πρωτεΐνες του πυρήνα και του κυτταροσκελετού, πρωτεΐνες που ενέχονται άμεσα στην αποπτωτική διαδικασία, στην κυτταρική σηματοδότηση, στην αντιγραφή του DNA, την επιδιόρθωση των βλαβών του, αλλά και πρωτεΐνες που συμμετέχουν στην αδειοδότηση της αντιγραφής. Η αδειοδότηση της αντιγραφής είναι μια διαδικασία η οποία εξασφαλίζει πως μόνο μετά από τη διαμεσολάβηση της φάσης της μίτωσης η χρωματίνη καθίσταται ικανή για έναν νέο κύκλο αντιγραφής του DNA. Ένα σύμπλοκο πρωτεϊνών ρυθμίζει τη διαδικασία αυτή, μείζον συστατικό του οποίου είναι η πρωτεΐνη Cdt1 η οποία είναι συντηρημένη από τις ζύμες έως τα θηλαστικά. Στα σπονδυλωτά, η πρωτεΐνη Geminin, είναι ο αρνητικός ρυθμιστής του Cdt1 προσφέροντας ένα επιπρόσθετο επίπεδο ρύθμισης του Cdt1. Στις πρωτεΐνες που ενέχονται στην παραπάνω διαδικασία συμπεριλαμβάνονται οι πρωτεΐνες Orc1-6, Cdc6, MCM2-7, από τις οποίες οι πρωτεΐνες Cdc6 και MCM3 έχει δειχθεί ότι αποτελούν στόχους των κασπασών και της αποπτωτικής διαδικασίας. Στόχος της παρούσης εργασίας ήταν ο έλεγχος μιας πιθανής στόχευσης του μέλους του προαντιγραφικού συμπλόκου Cdt1 και του αρνητικού ρυθμιστή του Geminin κατά την απόπτωση. Διαπιστώθηκε πως σε αποπτωτικά κύτταρα η πρωτεΐνη Geminin στοχεύεται και κατατμείται. Η κατάτμηση αυτή προκύπτει μετά από στόχευση της Geminin από την κασπάση-3 και παρατηρήθηκε τόσο σε in vivo συνθήκες όσο και μετά την in vitro επώαση ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης Geminin με ανασυνδυασμένη κασπάση-3. Η χαρτογράφηση της θέσης της κατάτμησης της Geminin από την κασπάση-3 επέδειξε το καρβοξυτελικό της άκρο της Geminin ως τον πρωτεολυτικό στόχο της κασπάσης-3, προτείνοντας υποθετικές αλλαγές στη φυσιολογική λειτουργία της πρωτεΐνης. / Apoptosis is an essential biological process required for the maintenance of integrity and homeostasis of multicellular organisms. Deregulation of apoptosis plays an important role in the pathogenesis of a wide range of human diseases including neurodegenerative disorders and cancer. Apoptosis induces the activation of a conserved biochemical pathway of specific proteases called caspases. These proteases cleave a great number of protein-targets, promoting the alteration of their functional characteristics and leading to apoptotic phenotype. Structural cytoskeleton and nucleolar proteins that are involved in apoptotic process, signalling cellular transduction, DNA replication and repair of its damage as well as proteins involved in replication licensing, are among the protein-targets of caspases. Replication licensing is a process which ensures that only after a passage through mitosis chromatin becomes competent for a new round of DNA replication. A protein complex regulates this process and a major component of this complex is Cdt1 protein, which is conserved from yeast to mammals. In vertebrates, another protein, namely Geminin, is the negative regulator of Cdt1 offering an additional regulation level over Cdt1. In the replication licensing process, other proteins such as Orc1-6, Cdc6, MCM2-7 are involved. Cdc6 and MCM3 have been shown to be targets of caspases during apoptosis. The aim of the present study was the investigation of a possible targeting of Cdt1 and Geminin during apoptosis. We showed that in apoptotic cells, Geminin is cleaved producing a lower molecular weight cleavage product. The cleavage of Geminin occurs by caspase-3 in apoptotic cells treated with a variety of apoptotic triggers in vivo, and after the incubation of recombinant Geminin with recombinant caspase-3, in vitro. The cleavage site of Geminin by caspase-3 was mapped in carboxy-terminus of Geminin, suggesting possible alterations in its functions.

Η αντικαρκινική ένωση δοξορουβικίνη χρησιμοποιείται ευρέως είτε μόνη της είτε σε συνδυασμό με άλλα αντικαρκινικά φάρμακα, στην αντιμετώπιση του καρκίνου του μαστού, των ωοθηκών, του πνεύμονα αλλά και σε περιπτώσεις οξείας λευχαιμίας και σαρκωμάτων. Σε προηγούμενη έρευνα που πραγματοποιήθηκε στο εργαστήριο μας, σε λεμφοκύτταρα ανθρώπου αλλά και στην κυτταρική σειρά ποντικού C2C12, βρέθηκε ότι επάγει το σχηματισμό μικροπυρήνων ως αποτέλεσμα κυρίως χρωμοσωματικής θραύσης. Στην παρούσα εργασία, διερευνήθηκε περαιτέρω η ικανότητα της δοξορουβικίνης να προκαλεί θραύση του γενετικού υλικού καθώς και η ικανότητά της να επάγει τη διαδικασία της απόπτωσης σε λευχαιμικά κύτταρα ανθρώπου HL-60. Η μελέτη του κερματισμού του DNA λόγω της δράσης της δοξορουβικίνης πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο ηλεκτροφόρησης μοναδιαίων κυττάρων σε πηκτή αγαρόζης (SCGE) κάτω από αλκαλικές συνθήκες. Εκτιμήθηκαν οι παράμετροι tail length, % DNA in tail, tail moment, και olive tail moment που αποκαλύπτουν θραύση του DNA. Επιπρόσθετα, η ικανότητα της δοξορουβικίνης να προκαλεί θραύση του γενετικού υλικού αναλύθηκε μέσω δημιουργίας κλάσεων με ελάχιστη έως μέγιστη βλάβη. O μηχανισμός με τον οποίο προκαλεί θραύση του DNA διερευνήθηκε με τη χρήση της μεθόδου ηλεκτροφόρησης μοναδιαίων κυττάρων σε πηκτή αγαρόζης κάτω από αλκαλικές συνθήκες σε συνδυασμό με τη χρήση των επιδιορθωτικών ενζύμων Fpg και hOOG1. Μετέπειτα, εξετάστηκε η ικανότητα της δοξορουβικίνης να επάγει την απόπτωση. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο αναστολής της κυτταροκίνησης (CBMN). Επίσης, με τη μέθοδο CBMN πραγματοποιήθηκε μελέτη του φαινομένου της χρωμοσωματικής θραύσης. Για την περαιτέρω διερεύνηση του μηχανισμού με τον οποίον η υπό εξέταση χημική ένωση επάγει τη διαδικασία της απόπτωσης, αναλύθηκε η ικανότητά της να τροποποιεί την έκφραση της κασπάσης-3, μιας πρωτεΐνης που παίζει σημαντικό ρόλο στον καταρράκτη των μοριακών γεγονότων που εμπλέκονται στην ενεργοποίηση του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου. Για το σκοπό αυτό εφαρμόστηκε η μέθοδος ανοσοαποτύπωσης της παραπάνω πρωτεΐνης (Western blot). Με βάση τα ευρήματά μας, η δοξορουβικίνη παρουσιάζει θραυσματογόνο δράση, όπως φάνηκε από την αύξηση της εξόδου του DNA από τους πυρήνες των κυττάρων μετά από ηλεκτροφόρηση σε αλκαλικές συνθήκες. Η δημιουργία των ρηγμάτων είναι ισχυρότερη σε χαμηλές συγκεντρώσεις. Η ικανότητα της δοξορουβικίνης να προκαλεί θραύση του γενετικού υλικού σχετίζεται με την οξείδωση των βάσεων του DNA, η οποία έχει ως αποτέλεσμα τη δημιουργία ασταθών σε αλκαλικές συνθήκες θέσεων (alkali labile sites). Επίσης, προκαλεί οριακή αύξηση της συχνότητας των μικροπυρήνων στις χαμηλότερες συγκεντρώσεις που μελετήθηκαν, ενώ δε φαίνεται να επάγει τη δημιουργία των μικροπυρήνων στις υψηλότερες συγκεντρώσεις. Το εύρημα αυτό είναι σε συμφωνία με την ιδιότητά της να προκαλεί μεγαλύτερη συχνότητα ρηγμάτων του DNA στις μικρές συγκεντρώσεις. Επιπρόσθετα, επάγει τη διαδικασία της απόπτωσης. Η επαγωγή αυτή είναι ισχυρότερη σε υψηλές συγκεντρώσεις και δικαιολογεί τις μειωμένες συχνότητες ρηγμάτων και μικροπυρήνων στις συγκεντρώσεις αυτές. Η κασπάση 3 συμμετέχει στην επαγόμενη από τη δοξορουβικίνη απόπτωση όπως φάνηκε από την αύξηση της έκφρασης της κασπάσης 3, μετά από ανάλυση κατά western, σε κυτταρικές καλλιέργειες που αναπτύχθηκαν παρουσία δοξορουβικίνης. / The anticancer drug doxorubicin is widely used, either alone or in combination with other anticancer drugs, in the treatment of solid tumours of the breast, lung, ovary, as well as in acute leukemia and sarcomas. Previous research in our laboratory showed that doxorubicin is able to induce micronucleus generation, in human lymphocytes and mouse cell line C2C12, mainly due to chromosome breakage. In the present study we investigated the clastogenic activity of doxorubicin as well as its ability to induce apoptosis. Ηuman leukemic cells HL-60 were chosen as the cell system to proceed our research. The clastogenic activity of doxorubicin was investigated by alkaline Single Cell Gel Electrophoresis (SCGE assay-Comet assay). Four parameters were analyzed, tail length, % DNA in tail, tail moment, and olive tail moment, which reveal DNA breakage. Additionally the capacity of doxorubicin to induce DNA fragmentation was analyzed by stratifying the cells into five classes with various degrees of DNA damage, from undamaged DNA to severely damaged DNA. The mechanism by which doxorubicin exerts its clastogenic activity was studied by enzyme linked comet assay. We used Fpg and hOOG1 DNA glycosylases. The ability of doxorubicin to induce apoptosis was studied by Cytokinesis-block Micronucleus assay. Also, the CBMN assay was used to assess the micronucleation on HL-60 due to the action of doxorubicin. To further elucidate the mechanism by which doxorubicin induce apoptosis we examined the ability of this compound to alter the expression of caspase 3, that plays a key role in the cascade of molecular events of programmed cell death. This analysis was performed by Western blot. Our findings indicate that doxorubicin exerts clastogenic activity as it provokes DNA migration from the nucleus after SCG electrophoresis in alkaline conditions. The generation of breaks on DNA strands seems to be more potent at low concentrations. The ability of doxorubicin to induce fragmentation of genetic material is correlated with the oxidation of DNA bases resulting in the formation of alkali labile sites. Furthermore, it induces marginal increase in the frequency of micronuclei at lower concentrations, while it doesn’t seem to induce micronucleation at higher concentrations. This finding is in accordance with the ability of doxorubicin to generate higher frequency of DNA breaks at low concentrations. Additionally, doxorubicin induces apoptosis. This induction is more potent at higher concentrations and is consistent with the reduced frequency of breaks and micronucleus generation at these concentrations. Activation of apoptosis due to doxorubicin treatment seems to be mediated by caspase 3.

Ο προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος είναι μία θεμελιώδης διαδικασία τόσο για την ανάπτυξη όσο και για την άμυνα και διατήρηση της δομής και της οργάνωσης όλων των πολυκύτταρων οργανισμών. Τα αιμοκύτταρα της μύγας της Μεσογείου υφίστανται απόπτωση με φυσιολογικούς μηχανισμούς κατά την μεταμόρφωση του εντόμου από το 3ο προνυμφικό στάδιο μέχρι και την νυμφοποίηση. Η απόπτωση των αιμοκυττάρων είναι δυνατό επίσης να επάγεται από εξωγενή χημικά ή φυσικά ερεθίσματα (κυκλοεξαμίδιο, ανισομυκίνη, λιποπολυσακχαρίτη, σταυροσπορίνη, θερμοκρασιακό σοκ). Η έκφραση και φωσφορυλίωση των κινασών FAK, Src, ERK, PI-3K και Akt εξαρτάται από τo στάδιο ανάπτυξης, ενώ το μέγιστο της έκφρασης και φωσφορυλίωσής τους παρατηρείται στο στάδιο της λευκής νύμφης, όπου σημειώνεται και το μέγιστο της απόπτωσης. Η απόπτωση φαίνεται να επηρεάζεται από τα σηματοδοτικά μονοπάτια των Ras/ERK, FAK/Src και PI-3K/Akt. Ενώ ακόμα, πειράματα αποσιώπησης του RNA της κινάσης των εστιών προσκόλλησης (FAK) έδειξαν ότι στη διαδικασία της αναπτυξιακά ρυθμιζόμενης απόπτωσης σημαντική είναι η συμμετοχή της FAK καθώς και των στόχων που έπονται αυτής (downstream), τα σηματοδοτικά μόρια Src, ERK, PI-3K p85a, και Akt. Η κυτταροφαγία είναι μία βασική ενδογενής ανοσολογική απόκριση των οργανισμών έναντι των παρασίτων και άλλων παθογόνων. Τα αιμοκύτταρα των εντόμων αναγνωρίζουν μία πληθώρα «ξένων» για τον οργανισμό βιοτικών και αβιοτικών παραγόντων και αποκρίνονται ενεργοποιώντας διάφορες σηματοδοτικές οδούς μέσω των επιφανειακών υποδοχέων τους με τελικό αποτέλεσμα την κυτταροφαγία. Πειράματα αποσιώπησης της έκφρασης της β υπομονάδας των ιντεγκρινών έδειξαν ότι στα αιμοκύτταρα της μύγας της Μεσογείου η κυτταροφαγία των βακτηρίων E. coli πραγματοποιείται μέσω των ιντεγκρινών, ενώ στη συνέχεια ενεργοποιείται το σηματοδοτικό μονοπάτι FAK/MAP. Επίσης προσδιορίστηκε ότι η FAK ρυθμίζει την κυτταροφαγία των βακτηρίων E. coli μέσω των MAP κινασών και της Src. Τα σηματοδοτικά μόρια των FAK, Src και ERK βρέθηκαν να συμμετέχουν σε κοινό πρωτεϊνικό σύμπλοκο. Τελικός αποδέκτης των παραπάνω μηχανισμών σηματοδότησης που διέπουν τις ενδογενείς ανοσοαποκρίσεις των αιμοκυττάρων φαίνεται να είναι ο μεταγραφικός παράγοντας Elk-1-like, ο οποίος φωσφορυλιώνεται κατά την κυτταροφαγία των βακτηρίων E. coli καθώς και των σφαιριδίων λάτεξ. Η φωσφορυλίωση του Elk-1-like πραγματοποιείται μέσω των FAK, Src και ΜΑΡ κινασών. Πειράματα οσμωτικής ένθεσης αντισωμάτων έναντι του Elk-1 έδειξαν ότι η έκφραση της Elk-1-like πρωτεΐνης στα αιμοκύτταρα ρυθμίζει την κυτταροφαγία των βακτηρίων της E. coli. Μετά την πιστοποίηση της λειτουργικής σχέσης μεταξύ της FAK και της Elk-1-like πρωτεΐνης κατά την κυτταροφαγία, βρέθηκε ότι ο Elk-1- like μεταγραφικός παράγοντας εντοπίζεται στους ίδιους υπo-κυτταρικούς χώρους με την FAK και ότι τα δύο παραπάνω μόρια συμμετέχουν σε κοινό πρωτεϊνικό σύμπλοκο. Ακολούθησε η διερεύνηση της σχέσης των δύο παραπάνω μηνυματοφόρων μορίων, FAK και Elk-1 στα HK-2 κύτταρα του ανθρώπου. Διαπιστώθηκε ότι τα δύο μηνυματοφόρα μόρια FAK και Elk-1 συνεντοπίζονται, σχηματίζοντας πρωτεϊνικό σύμπλοκο κοντά στην περιφέρεια του πυρήνα των HK-2 κυττάρων, παρουσία υψηλής συγκέντρωσης γλυκόζης (25mM). Αναστέλλοντας την έκφραση του Elk-1 στα HK-2 κύτταρα με την τεχνική αποσιώπησης γονιδίων σημειώθηκε αύξηση της απόπτωσης καθώς επίσης και σημαντική μείωση της έκφρασης των FAK και MAP κινασών. Τα παραπάνω ευρήματα συνηγορούν στο συμπέρασμα ότι ο Elk-1 ρυθμίζει την απόπτωση όπως επίσης φαίνεται να ρυθμίζει και την έκφραση των σηματοδοτικών μορίων των FAK/Src και ΜΑΡΚ μονοπατιών στα HK-2 κύτταρα. / Programmed cell death (apoptosis) is an evolutionary conserved process, crucial for the development and maintenance of multicellular organisms. Medfly hemocytes undergo apoptosis during larval-pupal transformation. Hemocytes also undergo apoptosis in response to external chemical or physical stimuli (cycloheximide, anisomycin, lipopolysaccharide, staurosporine and heat shock). Expression and phosphorylation of FAK, Src, ERK, PI-3K and Akt appear to be dependent upon developmental stages. The maximum expression and phosphorylation of the above signalling molecules appeared in hemocytes of the white pupal stage, which is also the peak of apoptosis levels. FAK/Src, Ras/ERK and PI-3K/Akt signalling pathways are involved in the regulation of apoptosis. Furthermore, FAK silencing experiments show that FAK, as well as, its downstream targets (Src, ERK, PI-3K, Akt) are involved in the developmentally regulated apoptosis. Phagocytosis is an important innate immune response against pathogens and parasites. Insect hemocytes, responsible for cellular defense responses, recognize a variety of foreign biotic and abiotic targets and respond by activating several intracellular signalling pathways via hemocyte surface receptors, leading to phagocytosis. Integrin beta-subunit silencing experiments demonstrated that the uptake of bacteria by insect hemocytes is regulated by integrins and results to the activation of FAK/MAPKs signalling pathways. Focal adhesion kinase and its downstream targets (MAPKs and Src) are also implicated in the process of phagocytosis. In addition, experimental results strongly support a physical association between FAK, Src and ERK. The above signalling cellular innate immune responses result to the phosphorylation of Elk-1-like transcription factor in E. coli/latex beads-challenged hemocytes. Elk-1-like protein is a downstream target for FAK/Src and MAPKs pathways, which is phosphorylated via activation of MAPKs. Osmotic loading experiments using Elk-1 antibodies demonstrated the dependence of phagocytosis from Elk-1-like protein. In light of the functional association of FAK with Elk-1-like protein, confocal microscopy analysis shows that these two signalling molecules are localized in the same subcellular compartments, where co-localization also occurs. In light of the functional and physical association of FAK with Elk-1-like protein in medfly hemocytes, we explored whether an analogous functional and physical association between these two essential molecules also exists in mammalian cell systems, in particular, in HK-2 human cells. Indeed, FAK and Elk-1 are co-localized in the periphery of the nuclear membrane in glucose activated cells. Elk-1 silencing in HK-2 cells increased apoptosis, whereas the levels of FAK and MAPKs were significantly decreased. The above results suggest that Elk-1 appears to affect apoptosis via regulating the expression of FAK and MAPKs.

Με σκοπό να διερευνήσουμε τους μηχανισμούς επαγωγής απόπτωσης από την TRAIL και την επιλεκτικότητα την οποία δείχνει απέναντι στα καρκινικά κύτταρα, χρησιμοποιήσαμε κυτταρικές σειρές, προερχόμενες από το παχύ έντερο ανθρώπου, οι οποίες αντιπροσωπεύουν τα διάφορα στάδια της καρκινογένεσης, από το πρώιμο αδένωμα στο καρκίνωμα. Παρατηρήθηκε μια ανθεκτικότητα των πρώιμων αδενωμάτων απέναντι στην TRAIL σε αντίθεση με τα κύτταρα που προέρχονται από καρκίνους προχωρημένου σταδίου, ενώ σημαντικό ρόλο φαίνεται να παίζει, εκτός από το στάδιο καρκινογένεσης και η ύπαρξη ορισμένων ογκογονιδίων στον καθορισμό της ευαισθησίας των κυττάρων απέναντι στην TRAIL. Συγκεκριμένα, οι διάφορες ισομορφές του ογκογονιδίου RAS παίζουν ιδιαίτερο ρόλο τόσο όσο αφορά την ανταπόκριση του κύτταρου στην επαγωγή με TRAIL, όσο και στη ρύθμιση των μορίων που εμπλέκονται άμεσα στο μονοπάτι σηματοδότησης του TRAIL. Τα ογκογονίδια RAS παίζουν σημαντικό ρόλο στην καρκινική εξαλλαγή ενεργοποιώντας μια σειρά από μονοπάτια σηματοδότησης που οδηγούν στην ανεξέλεγκτη κυτταρική διαίρεση και στην προστασία από τα αποπτωτικά σήματα. Εντούτοις, η TRAIL (Tumor Necrosis Factor Related Apoptosis Inducing Ligand) έχει τη δυνατότητα να προκαλεί απόπτωση κυρίως στα καρκινικά κύτταρα, ενεργοποιώντας τους υποδοχείς DR4 και DR5 (Death Receptors). Σε αυτή τη μελέτη δείξαμε ότι σε αδενοκαρκινώματα του παχέος εντέρου ανθρώπου η έκφραση των υποδοχέων της TRAIL ρυθμίζεται από την ενεργότητα της κινάσης MEK (MAPK/ERK Kinase). Η ευαισθησία στην TRAIL των κυτταρικών σειρών που χρησιμοποιήσαμε φάνηκε να συσχετίζεται με το βαθμό κακοήθους εξαλλαγής. Συγκεκριμένα, οι κυτταρικές σειρές AAC1 και RGC2, που προέρχονται απο πρώιμα αδενώματα και η κυτταρική σειρά Caco2, που προέρχεται απο μέσο αδένωμα παρουσίασαν μεγάλη ανθεκτικότητα στην TRAIL. Αντίθετα, οι κυτταρικές σειρές DLD-1 και HT-29, που προέρχονται απο αδενοκαρκινώματα προχωρημένου στάδιου ήταν ευαίσθητες στην TRAIL. Επιλέχθηκε η κυτταρική σειρά Caco2 η οποία είναι ανθεκτική στην TRAIL και οι δύο κυτταρικές σειρές που προέρχονται από προχωρημένα αδενοκαρκινώματα για να εξεταστεί η έκφραση σημαντικών μορίων για την αποπτωτική σηματοδότηση από την TRAIL. Φάνηκε μια αντιστοιχία της έκφρασης των υποδοχέων DR4 και DR5 με την ευαισθησία των κυττάρων στην TRAIL, ενώ τα επίπεδα έκφρασης των FADD, κασπάση 8, κασπάση 3 και FLIP δεν παρουσίασαν παρόμοια αντιστοιχία. Επιπλέον, παρατηρήθηκε παρατεταμένη ενεργοποίηση των κινασών MEK, ERK, JNK1/2 και p38 μετά από επαγωγή με TRAIL, σε αντίθεση με την αντίστοιχη κινητική ενεργοποίησης των ίδιων κινασών μετά από επαγωγή με ορό. Αντίστοιχη κινητική με αυτή των ΜΕΚ και ERK παρουσίασε η έκφραση του γονιδίου c- FOS μετά από επαγωγή με TRAIL ή ορό. Τα κύτταρα Caco2, DLD-1 και HT- 29 επωάστηκαν με χημικούς αναστολείς των κινασών ΜΕΚ για 16 h και ελέγχθηκε η έκφραση των DR4 και DR5. Τα επίπεδα των DR4 και DR5 μειώθηκαν και στις τρεις κυτταρικές σειρές ως συνέπεια της αναστολής της ΜΕΚ, ενώ η αναστολή των ΜΕΚ δεν επιρρέασε τα επίπεδα των FADD, FLIP, κασπάση 8, κασπάση 3 και τον υποδοχέα FAS που ανήκει στην ίδια οικογένεια με τους DR4 και DR5. Επιπλέον, ελέγχθηκε με ανάλυση FACS η έκφραση των υποδοχέων DR4, DR5 και FAS in vivo σε ζωντανά κύτταρα που προεπωάστηκαν με τον αναστολέα της ΜΕΚ και στους αντίστοιχους μάρτυρες και τα αποτελέσματα ήταν αντίστοιχα με αυτά των in vitro πειραμάτων. Οι παραπάνω παρατηρήσεις αποτελούν ισχυρές ενδείξεις για το συσχετισμό της ενεργοποίησης της οδού MEK/ERK/FOS με με την έκφραση των υποδοχέων DR4 και DR5 και με την ευαισθησία των κυττάρων στην TRAIL, καθώς κύτταρα HT-29 που προεπωάστηκαν με τον αναστολέα των ΜΕΚ παρουσίσαν μειωμένη ευαισθησία στην TRAIL. Για τον προσδιορισμό των διακριτών επιδράσεων των ογκογονιδίων RAS στον καρκίνο του παχέος εντέρου, διαμολύνθηκαν κύτταρα που προέρχονται από μέσο αδένωμα του παχέος εντέρου (Caco2) με τα ογκογονίδια Ki- και Ha-RAS. Μετά από εξέταση πολλών διαφορετικών κλώνων επιλέχθηκαν για λεπτομερέστερη ανάλυση κλώνοι οι οποίοι δεν υπερεκφράζουν την RAS σε πρωτεϊνικό επίπεδο πάνω από 3 φορές σε σχέση με την ενδογενή RAS των μητρικών κυττάρων. Επιπλέον, ελέγχθηκε αν οι κλώνοι που υπερεκφράζουν τις ογκογόνες RAS παρουσιάζουν αυξημένη σηματοδότηση προς μονοπάτια κυτταρικής σηματοδότησης που είναι γνωστό οτι ενεργοποιούνται από τις RAS. Τόσο οι κλώνοι Ki-RAS, όσο και οι Ha-RAS, έδειξαν να ενεργοποιούν τα μονοπάτια σηματοδότησης RAF/MEK/ERK και PI3K/AKT με τους Ha-RAS να προκαλούν ισχυρότερη ενεργοποίηση. Σχεδιάστηκαν πειράματα για τον καθορισμό του βαθμού της in vitro και in vivo κακοήθους εξαλλαγής. Τα πειράματα σε μαλακό άγαρ δείχνουν την αποτελεσματικότητα των καρκινικών κυττάρων να αναπτύσσονται δημιουργώντας αποικίες χωρίς να προσκολλώνται σε επιφάνεια. Οι δυο ισομορφές της RAS αύξησαν σημαντικά την ιδιότητα των Caco2 να σχηματίζουν αποικίες σε μαλακό άγαρ, ενώ η Ha-RAS παρουσίασε τη μεγαλύτερη ικανότητα. Για τον προσδιορισμό του βαθμού κακοήθους εξαλλαγής των κλώνων in vivo έγινε υποδόριος εμβολιασμός με περίπου 106 κύτταρα από τον κάθε κλώνο σε ποντίκια SCID. Τόσο η Κi-RASV12 όσο και η Ha-RASV12 αύξησαν την ικανότητα των Caco2 να σχηματίζουν όγκους σε ποντίκια SCID με την Ha-RAS να προκαλεί τον σχηματισμό περισσότερων και μεγαλύτερων όγκων. Για την περαιτέρω κατανόηση των μηχανισμών εξαλλαγής των κυττάρων από τα ογκογονίδια RAS αξιολογήθηκαν αποτελέσματα από ανάλυση γονιδιακών μικροσυστοιχιών. Μετά από ανάλυση του γονιδιακού προφίλ των CACO-RAS κλώνων και τα δυο ογκογονίδια βρέθηκαν να επάγουν την έκφραση γονιδίων που εμπλέκονται στην αγγειογένεση και στην προώθηση του καρκίνου, όπως τα γονίδια που κωδικοποιούν τους υποδοχείς VEGF και TGFβ. Σημειώνεται ότι μεταστατικοί δείκτες, όπως η Vimentin, που είναι και δείκτης της μετάβασης από επιθηλιακό σε μεσεγχυματικό φαινότυπο, βρέθηκαν να υπερεκφράζονται μόνο στους κλώνους Ha-RASV12. Ο in vitro και in vivo χαρακτηρισμός εξαλλαγμένων κυττάρων από τα ογκογονίδια RAS, καθώς και η ανάλυση μικροσυστοιχειών γονιδίων έδειξε ότι στο κυτταρικό μοντέλο που χρησιμοποιήθηκε το ογκογονίδιο Ha-RAS έχει αυξημένες εξαλλακτικές ιδιότητες. Τα ογκογονίδια RAS αύξησαν το βαθμό κακοήθους εξαλλαγής των κυττάρων Caco2 και ελέγχθηκε αν αυτό συνοδεύεται από αυξημένη ευαισθησία των κλώνων CACO2-RAS στην TRAIL. Μετρήθηκε η βιωσημότητα των κλώνων CACO2-RAS μετά από επαγώγη με TRAIL και φάνηκε ότι και τα δύο ογκογονίδια αύξησαν την ανταποκρισιμότητα των κυττάρων Caco2 στην TRAIL. Τα Caco2 που εξαλλάχθηκαν με την Ki- RASV12 ήταν λιγότερο ευαίσθητα στην TRAIL από ότι αυτά με τη Ha- RASV12 σε όλους τους κλώνους που ελέγχθηκαν. Ο έλεγχος της έκφρασης σημαντικών παραγόντων για την απόπτωση από την TRAIL έδειξε ότι οι πρωτεΐνες που παρουσίασαν τις μεγαλύτερες διαφοροποιήσεις στους κλώνους που υπερεκφράζουν τις RAS, σε σχέση με τα κύτταρα μάρτυρα, ήταν οι υποδοχείς DR4 και DR5. Παρόλο που οι κλώνοι Ha-RAS παρουσίασαν μεγαλύτερη ευαισθησία στην TRAIL, τα επίπεδα έκφρασης των DR4 και DR5 ήταν παρόμοια μεταξύ των κλώνων Ki-RAS και Ha-RAS. Για να ελεγχθεί κατά πόσο το μονοπάτι σηματοδότησης MEK/ERK παίζει ρόλο στην υπερέκφραση των υποδοχέων από τα ογκογονίδια RAS χρησιμοποιήθηκαν χημικοί αναστολείς της ΜΕΚ και ελέγθηκε η επίδρασή τους στα επίπεδα των DR4 και DR5. H χημική αναστολή της ΜΕΚ προκάλεσε μείωση των επιπέδων των φωσφορυλιωμένων ERK1/2 και των επιπέδων έκφρασης των DR4 και DR5 τόσο στους CACO-Κ15, όσο και στους CACO-Η2. Τέλος, ελέγχθηκε κατά πόσο η μείωση των DR4 και DR5 από την χημική αναστολή των ΜΕΚ μπορέι να έχει επίδραση στη δράση της TRAIL απέναντι στους κλώνους CACO2-RAS και βρέθηκε ότι προεπώση των Ha-RASV12 κλώνων για 16 h με χημικό αναστολέα των ΜΕΚ μέιωσε σημαντικά την ευαισθησία τους στην TRAIL. / In order to study the mechanism by which TRAIL (Tumor Necrosis Factor Related Apoptosis Inducing Ligand) induces apoptosis almost exclusively to cancer cells we used human colon cancer cell lines that represent different stages of carcinogenesis, from early adenoma to carcinoma. It was observed that early adenoma cells were resistant to TRAIL-induced apoptosis. On the contrary, cells that were derived from carcinomas were sensitive; while a correlation of the sensitivity of the cells to TRAIL-induced apoptosis to the presence of certain activated oncogenes was observed. In particular, the various isoforms of RAS oncogenes appear to play an important role in the responsiveness of the cancer cells to TRAIL as well as in regulating specific components which are essential for TRAIL signaling. RAS oncogenes play an important role in oncogenic transformation by activating various signaling pathways that favor tumor growth also by controlling cell division and resistance to apoptotic stimuli. TRAIL, however, has the unique ability to cause apoptosis preferentially to cancer cells by activating DR4 and DR5 receptors. In this study we show that in human colorectal adenocarcinomas cells the expression of DR4 and DR5 is partially regulated by the activity of MEK (MAPK/ERK Kinase). The sensitivity of the cell lines to TRAIL seemed to be correlated with the level of oncogenic transformation of the cells. In particular, the AAC1 and RGC2 cell lines that were derived from early adenomas and the Caco2 cell line that was derived from an intermediate adenoma were very resistant to TRAIL induced apoptosis. On the contrtary, the DLD-1 and HT-29 cell lines, which came from advanced stage carcinomas were sensitive to TRAIL. The Caco2 cell line, which is resistant to TRAIL and the cell lines that derived from advanced stage adenocarcinomas were chosen for expression analysis of important molecules in TRAIL-induced apoptosis. There was a correlation of DR4 and DR5 expression with the sensitivity of the cell lines to TRAIL, while the expression levels of FADD, Caspase 3, Caspase 8 and FLIP did not seem to correlate with TRAIL sensitivity in these cell lines. In addition, it was observed a prolonged activation of MEK, ERK1/2, JNK1/2 and p38 after induction with TRAIL, which did not follow the kinetics of serum-induced activation of ERK1/2. The activation of MEK and ERK1/2 was correlated to the kinetics of c-FOS proto-oncogene expression induced by TRAIL or serum. The expression levels of DR4 and DR5 were analysed after incubation for 16 h of the Caco2, DLD-1 and HT-29 cell lines with MEK inhibitors. There was a decrease of DR4 and DR5 expression levels in response to MEK inhibition, while the expression levels of FADD, Caspase 3, Caspase 8, FLIP and FAS receptor were not affected. Moreover, FACS analysis of living cells showed that MEK inhibition reduces the levels of DR4 and DR5 but not of other receptors of the same family, in vivo. It appears that the activation of the MEK/ERK/FOS axis plays a role in the positive feedback loop of TRAIL its receptors DR4 and DR5. To determine the distinct effects of different RAS oncogenes in cancer cells colon intermediate adenoma cells (Caco2) were chosen for transfection with the Ki- and Ha-RAS oncogenes. Clones that did not express more than 3 times the endogenous levels of RAS proteins were selected for further analysis. In addition it was examined whether the CACO2-RAS clones are able to activate the RAF/MEK/ERK and PI3K/AKT pathways, which are known effectors of RAS proteins. Both RAS isoforms activated these two pathways with the Ha-RASV12 clones presenting better potential in activating both RAF/MEK/ERK and PI3K/AKT pathways. In order to characterize the in vitro and in vivo oncogenic potential the ability of the CACO2-RAS clones to grow in soft agar and to grow tumors in nude mice was examined. The in vitro and in vivo characterization of the Caco2 RASV12-transformed cells showed that the Ha-RAS oncogene has a higher in vitro and in vivo transforming ability relative to the Ki-RAS oncogene in these cells. Results from cDNA microarray analysis were evaluated in order to further understand the mechanisms by which the RAS oncogenes cause oncogenic transformation. Gene expression profile analysis of the CACO2-RAS clones showed that both oncogenes induced expression of genes involved in angiogenesis and tumor promotion such as VEGF and TGFβ. Notably, metastatic markers, such as Vimentin, which is also an epithelial to mesenchymal transition marker, were overexpressed only in the Caco2 cells transformed with the Ha-RAS oncogene. The RAS oncogenes increased the oncogenic potential of the Caco2 cells and it was examined if the increased oncogenic potential correlated with increased sensitivity to TRAIL. Moreover, the examination of the expression levels of molecules important for TRAIL singnaling showed that Ki-RAS as well as Ha-RAS oncogenes can induce DR4 and DR5 expression with similar efficiency. However, in spite of similar induction of DR4 and DR5 by the two RAS oncogenes, the Ki-RAS-transformed cells were less susceptible to TRAIL induced apoptosis. Finally, in order to see whether the increased MEK/ERK activation observed in the CACO-RAS clones played a role in increasing DR4 and DR5 levels the CACO-RAS clones were incubated for 16h in the presence of MEK inhibitors. MEK inhibition resulted in decreased DR4 and DR5 expression levels, as well as decreased sensitivity of the clones to TRAIL induced apoptosis.

Η πορεία μιας οξείας σπειραματικής νόσου προς τη χρόνια νεφρική ανεπάρκεια χαρακτηρίζεται από φλεγμονώδεις διεργασίες που εντοπίζονται αρχικά στο σπείραμα, εν συνεχεία στον ενδιάμεσο χώρο, στα ουροφόρα σωληνάρια και τέλος στα νεφρικά αγγεία. Το πρωταρχικό αίτιο για την έναρξη των διεργασιών αυτών είναι η εναπόθεση ανοσοσυμπλεγμάτων στην περιοχή του σπειράματος και η ενεργοποίηση αντιδράσεων που οδηγούν τελικά στην εμφάνιση σπειραματικής σκλήρυνσης, ίνωσης του διαμέσου ιστού και ατροφίας των ουροφόρων σωληναρίων. Οι διεργασίες αυτές φαίνεται να πυροδοτούνται από κυτταροκίνες, όπως είναι οι ιντερλευκίνες (IL-1, IL-2, IL-6) και να εξελίσσονται περαιτέρω κάτω από την επίδραση αυξητικών παραγόντων, όπως είναι ο Transforming Growth Factor (TGF-β1), Epidermal Growth Factor (EGF) και Insulin-like Growth Factor (IGF-1). Πέραν των διεργασιών όμως αυτών, σημαντικό ρόλο στην ολοκλήρωση της καταστροφής του νεφρώνα, φαίνεται να διαδραματίζει ο ρυθμός απόπτωσης των κυττάρων των ουροφόρων σωληναρίων. Πράγματι η απόπτωση αποτελεί ένα σημαντικό μηχανισμό αποικοδόμησης των κυττάρων που σε συνεργασία με την αναγέννησή τους συμβάλλει στη σταθερότητα όλων των βιολογικών συστημάτων (ομοιόσταση). Ο ρυθμός της απόπτωσης των κυττάρων βρίσκεται σε μια σταθερή σχέση με τον ρυθμό αναγέννησης, έτσι ώστε κάθε βιολογικό σύστημα να παραμένει δομικά και λειτουργικά σταθερό. Οι πρωτεΐνες bax και bcl-2 έχουν αποδειχθεί αξιόπιστοι δείκτες της αποπτωτικής διαδικασίας. Η παρούσα μελέτη έχει σαν στόχο να εξετάσει ποιοτικά και ποσοτικά τη συμμετοχή των αυξητικών παραγόντων (TGF-β1, EGF, IGF-1) και των δεικτών της κυτταρικής απόπτωσης (πρωτεΐνες bax και bcl-2) σε ασθενείς με σπειραματικές βλάβες, παρουσία ιστολογικών αλλοιώσεων διαφορετικής βαρύτητας και κατ’ επέκταση διαταραχή της λειτουργίας του νεφρού. Συμπεριελήφθησαν 76 ασθενείς (44 άνδρες και 32 γυναίκες) στους οποίους, με βάση τα ιστολογικά ευρήματα στις βιοψίες του νεφρικού ιστού, ετέθησαν οι διαγνώσεις: ιδιοπαθής μεμβρανώδης σπειραματονεφρίτιδα (n=26), IgA νεφροπάθεια (n=15), νόσος ελαχίστων αλλοιώσεων (n=12), ταχέως εξελισσόμενη σπειραματονεφρίτιδα (n=11), εστιακή σπειραματοσκλήρυνση (n=7) και νεφρίτιδα του λύκου (n=5). Η μέση χρονική διάρκεια παρακολούθησης των ασθενών ήταν 4 χρόνια. Το είδος και η βαρύτητα των δομικών αλλοιώσεων του νεφρικού ιστού συσχετίσθηκαν με την πορεία της νεφρικής λειτουργίας, αλλά και με παραμέτρους των φλεγμονωδών διεργασιών που προσδιορίσθηκαν ανοσοϊστοχημικά, όπως είναι οι αυξητικοί παράγοντες TGF-β1, EGF και IGF-1, οι μυοϊνοβλάστες (κύτταρα που συμμετέχουν στη διαδικασία ανάπτυξης της ίνωσης) και οι δείκτες της κυτταρικής απόπτωσης (πρωτεΐνες bax και bcl-2). Διαπιστώθηκε, λοιπόν, ότι σε ασθενείς με σπειραματική βλάβη η παρουσία των αυξητικών παραγόντων, των μυοϊνοβλαστών και των δεικτών κυτταρικής απόπτωσης στα σπειράματα, στο διάμεσο χώρο και στα ουροφόρα σωληνάρια είναι έντονη. Μάλιστα αυτή του αυξητικού παράγοντα TGF-β1 των μυοϊνοβλαστών και των πρωτεϊνών bax και bcl-2 είναι εντονότερη σε ασθενείς με σημαντικού βαθμού σπειραματική σκλήρυνση, ίνωση του διάμεσου ιστού και ατροφία των ουροφόρων σωληναρίων. Διαπιστώθηκε επίσης σημαντική συσχέτιση της έκφρασης των παραμέτρων αυτών με τη βαρύτητα των ιστολογικών αλλοιώσεων (r=0.444, p<0.05) και το βαθμό έκπτωσης της νεφρικής λειτουργίας (r= 0.454, p<0.05) ενώ αντίθετα δεν παρατηρήθηκε συσχέτιση με τον τύπο της σπειραματικής βλάβης. Αυξημένος ρυθμός κυτταρικής απόπτωσης παρατηρήθηκε στο νεφρικό ιστό ασθενών με έκπτωση της νεφρικής λειτουργίας κατά τη διάγνωση της νόσου. Συμπερασματικά διαπιστώθηκε ότι : 1) Σε όλους τους ασθενείς, ανεξάρτητα από τον τύπο της σπειραματονεφρίτιδας, εντοπίζονται ανοσοϊστοχημικά αυξητικοί παράγοντες στο σπείραμα, στο διάμεσο ιστό και στα ουροφόρα σωληνάρια και μυοϊνοβλάστες κυρίως στο διάμεσο χώρο. 2) Η ποσοτική έκφραση των αυξητικών παραγόντων και ιδιαίτερα του TGF-β1 φαίνεται να σχετίζεται άμεσα με το βαθμό έκπτωσης της νεφρικής λειτουργίας και τη βαρύτητα των ιστολογικών αλλοιώσεων. 3) Ο ρυθμός της κυτταρικής απόπτωσης είναι ανάλογος της βαρύτητας των ιστολογικών αλλοιώσεων και του βαθμού έκπτωσης της νεφρικής λειτουργίας. / The evolution of an acute glomerular injury towards chronic renal failure is characterized by an inflammatory process that is initially localized in the glomeruli and then in the tubulointerstitial area and vessels of the kidney. The deposition of immune complexes in the glomeruli is the main cause of this process that leads to the development of glomerular sclerosis, interstitial fibrosis and tubular atrophy. In this process various cytokines [interleukins (IL), (IL-1, IL-2, IL-6)] and growth factors [Transforming Growth Factor-β (TGF-β), Epidermal Growth Factor (EGF) and Insulin Growth Factor (IGF-1)] are involved. The phenomenon of cellular apoptosis is implicated in the development of renal scarring. Apoptosis represents the programmed cellular death that is in balance with the generation of cells. The rate of cellular apoptosis is responsible for the preservation of homeostasis in each organism. Various genes and proteins are involved in the regulation of apoptosis within kidney. Bax and bcl-2 proteins represent markers of the apoptotic process since bax is related to an enhanced apoptotic rate whereas bcl-2 provides a survival advantage to renal cells. The aim of this study is to investigate the expression of growth factors (TGF-β1, EGF, IGF-1) and apoptotic markers (bax and bcl-2 proteins) in the renal tissue of patients with various types of glomerulonephritis and to identify any correlation of this expression with the severity of histological injury and with the course of renal function. Seventy six patients (44 males and 32 females) were included in the study. The histological diagnoses were: idiopathic membranous nephropathy (n=26), IgA nephropathy (n=15), minimal changes disease (n=12), rapidly progressive glomerulonephritis (n=11), focal segmental glomerulosclerosis (n=7) and lupus nephritis (n=5). The mean follow-up period was 4 years. The expression of growth factors, apoptotic markers and myofibroblasts (cells that are involved in the development of scarring) in the renal tissue was investigated by immunohistochemical technique and quantitated by morphometric analysis. In the renal tissue of patients with glomerulonephritis presence of growth factors, myofibroblasts and apoptotic markers was identified in the glomeruli and in the tubulointerstitial area. The expression of TGF-β1, myofibroblasts and bax, bcl-2 proteins was particularly severe in patients with glomerular sclerosis, interstitial fibrosis and tubular atrophy. The severity of this expression was related to the degree of histological damage (r=0.444, p<0.05) and that of renal impairment (r=0.454, p<0.05) whereas it was not related to the type of glomerulonephritis. In conclusion, it was found that: 1. Growth factors and myofibroblasts are localized in the glomeruli and in the tubulointerstitial area of patients with glomerulonephritis. 2. The severity of growth factors and in particular that of TGF-β1 expression is related to the degree of renal function impairment and to the severity of histological involvement. 3. The rate of cellular apoptosis in the kidney of patients with glomerulonephritis is also related to the severity of histological involvement and to the degree of renal function imparment.

Η χρονική και χωρική ρύθμιση της έναρξης της αντιγραφής του DNA συντονίζεται από τη διαδικασία της «αδειοδότησης της αντιγραφής», η οποία εξασφαλίζει ότι η αντιγραφή θα λάβει χώρα μόνο μία φορά ανά κυτταρικό κύκλο. Η αδειοδότηση της αντιγραφής περιλαμβάνει την κατά βήμα συγκρότηση ενός συμπλόκου πρωτεϊνών, του προαντιγραφικού συμπλόκου, στις περιοχές έναρξης της αντιγραφής. Μείζον συστατικό του συμπλόκου αυτού είναι η πρωτεΐνη Cdt1, η οποία επίσης αποτελεί πρωτεολυτικό στόχο των σημείων ελέγχου κυττάρων που φέρουν βλάβες στο DNA. Στα μετάζωα, υπάρχει μια μικρή πρωτεΐνη καλούμενη Geminin, η οποία προσδένεται στην πρωτεΐνη Cdt1, αναστέλλοντας την αδειοδότηση της αντιγραφής. Η πρωτεΐνη Geminin αλληλεπιδρά με ομοιοτικούς μεταγραφικούς παράγοντες και πρωτεΐνες που αναδιαμορφώνουν τη χρωματίνη και πιστεύεται ότι αποτελεί πιθανό κρίκο που συνδέει τις διαδικασίες του κυτταρικού κύκλου και της διαφοροποίησης. Στην παρούσα μελέτη δείξαμε πως η πρωτεΐνη Geminin κατατμείται σε πρωτογενή κύτταρα και καρκινικές κυτταρικές σειρές που οδηγούνται προς απόπτωση. Η κατάτμηση της πρωτεΐνης Geminin διαμεσολαβείται από την κασπάση- 3 τόσο in vivo όσο και in vitro. Δύο περιοχές στο καρβοξυτελικό τμήμα της Geminin (Κ1 και Κ2), στοχεύονται κατά την απόπτωση προκαλώντας τη δημιουργία θρυσμάτων της πρωτεΐνης Geminin. Δείξαμε ότι η κατάτμηση της πρωτεΐνης Geminin στη θέση Κ1 προάγει τον αποπτωτικό φαινότυπο και ρυθμίζεται μέσω φωσφορυλίωσης από την κινάση Casein Kinase II. Αντίθετα, μετά από κατάτμηση στη θέση Κ2, η πρωτεΐνη Geminin χάνει την ικανότητα αλληλεπίδρασης με την πρωτεΐνη Brm, καταλυτική υπομονάδα του συμπλόκου αναδιαμόρφωσης της χρωματίνης SWI/SNF, ενώ διατηρεί την ικανότητα να προσδένεται στην πρωτεΐνη Cdt1, υποδεικνύοντας πως η στόχευση της πρωτεΐνης Geminin κατά την απόπτωση, επηρεάζει διαφορικά τη λειτουργία του μορίου. Στο δεύτερο μέρος της εργασίας διερευνήσαμε τη ρύθμιση της πρωτεΐνης Cdt1 στο χώρο και στο χρόνο σε κύτταρα με βλάβες στο DNA. Για το σκοπό αυτό, χαρακτηρίσαμε μια μέθοδο που προκαλεί εντοπισμένες βλάβες στο DNA των κυττάρων, βασιζόμενη στη χρήση ενός παλμικού UVA laser. Με τη χρήση της μεθόδου αυτής, δείξαμε ότι η πρωτεΐνη Cdt1 συσσωρεύεται στην περιοχή της βλάβης τόσο σε καρκινικά όσο και πρωτογενή κύτταρα, παράλληλα με πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην κυτταρική απόκριση στη βλάβη (γH2AX, BRCA1, MRE11, Ku70, pATM κ.ά.). Η συσσώρευση της πρωτεΐνης Cdt1 λαμβάνει χώρα ταχύτατα και προηγείται της αποικοδόμησής της. Με τη δημιουργία μεταλλαγμένων μορφών της πρωτεΐνης Cdt1 και την καταστολή της έκφρασης πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν με την πρωτεΐνη Cdt1 με τη χρήση siRNA, δείξαμε πως η στρατολόγηση της πρωτεΐνης Cdt1 στην περιοχή της βλάβης απαιτεί αλληλεπίδραση με την πρωτεΐνη PCNA. Βρέθηκε πως η πρωτεΐνη Cdt2, που αποτελεί μέλος του συμπλόκου της λιγάσης της ουβικουϊτίνης Cul4-DDB1Cdt2 επίσης στρατολογείται στην περιοχή της βλάβης. Ποσοτικοποίηση της κινητικής συσσώρευσης πρωτεϊνών στην περιοχή της βλάβης έδειξε ότι η συσσώρευση της πρωτεΐνης Cdt1 υφίσταται κορεσμό νωρίτερα από τις πρωτεΐνες PCNA και Cdt2, ενώ αποσιώπηση της πρωτεΐνης Cdt1 δεν επηρεάζει τη στρατολόγηση των πρωτεϊνών PCNA και Cdt2. Πειράματα προσδιορισμού κινητικών αλληλεπιδράσεων με τη μέθοδο FRAP, έδειξαν ότι η πρωτεΐνη PCNA παραμένει σταθερά προσδεδεμένη στην περιοχή της βλάβης, ενώ η πρωτεΐνη Cdt1 εμφανίζει ιδιαίτερα γρήγορη κινητική. Οι μελέτες αυτές οδηγούν στο συμπέρασμα ότι η πρόκληση εντοπισμένης βλάβης στο DNA οδηγεί σε εντοπισμένη κυτταρική απόκριση και στη στρατολόγηση της πρωτεΐνης PCNA στην περιοχή της βλάβης η οποία δρά ως ικρίωμα για τη δυναμική αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης Cdt1. Συμπερασματικά, στο πρώτο μέρος της διδακτορική διατριβής περιγράφεται για πρώτη φορά ότι η πρωτεϊνη Geminin στοχεύεται για κατάτμηση κατά την απόπτωση, διαλευκάνονται τα μοριακά μονοπάτια που ρυθμίζουν το φαινόμενο αυτό και διερευνάται η φυσιολογική του σημασία. Προτείνεται ότι η στόχευση της Geminin από την κασπάση 3 επηρεάζει τη φυσιολογική ισορροπία μεταξύ κυτταρικού πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης. Στο δεύτερο μέρος της διδακτορικής διατριβής δείχνεται ότι η πρωτεϊνη Cdt1 στρατολογείται σε περιοχές της χρωματίνης που φέρους βλάβες στο DNA. Η στρατολόγηση της πρωτεΐνης Cdt1 στην περιοχή της βλάβης, παράλληλα με πρωτεϊνες απόκρισης στη βλάβη όπως οι BRCA1, pATM και Ku70, οδηγεί σε μία νέα υπόθεση για πιθανή εμπλοκή της πρωτεϊνης Cdt1 στην κυτταρική απόκριση σε βλάβες στο DNA. / The timely initiation of DNA replication is achieved through a process called licensing, which ensures that only after passage through mitosis the chromatin becomes competent for a new round of DNA replication. Licensing involves the stepwise formation of a multiprotein complex at the origins of replication, called prereplicative complex. A major component of this complex is Cdt1, which is also a critical and evolutionarily conserved proteolytic target of the DNA damage checkpoint. In metazoans, a small protein called Geminin binds to Cdt1, inhibiting replication licensing. Geminin has been proposed to coordinate cell cycle and differentiation events through balanced interactions with the cell cycle regulator Cdt1 and with homeobox transcription factors and chromatin remodeling activities implicated in cell fate decisions. Here we show that Geminin is cleaved in primary cells and cancer cell lines induced to undergo apoptosis by a variety of stimuli. Geminin targeting is mediated by caspase-3 both in vivo and in vitro. Two sites at the carboxyl terminus of Geminin are cleaved by the caspase (termed K1 and K2), producing truncated forms of Geminin. We provide evidence that Geminin cleavage is regulated by phosphorylation by Casein kinase II. Geminin cleaved at site K1 has a proapoptotic effect. Geminin cleaved at the site K2 has lost the ability to interact with Brahma (Brm), a catalytic subunit of the SWI/SNF chromatin remodeling complex, while binding efficiently to Cdt1, indicating that targeting of Geminin during apoptosis differentially affects interactions with its binding partners. In the second part of this thesis, we investigated the spatiotemporal regulation of Cdt1 in DNA-damaged cells. We introduced and characterized a method of inducing localized DNA damage, based on a UVA-pulsed laser. Using this method, we show that Cdt1 is recruited at the site of damage in parallel to the recruitment of known response factors, such as γH2AX, BRCA1, MRE11, Ku70 etc. Cdt1 recruitment at the site of damage precedes its degradation in both cancer cell lines and primary cells. Mutated forms of Cdt1 and siRNA for Cdt1-interacting proteins show that Cdt1 accumulation at the site of damage requires interactions with the protein PCNA. In addition, we found that Cdt2, a member of the Cul4-DDB1Cdt2 complex that ubiquitinates Cdt1 after DNA damage, is recruited at the site of damage. Experiments of knocking down the protein expression using siRNA and quantification of the recruitment kinetics address the molecular interplay of these proteins for the recruitment at the site of damage, while FRAP experiments revealed their dynamics. Taken together our results suggest that following DNA damage, PCNA is recruited to the site of damage, and acts as a scaffold for the dynamic interaction of Cdt1 with the damaged sites. The accumulation of Cdt1 at the site of damage suggest a possible involvement this cell cycle regulator in the DNA damage response.

- / -