Κατά την ανάπτυξη του οργανισμού, η απόκτηση εξειδικευμένων κυτταρικών λειτουργιών βασίζεται στην ασύμμετρη διαίρεση βλαστικών κυττάρων, την παραγωγή προγονικών κυττάρων και τη σταδιακή διαφοροποίησή τους. Η διαδικασία αυτή απαιτεί τον συντονισμό των μηχανισμών ελέγχου των κυτταρικών διαιρέσεων με επι-γενετικούς και μεταγραφικούς ρυθμιστικούς μηχανισμούς. Προκειμένου να κατανοήσουμε την ρύθμιση των μηχανισμών αυτών στα βλαστικά και πρόδρομα κύτταρα του αιμοποιητικού συστήματος, μελετήσαμε την πρωτεΐνη Geminin, η οποία έχει δειχθεί να συμμετέχει τόσο στην ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, όσο και στον έλεγχο των αποφάσεων για διαφοροποίηση. Σε προηγούμενα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν στο εργαστήριό μας απομονώθηκαν βλαστικά και προγονικά κύτταρα του αιμοποιητικού συστήματος από το εμβρυικό ήπαρ διαγονιδιακών μυών 15.5 ημερών που φέρουν ιστοειδική απαλοιφή της Geminin με την χρήση του Cre-LoxP συστήματος υπό τον έλεγχο των ρυθμιστικών στοιχείων του γονιδίου vav. Η αδρανοποίηση της Geminin στα βλαστικά και πρόδρομα κύτταρα του εμβρυικού ήπατος οδηγεί σε πρόωρο θάνατο και ανώμαλη ανάπτυξη του αιμοποιητικού συστήματος. Αποτελέσματα του εργαστηρίου μας προτείνουν πως η Geminin διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στις διαδικασίες της αυτό-ανανέωση και διαφοροποίηση των βλαστικών και προγονικών κυττάρων του αιμοποιητικού συστήματος. Για να διαλευκάνουμε τα μοριακά μονοπάτια στα οποία συμμετέχει η Geminin και για τον εντοπισμό του γονιδιακού δικτύου μέσω του οποίου η Geminin ελέγχει τις διαδικασίες αυτό-ανανέωσης και διαφοροποίησης του αιμοποιητικού συστήματος, πραγματοποιήσαμε πειράματα μικροσυστοιχιών DNA. Η παρούσα πτυχιακή εργασία εστιάστηκε στην ανάλυση της συγκριτική μελέτης του γονιδιώματος από τον κυτταρικό πληθυσμό βλαστικών και προγονικών κυττάρων του αιμοποιητικού συστήματος που πραγματοποιήθηκε μεταξύ γονιδιακά τροποποιημένων μυών και μυών μαρτύρων αγρίου τύπου. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης προτείνουν πως η έλλειψη της Geminin απορρυθμίζει την έκφραση σημαντικών αναπτυξιακών γονιδίων, όπως μεταγραφικών παραγόντων και ρυθμιστών αναδιάταξης της χρωματίνης που εμπλέκονται στην εμβρυική αιμοποίηση. Οι διαταραχές αυτές μπορούν να αιτιολογήσουν το φαινότυπο που παρουσιάζουν οι μύες στους οποίους έχουμε αδρανοποιήσει το γονίδιο της Geminin. Στο φαινότυπο αυτό παρατηρείται η συσσώρευση των βλαστικών κυττάρων και η ταυτόχρονη μείωση του πληθυσμού και της ικανότητας διαφοροποίησης των προγονικών κυττάρων του αιμοποιητικού συστήματος. / During the development of the organism, the acquisition of specialized cellular functions is based on the asymmetric division of stem cells, the production of progenitor cells and their gradual differentiation. This process requires the coordination of the cell proliferation control mechanisms by epigenetic and transcriptional regulatory mechanisms. In order to understand the regulation of these mechanisms in stem and progenitor cells of the hematopoietic system, we studied the protein Geminin, which has been shown to be involved in both cell cycle regulation and in differentiation decision control. In previous experiments conducted in our laboratory we isolated hematopoietic stem and progenitor cells from the fetal liver of transgenic mice at embryonic day 15.5. The transgenic mice bear tissue specific deletion of Geminin using the Cre-LoxP system under the control of regulatory elements of the vav gene. Inactivation of Geminin in stem and progenitor cells of the fetal liver leads to early death and abnormal development of the hematopoietic system. Previous results from our laboratory suggest that Geminin plays an important role in the self- renewal and differentiation processes of hematopoietic stem and progenitor cells. We performed cDNA microarray experiments to elucidate the molecular pathways and to identify the gene networks through which Geminin controls the self-renewal and differentiation processes in the hematopoietic system. The present study is focused on the whole genome comparison from the hematopoietic stem and progenitor cell population between transgenic mice and wild type mice, used as control samples. The results indicate the deregulation in the expression of important developmental genes like, transcription factors and chromatin rearrangement regulators involved in embryonic hematopoiesis. The abnormalities in gene expression caused by the absence of Geminin in the hematopoietic system of the embryos explain the presented phenotype which is characterized by the accumulation of stem cells and the simultaneous reduction of the progenitor cell population and their ability to differentiate.

Ο εγκεφαλικός φλοιός των θηλαστικών σχηματίζεται από το πιο πρόσθιο τμήμα του νευρικού σωλήνα, τον προσεγκέφαλο. Η ανάπτυξη του εγκεφαλικού φλοιού είναι μια διαδικασία που περιλαμβάνει την σωστή οργάνωση των πρόδρομων νευρικών κυττάρων σε συγκεκριμένες περιοχές του αναπτυσσόμενου φλοιού καθώς επίσης και την εμφάνιση τους σε καθορισμένη χρονική στιγμή κατά την πορεία της ανάπτυξης. Κατά την νευρογένεση όλοι οι νευρώνες του εγκεφαλικού φλοιού προέρχονται από το νευροεπιθήλιο που βρίσκεται δίπλα από τις πλευρικές κοιλίες. Τα νευροεπιθηλιακά κύτταρα αρχικά διαιρούνται με σκοπό την δημιουργία ικανού αριθμού πρόδρομων κυττάρων που θα μπορέσουν να δώσουν γένεση στον αναπτυσσόμενο φλοιό. Αργότερα, τα κύτταρα αυτά, διαφοροποιούνται προς τις άλλες κατηγορίες πρόδρομων κυττάρων και προς τους διαφοροποιημένους νευρώνες. Η ανάπτυξη του εγκεφαλικού φλοιού είναι μια διαδικασία που απαιτεί τον έλεγχο της ισορροπίας μεταξύ του πολλαπλασιασμού και της διαφοροποίησης των πρόδρομων νευρικών κυττάρων. Η Geminin έχει δειχτεί ότι ρυθμίζει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την διαφοροποίηση αποτελώντας έναν συνδετικό κρίκο μεταξύ των δυο αυτών διαδικασιών. Με σκοπό να διερευνήσουμε τον in vivo ρόλο της Geminin στη διατήρηση και διαφοροποίηση των πρόδρομων νευρικών κυττάρων του εγκεφαλικού φλοιού του μυός, αδρανοποιήσαμε το γονίδιο της Geminin ειδικά στα κύτταρα του αναπτυσσόμενου εγκεφαλικού φλοιού. Τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι η απαλοιφή της Geminin έχει ως αποτέλεσμα την επέκταση της κοιλιακής ζώνης του φλοιού ως συνέπεια της παραγωγής μεγαλύτερου αριθμού πρόδρομων κυττάρων στην κορυφαία περιοχή του φλοιού. Επιπλέον η απώλεια του γονιδίου της Geminin αυξάνει τον καθορισμό των βασικών προγονικών κυττάρων της υποκοιλιακής ζώνης του φλοιού. Ως άμεσο επακόλουθο η αύξηση του αριθμού των πρόδρομων κυττάρων στις νευρογενετικές ζώνες του φλοιού είναι η παραγωγή μεγαλύτερου αριθμού πλήρως διαφοροποιημένων νευρικών κυττάρων στον εγκεφαλικό φλοιό. Η μελέτη μας αναδεικνύει την Geminin ως μόριο κλειδί κατά την πορεία της ανάπτυξης του εγκεφαλικού φλοιού, στον καθορισμό του σωστού αριθμού των πρόδρομων κυττάρων, στην πορεία διαφοροποίησης αυτών και τελικά στον σχηματισμό του σωστού αριθμού των πλήρως διαφοροποιημένων νευρώνων. / The mammalian cerebral cortex originates from the most anterior part of the neural tube, the prosencephalon. The cortical development is a process that involves the correct orchestration of the different neuronal progenitor lineage of the cortex, which involves the regional patterning of progenitors and their temporal specification during neurogenesis. During neurogenesis, the cortical neurons are originated from the neuroepithelium that lies next to the lateral vesicles. At the beginning, the neuroepithelial cells divide in order to expand their population and to create the essential number of progenitor cells that would give rise to the neurons and glia that comprise the cortex, a procedure called self-renewal. Later on, the neuroepithelial cells start to switch from divisions that generate additional progenitor cells to divisions that generate committed progenitors or postmitotic cells. The development of cerebral cortex is a process that requires coordination of proliferation and differentiation of progenitor cells. It has been proposed that Geminin regulates both cell proliferation and differentiation. In order to investigate the in vivo role of Geminin in the maintenance and the differentiation of the neuronal progenitors of the cerebral cortex, we specifically inactivated the mouse Geminin gene in the developing cortex. Our results indicate that deletion of Geminin results in the expansion of the ventricular zone that leads to the production of a higher number of the apical cortical progenitors at the middle stage of cortical neurogenesis. In addition, the depletion of Geminin influences the number of basal progenitor of the subventricular zone. The increase of the apical and basal progenitor cells results in the overproduction of differentiated neurons of the developing cortex. Our work demonstrates Geminin as an important molecule for the development of the mouse cerebral cortex, regulating the correct number of cortical progenitors and the generation of the correct number of neurons and glial cells of the cerebral cortex.

Για τη διατήρηση της γονιδιωματικής σταθερότητας, είναι θεμελιώδους σημασίας η πραγματοποίηση της αντιγραφής του DNA με ακρίβεια και πιστότητα. Στη σωστή χρονικά έναρξη της αντιγραφής σημαντικό ρόλο κατέχει η «αδειοδότηση» της αντιγραφής, η οποία διασφαλίζει ότι η χρωματίνη είναι ικανή για τον επόμενο κύκλο αντιγραφής μόνο αφότου το κύτταρο έχει διέλθει από τη μίτωση. Η αδειοδότηση λαμβάνει χώρα μέσω της διαδοχικής συγκρότησης στις αφετηρίες της αντιγραφής, ενός πολύ-πρωτεϊνικού συμπλόκου, του καλούμενου προ-αντιγραφικού συμπλόκου. Απαραίτητος για τη συγκρότηση του προ-αντιγραφικού συμπλόκου είναι ο παράγοντας Cdt1. Στα μετάζωα, ένα μικρό μόριο, η Geminin, αναστέλλει τη δράση του Cdt1 κατά τις φάσεις S, G2 και Μ. Η Geminin είναι ένα μόριο με δομή σπειροειδούς σπειράματος, το οποίο συμμετέχει σε ευρύ φάσμα μοριακών αλληλεπιδράσεων και ελέγχει διαδικασίες του κυτταρικού κύκλου και της διαφοροποίησης. Η ρύθμιση της Geminin επιτυγχάνεται κύρια σε μεταγραφικό επίπεδο και μέσω πρωτεόλυσης, ενώ πρόσφατα δείχθηκε ότι μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις του μορίου διασφαλίζουν την απενεργοποίησή του κατά την G1. Για την εκδήλωση της δράσης της Geminin απαιτείται η παρουσία της πρωτεΐνης στον πυρήνα. Για την ενδοκυτταρική μελέτη της συμπεριφοράς της Geminin, δημιουργήσαμε υβριδικές μορφές του μορίου με την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP) και κατόπιν παροδικής διαμόλυνσης μελετήσαμε τον ενδοκυτταρικό του εντοπισμό. Η εξωγενής Geminin εντοπίζεται στον πυρήνα (όπως και το ενδογενές μόριο) σε έναν υποπληθυσμό ασύγχρονων κυττάρων αλλά επιπλέον, στα μισά κύτταρα του πληθυσμού, αποκλείεται από τον πυρήνα και συσσωρεύεται στο κυτταρόπλασμα. Η εμφάνιση της Geminin αποκλειστικά εκτός πυρήνα πραγματοποιείται σε κύτταρα που βρίσκονται στη φάση G1 του κυτταρικού κύκλου και συγκεκριμένα φαίνεται να λαμβάνει χώρα στο τέλος της G1 φάσης, πλησίον της μετάβασης από την G1 στην S. Κατά την είσοδο των κυττάρων στον κυτταρικό κύκλο από τη φάση ηρεμίας G0, το ποσοστό των κυττάρων που εκφράζουν την Geminin στο κυτταρόπλασμα αυξάνεται σημαντικά. Το γεγονός αυτό προσδίδει φυσιολογικό ρόλο στο φαινόμενο του αποκλεισμού της Geminin από τον πυρήνα και το συνδέει με την προαγωγή της αδειοδότησης της αντιγραφής πριν την είσοδο του κυττάρου στην S. Ανάλυση των επιμέρους περιοχών του μορίου με δημιουργία προοδευτικών απαλοιφών περιοχών της Geminin ανέδειξε το ρόλο της αμινοτελικής περιοχής του μορίου (aa 1-30) στον κυτταροπλασματικό εντοπισμό του. Ο πυρηνικός εντοπισμός της Geminin επάγεται από την κεντρική περιοχή του μορίου ενώ ένα αμινοτελικό πιθανολογούμενο NLS δε φαίνεται από μόνο του –τουλάχιστον- στην ανθρώπινη Geminin να αρκεί για τον πυρηνικό εντοπισμό της. Από τους παράγοντες που μελετήθηκαν, οι οποίοι θα μπορούσαν να επηρεάζουν in trans τον εντοπισμό της Geminin, το Cdt1, ο μοριακός συνοδός της Geminin, είναι ικανός να κατευθύνει τον αναστολέα του στον πυρήνα μετά από συνδιαμόλυνση σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα. Συνδιαμόλυνση με μορφές των δύο μορίων που δεν μπορούν να αλληλεπιδράσουν δεν οδηγεί σε πυρηνικό εντοπισμό της Geminin. Συμπεραίνουμε ότι το Cdt1 προκαλεί διαμετατόπιση της Geminin στον πυρήνα μέσω άμεσης αλληλεπίδρασης με αυτήν. Τα αποτελέσματά μας αναδεικνύουν έναν νέο τρόπο ρύθμισης της Geminin μέσω πυρηνικού αποκλεισμού και παρέχουν πληροφορίες για το πότε και πώς λαμβάνει χώρα αυτή η ρύθμιση. Πρόσφατα, στις ηλεκτρονικές βάσεις δεδομένων εντοπίσαμε έναν γονιδιακό τόπο που κωδικοποιεί για πρωτεϊνικό μόριο με μεγάλη ομολογία με το σπειροειδές σπείραμα (coiled-coil) της Geminin (Geminin cc-like ή Castor). Στην παρούσα μελέτη εξετάζεται η χωρο-χρονική έκφραση της Geminin cc-like (Castor), οι αλληλεπιδράσεις με υποψήφια μόρια και η συμπεριφορά του μορίου σε συνθήκες υπερέκφρασης και αποσιώπησης σε ανθρώπινα κύτταρα. Για τη μελέτη αυτή δημιουργήθηκε υβριδική μορφή της πρωτεΐνης με την GFP. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι Geminin cc-like (Castor) είναι πυρηνική πρωτεΐνη, όπως και η ενδογενής Geminin και η ενεργότητα σήματος πυρηνικού εντοπισμού φαίνεται να εδράζεται στην καρβοξυτελική περιοχή του μορίου. Η Geminin cc-like (Castor) αλληλεπιδρά με την Geminin και μάλιστα αποτελεί έναν ακόμη παράγοντα, μαζί με το Cdt1, που μπορεί να κατευθύνει in trans την Geminin στον πυρήνα. Πειράματα υπερέκφρασης παρέχουν ενδείξεις για παρεμπόδιση της εισόδου των κυττάρων στη φάση S, ενώ αποσιώπηση της Geminin cc-like (Castor) με τη χρήση RNAi φαίνεται να αυξάνει το ποσό της φωσφορυλιωμένης μορφής της ιστόνης H2Ax, δείκτη διπλών κατατμήσεων στο DNA. Από εξέταση για την ύπαρξη ορθολόγων σε άλλους οργανισμούς, βρέθηκε ορθόλογη πρωτεΐνη στον ιχθύ Oryzias latipes (medaka). Κλωνοποιήθηκε τμήμα του mRNA της O.l Castor πρωτεΐνης, πραγματοποιήθηκε ανάλυση της έκφρασης της Geminin cc-like (Castor) σε έμβρυα medaka καθώς και πειράματα υπερέκφρασης μετά από ένεση τμήματος του mRNA, τα οποία παρέχουν προκαταρκτικές ενδείξεις για ελαττωματικό σχηματισμό της κεφαλής και των οφθαλμών. Συμπερασματικά, μελετήσαμε μία νέα πρωτεϊνη στον άνθρωπο η οποία εμφανίζει μερική ομολογία προς την Geminin (Geminin cc-like ή Castor), και δείξαμε ότι αποτελεί ένα νέο μοριακό συνοδό της Geminin, με πιθανή συμμετοχή σε κυτταρικό κύκλο και διαφοροποίηση. / For genomic stability to be maintained, accurate regulation of replication has to be achieved. Replication licensing takes places during G1 and involves the stepwise formation of a multimeric complex, the pre-replicative complex (pre-RC), onto origins of replication, ensuring that chromatin will be competent for replication only once per cell cycle. Cdt1, a key component of this complex, is accurately regulated throughout cell cycle, through multiple mechanisms. Geminin, a metazoan-specific inhibitor of licensing, binds and inhibits Cdt1, thus preventing ectopic pre-RC formation during S, G2 and M. Geminin is regulated both at the level of transcription and proteolysis. Recently, it was also demonstrated that inactivation of non-proteolysed Geminin during G1 ensures timely formation of the pre-RC. Through its coiled-coil region, many interactions with binding partners are achieved, thus enabling participation in a variety of cellular processes during the cell cycle and differentiation. In order to study the intracellular behaviour of Geminin, fused forms of the molecule with the fluorescent protein GFP were constructed and transfected in MCF7 cells. Exogenous Geminin is located in the nucleus, similar to the endogenous molecule, in a subpopulation of asynchronously growing cells, but in approximately 50% of cells, Geminin is specifically excluded from the nucleus. Cytoplasmic localization of Geminin takes place during G1 and specifically during late G1, close to the G1 to S transition. In addition, upon exit from quiescence and cell cycle re-entry, cytoplasmic localization of Geminin increases notably. This may reflect a physiological role of Geminin exclusion to the cytoplasm upon cell cycle re-entry, in order to permit a ‘window of opportunity’ for licensing to take place prior to S phase onset. Progressive deletions of the Geminin molecule resulted in a variety of mutated forms which were then analysed for their ability to be localized to the nucleus or the cytoplasm. This analysis showed the importance of the aminoteminal region of Geminin (aa 1-30) in the cytoplasmic localization of the molecule. A putative nuclear localization activity was mapped to the central part of the molecule, while a proposed NLS at the aminoterminal part was shown to be neither sufficient nor required for nuclear localization. Amongst the factors tested, which could affect intracellular localization of Geminin, we show that Cdt1 possesses the ability to direct Geminin to the nucleus. Our data provide evidence for a novel means of regulation of Geminin by cell cycle dependant subcellular localization and offer insight on when and how this regulation takes place. Recently, in silico analysis revealed a gene locus in the human genome, coding for a predicted coiled coil protein with homology to Geminin. The gene product was initially named after this similarity as Geminin coiled coil-like (Geminin cc-like) and then renamed ‘Castor’. Present work examines the spatio-temporal expression of a hybrid Castor-GFP molecule, interactions with candidate molecular partners and the consequences for the cell of Castor overexpression or silencing. Our results show that exogenous Castor-GFP is localized in the nucleus and excluded from the nucleoli, similar to endogenous Geminin, whereas evidence for a putative NLS activity at the carboxy-terminus of the molecule is provided. Castor interacts with Geminin in cellular extracts and is sufficient to translocate Geminin-GFP to the nucleus, similar to Cdt1. Overexpression experiments provided evidence for a delayed G1 to S transition. Silensing Castor by siRNA led to an increase in γ-H2Ax staining, a marker of double strand breaks. Further in silico analysis revealed orthologues of Castor in other organisms, from mammals to fish. Part of the putative Castor mRNA in the fish Oryzias latipes (Medaka) was cloned. In vivo analysis of Castor in medaka involved expression pattern analysis by whole mount in situ hybridization and overexpression amalysis by mRNA injections, providing preliminary evidence for impaired forehead and eye formation. In conclusion, we have studied a novel protein with similarity to the coiled-coil region of Geminin (Geminin cc-like/ Castor) and showed that it constitutes a novel molecular partner of Geminin with possible roles during the cell cycle and in development.

Τόσο τα βλαστικά όσο και τα προγονικά κύτταρα συντονίζουν τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση για να δώσουν γένεση στον κατάλληλο αριθμό λειτουργικά εξειδικευμένων κυττάρων κατά την οργανογένεση. Διαφορετικές πειραματικές προσεγγίσεις ανέδειξαν τον ρόλο της πρωτεΐνης Geminin στη διατήρηση των προγονικών κυττάρων, τη συμμετοχή της στις αποφάσεις καθορισμού της αναπτυξιακής τους τύχης αλλά και την συμβολή της στην οργανογένεση. Αν και ο ακριβής μηχανισμός δεν είναι ξεκάθαρος, η Geminin φαίνεται να επηρεάζει την κατεύθυνση του πολλαπλασιασμού έναντι της διαφοροποίησης. Για να διαλευκανθεί ο ρόλος της Geminin in vivo στην κυτταρική διαίρεση και διαφοροποίηση των προγονικών κυττάρων, δημιουργήθηκαν ποντίκια που στερούνται την έκφραση της Geminin ειδικά στα κύτταρα της λεμφοειδούς σειράς μέσω Cre ανασυνδυασμού. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι η απουσία της Geminin έχει ελάχιστες επιπτώσεις στην ανάπτυξη και διαφοροποίηση των θυμοκυττάρων ενώ τα ώριμα περιφερειακά Τ κύτταρα που δεν εκφράζουν Geminin εμφανίζουν πολλές επιπτώσεις στον πολλαπλασιασμό μετά από in vitro ενεργοποίηση. Τα φυσικά φονικά κύτταρα (Natural Killer Cells) αναπτύσσονται στο μυελό των οστών από κοινά αρχέγονα κύτταρα και καθορίζονται από την ικανότητά τους να σκοτώνουν καρκινικούς στόχους χωρίς προηγούμενη ενεργοποίηση. Τα κύτταρα αυτά παίζουν σημαντικό ρόλο στις μη ειδικές αποκρίσεις και πέρα από την ισχυρή κυτταροτοξική δράση έναντι ευαίσθητων κυττάρων-στόχων χαρακτηρίζονται από την ικανότητα να απελευθερώνουν διάφορες κυτταροκίνες αποκρινόμενα άμεσα σε ενδοκυτταρικές μολύνσεις. Επιπρόσθετα, αποτελούν έναν κρίσιμο κυτταρικό πληθυσμό για την προστασία των ιικών μολύνσεων, καθώς αναγνωρίζουν με ειδικό τρόπο ιικά μολυσμένα κύτταρα και τα σκοτώνουν απευθείας. Για τους λόγους αυτούς παρουσιάζει ενδιαφέρον ο έλεγχος των τυχόν επιπτώσεων της απουσίας της Geminin στα ΝΚ κύτταρα. Με βασικό πειραματικό εργαλείο την κυτταρομετρία ροής, μελετήσαμε την αναπτυξιακή πορεία των φυσικών φονικών κυττάρων απουσία της Geminin. Σε κυτταρικά εναιωρήματα από σπλήνα και μυελό των οστών από Fl/koCD2Cre και Fl/WT πειραματόζωα, NK1.1+TCRβ- ΝΚ κύτταρα αναλύονται με κυτταρομετρία ροής για τον έλεγχο της έκφρασης μορίων-δεικτών των ώριμων ΝΚ κυττάρων. / The interplay of proliferation and differentiation is essential for normal development and organogenesis. Stem cells as wells as progenitor cells coordinate these cellular decisions to give rise to the appropriate number of differentiated cells with specific function. Geminin was identified through two parallel lines of investigation as both a regulator of DNA replication and a regulator of differentiation of neural cells. In order to address the in vivo role of Geminin in regulating progenitor cell self-renewal and differentiation decisions in different cellular systems, have been generated mice that allow the conditional inactivation of the mouse Geminin gene in cells giving rise to the lymphoid lineage. Natural Killer Cells are lymphocytes of the innate immunity with effector function such as perforin-dependent cytotoxicity and interferon-γ secretion. Several lines of evidence implicate them in the early control of virus infection, in tumor immunoserveillance and in the regulation of immune responses. Mature NK cells express a wide variety of cell surface receptors that enable them to recognize targets expressing low surface amounts of major histocompatibility complex class I molecules or high surface amounts of molecules induced by stress or microbial molecules. NK cells generation occurs in the bone marrow from hematopoietic stem cells. In this study, we shed light to the in vivo role of Geminin in the development and differentiation of Natural Killer Cells. Cell suspensions from bone marrow and spleen from Fl/koCD2Cre mice that lack Geminin expression in the lymphoid lineage and Fl/WT mice that serves as controls were analyzed with flow cytometry. NK1.1+TCRβ- ΝΚ cells were analysed for surface receptors, markers of mature NK cells.

Τα κύτταρα της νευρικής ακρολοφίας (Neural Crest Cells - NCCs) αποτελούν έναν πολυδύναμο, μεταναστευτικό πληθυσμός βλαστικών κυττάρων τα οποία δίνουν γένεση σε μια πληθώρα κυτταρικών τύπων κατά την ανάπτυξη των σπονδυλωτών, συμπεριλαμβανομένων των νευρώνων και των νευρογλοιακών κυττάρων του περιφερικού νευρικού συστήματος (ΠΝΣ). Η δημιουργία των κυττάρων της νευρικής ακρολοφίας πραγματοποιείται στο στάδιο της γαστριδίωσης μετά την επαγωγή της νευρικής πλάκας. Οι διαδικασίες αυτές επηρεάζονται από σηματοδοτικά μονοπάτια στα οποία εμπλέκονται τόσο μεταγραφικοί παράγοντες όσο και επιγενετικοί τροποποιητές . Το Εντερικό Νευρικό Σύστημα (ΕΝΣ), προέρχεται από τα κύτταρα της νευρικής ακρολοφίας της αυχενικής και της ιερής μοίρας και ελέγχει την ομαλή λειτουργία της γαστρεντερικής οδού. Τα κύτταρα της νευρικής ακρολοφίας της αυχενικής μοίρας αποικίζουν ολόκληρο τον εντερικό σωλήνα και δίνουν γένεση στο ΕΝΣ ξεκινώντας από την 9η εμβρυική ημέρα. Η δημιουργία ενός πλήρως λειτουργικού ΕΝΣ εξαρτάται από την ικανότητα μετανάστευσης, πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης των NCCs. Στόχος της παρούσας διπλωματικής εργασίας ήταν η μελέτη της έκφρασης γονιδίων που ελέγχουν τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση τόσο των πρόδρομων κυττάρων της νευρικής ακρολοφίας όσο και των NCCs που έχουν δεσμευτεί προς εντερική μοίρα σε έμβρυα μυός απουσία της πρωτεΐνης Geminin. Η Geminin είναι μια πρωτεΐνη που έχει δειχθεί να επηρεάζει την ισορροπία μεταξύ αυτο-ανανέωσης και διαφοροποίησης, μέσω της αλληλεπίδρασης της με μεταγραφικούς παράγοντες και πρωτεΐνες αναδιαμόρφωσης της χρωματίνης. Με σκοπό να διερευνήσουμε τον in vivo ρόλο της Geminin στα κύτταρα της νευρικής ακρολοφίας, δημιουργήσαμε διαγονιδιακούς μύες από τους οποίους αδρανοποιήσαμε το γονίδιο της Geminin ειδικά στα κύτταρα της νευρικής ακρολοφίας. Τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι η απουσία της Geminin από τα κύτταρα της νευρικής ακρολοφίας, οδηγεί στη δημιουργία εμβρύων με μορφολογικές αλλοιώσεις κατά τα πρώιμα στάδια της ανάπτυξης ενώ σε μεταγενέστερα αναπτυξιακά στάδια χαρακτηρίζονται από σοβαρές κρανιοπροσωπικές δυσμορφίες. Επιπλέον, η ιστοειδική αδρανοποίηση της Geminin οδήγησε σε απορρύθμιση των επιπέδων έκφρασης γονιδίων που επηρεάζουν τόσο την επαγωγή όσο και τη μετανάστευση των NCCs (mChd7, mSnail2, mTwist2,mFoxD3) κατά την 10.5η εμβρυική ημέρα. Μελέτη του κυτταρικού κύκλου των εντερικών κυττάρων νευρικής ακρολοφίας έδειξε ότι η αποσιώπηση της Geminin διαταράσσει το προφίλ του κυτταρικού τους κύκλου καθώς τα κύτταρα αυτά «μπλοκάρουν» κατά τη μετάβαση από την G2 στη Μ φάση (E9.5). Συμπερασματικά, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η Geminin συμμετέχει ενεργά στον ρύθμιση της έκφρασης γονιδίων που παίζουν σημαντικό ρόλο στην επαγωγή και τη μετανάστευση των NCCs κατά τα πρώιμα στάδια της εμβρυικής ανάπτυξης (Ε10.5). Τέλος, η Geminin διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στον πολλαπλασιασμό των πρόδρομων κυττάρων του εντερικού νευρικού συστήματος (Ε9.5). / Neural Crest cells (NCCs) comprise a multipotent, migratory cell population that generates a diverse array of cell and tissue types during vertebrate development, including neurons and glial cells of Peripheral Nervous System (PNS). The induction of neural crest specification occurs at the end of gastrulation at the neural plate border initiate an epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) that transforms these stationary cells into migratory cells. These processes are influenced by changes in the expression of transcription factors and epigenetic regulators. The Enteric Nervous System (ENS), is a subdivision of the PNS that controls the function of the gastrointestinal (GI) tract and is derived from the Vagal and Sacral NCCs. The formation of a fully functional ENS depends on the coordinated proliferation and differentiation decisions of NCCs. Vagal NCCs emigrate from the vagal region of the neural tube (somites 1-7), in a rostal to caudal direction and enter the foregut at embryonic day E9-9.5 (in mice), generating the ENS. The formation of a fully functional ENS depends on proliferation and differentiation decisions of NCCs. The aim of our work was to study the expression of genes that control self-renewal decisions and migration ability of the NCCs in mouse embryos in the absence of Geminin. Towards this direction we studied the in vivo role of Geminin in the early stages of NCCs development and in the developing ENS. Geminin is a Protein that has been shown to affect the balance between self-renewal and differentiation through multiple interactions with transcription factors and chromatin remodeling proteins. In order to further elucidate the in vivo role of Geminin in NCCs, we generated transgenic mice lacking Geminin expression specifically in NCCs. We have shown that the deletion of Geminin in NCCs, causes severe morphological and craniofacial malformation during embryonic development. The conditional inactivation of Geminin resulted in the deregulation of various genes that affect the induction and migration of NCCs (mChd7, mSnail2, mTwist2, mFoxD3) at E10.5. Examination of the cell cycle profile of enteric NCCs showed that the deletion of Geminin disrupted the proliferation of NCCs as cells are blocked at the transition from G2 to M phase (E9.5). In conclusion, our results highlight Geminin as an important molecule during the induction and migration of NCCs at the early stages of mouse embryonic development (10.5). Finally, Geminin plays an important role for the proliferation of ENS progenitor cells (E9.5).

Η geminin δρα ως ρυθμιστής του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης συμμετέχοντας στην οργάνωση της χρωματίνης και των μεταγραφικών προγραμμάτων των πρόγονων κυττάρων μέσω της αλληλεπίδρασης της με διάφορους παράγοντες. Ο αυστηρός έλεγχος του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της διαφοροποίησης είναι βασικός για την παραγωγή του κατάλληλου αριθμού και τύπου κυττάρων που συμμετέχουν στην οργανογένεση. Επιπλέον η ικανότητα αυτό-ανανέωσης των πρόδρομων κυττάρων βασίζεται στον πολλαπλασιασμό τους, χωρίς διαφοροποίηση και είναι απαραίτητη για την ανανέωση των ιστών. Ωστόσο η απορρύθμιση των μηχανισμών που ελέγχουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό είναι επιζήμια για τον οργανισμό αφού είναι το πρώτο βήμα κατά την καρκινογένεση. Η κυτταρική γήρανση έχει προταθεί ότι είναι ένας ογκοκατασταλτικός μηχανισμός. Στην παρούσα μελέτη διερευνήσαμε το ρόλο της geminin στην ρύθμιση των φυσιολογικών κυτταρικών διαδικασιών της διαφοροποίησης και της γήρανσης. Για αυτό το σκοπό, χρησιμοποιήσαμε ποντικούς στους οποίους η geminin απενεργοποιείται ειδικά στην λεμφοειδή κυτταρική σειρά. Δείξαμε ότι η απουσία της geminin οδηγεί σε μείωση του συνολικού αριθμού κυττάρων του θύμου και του σπλήνα. Επιπρόσθετα οι CD4 και CD8 Τ κυτταρικοί πληθυσμοί επηρεάστηκαν από την απενεργοποίηση της geminin. Για την εύρεση ενός πιθανού ρυθμιστικού ρόλου της geminin στην επαγωγή κυτταρικής γήρανσης χρησιμοποιήσαμε ινοβλάστες ποντικού που εκφράζουν μειωμένα επίπεδα της πρωτεΐνης. Δείξαμε ότι οι ινοβλάστες με μειωμένα επίπεδα της geminin παρουσιάζουν φαινότυπο γήρανσης νωρίτερα από τους ινοβλάστες αγρίου τύπου όπως καθορίστηκε από τη χρώση για σχετιζόμενη με γήρανση β-γαλακτοσιδάση. / Geminin acts as a coordinator of proliferation and differentiation by regulating the chromatin organization and transcription programs of progenitor cells through its interaction with several partners. The tight control of proliferation and differentiation, is essential in the generation of mature cells of the proper number and type necessary for organ formation. Moreover the self-renewing capacity of progenitor cells depends on proliferation without differentiation of the cells and is indispensable in tissue regeneration. However the deregulation of the mechanisms that control the proliferation capacity of a cell has deleterious effects for the organisms since it is the first step of carcinogenesis. Cellular senescence was proposed to be a tumour-suppressive mechanism. In the present study we addressed the role of geminin in the physiological processes of cellular differentiation and senescence. We have used a mouse line in which geminin is specifically inactivated in the lymphoid lineage. We showed that geminin’s absence leads to reductions in the thymic and splenic cellularities. In addition to that, CD4 and CD8 T cell populations of the thymus and the spleen of conditional KO animals, were affected by geminin’s ablation. To study a potential regulatory role of geminin in the induction of cellular senescence we used mouse fibroblasts that express reduced levels of the protein. We found that the fibroblasts with reduced levels of geminin’s expression present senescent phenotype earlier than the WT fibroblasts as determined by SA-β-gal staining. 9

Η αδειοδότηση της αντιγραφής διασφαλίζει την ακεραιότητα της γενετικής πληροφορίας κατά τη μεταβίβασή της στα θυγατρικά κύτταρα και εξασφαλίζει ότι το DNA αντιγράφεται μία μόνο φορά κατά τη διάρκεια του ίδιου κυτταρικού κύκλου. Η πρωτεΐνη Cdt1 αποτελεί σημαντικό παράγοντα αδειοδότησης και συσσωρεύεται κατά τη G1 φάση του κυτταρικού κύκλου. Φυσικός αναστολέας της Cdt1 είναι η Geminin, που εκφράζεται καθ’όλες τις φάσεις του κυτταρικού κύκλου, εκτός από τη G1. Η διατήρηση της ισορροπίας της έκφρασης των πρωτεϊνών Cdt1 και Geminin είναι σημαντική για τη διασφάλιση της γενετικής ακεραιότητας. Αποσιώπηση της Geminin ή υπερέκφραση της Cdt1 μπορεί να οδηγήσει σε εκτοπική επανέναρξη της αντιγραφής. Σε ποντίκια, η υπερέκφραση της Cdt1 συμβάλλει στην εμφάνιση κακοήθειας, γεγονός που αποδεικνύει το ρόλο της πρωτεΐνης ως ογκογονίδιο. Πρόσφατες μελέτες υποδεικνύουν ότι μόρια που συμμετέχουν στο μηχανισμό αδειοδότησης της αντιγραφής μπορούν να χρησιμεύσουν ως προγνωστικοί-διαγνωστικοί δείκτες. Υψηλά επίπεδα έκφρασης των MCMs και της Geminin έχουν παρατηρηθεί σε διάφορες κακοήθειες και έχουν συσχετιστεί με κλινικοπαθολογικές παραμέτρους της ασθένειας. Αν και έχει δειχθεί ότι η Cdt1 διαθέτει ογκογόνο δράση, ελάχιστα δεδομένα είναι διαθέσιμα, μέχρι στιγμής, αναφορικά με τα επίπεδα έκφρασής της σε κακοήθεις καταστάσεις και με την πιθανή χρήση της ως βιολογικού δείκτη. Αρχικός στόχος αυτής της εργασίας ήταν η έκφραση ενός τμήματος της Cdt1 πρωτεΐνης για την ανοσοποίηση κουνελιών και την παραγωγή αντισώματος. Συγκεκριμένα πραγματοποιήθηκε έκφραση της υβριδικής GST-C391 hCdt1 πρωτεΐνης σε ετερόλογο βακτηριακό σύστημα έκφρασης. Παράλληλα πραγματοποιήθκε έκφραση ενός ακόμη τμήματος της hCdt1 που έφερε τον επίτοπο His. Η δεύτερη υβριδική πρωτεΐνη (His-ΔΝ Cdt1) χρησιμοποιήθηκε για τον καθαρισμό των αντιορρών των ανοσοποιημένων ζώων και την απομόνωση του αντισώματος. Η ειδικότητα του καθαρισμένου αντισώματος πιστοποιήθηκε με ανοσοφθορισμό και ανοσοαποτύπωση western σε δύο καρκινικές κυτταρικές σειρές, στα HeLa και στα MCF7. Επιπλέον, πειράματα ανοσοϊστοχημειας σε τομές από περιστατικά καρκίνου μαστού επιβεβαίωσαν τη δυνατότητα χρήσης του αντισώματος σε ιστικές τομές παραφίνης. Η εξέταση των πρωτεϊνικών επιπέδων έκφρασης της Cdt1 έδειξε σημαντική υπερέκφραση της πρωτεΐνης στον όγκο σε σχέση με τον παρακείμενο φυσιολογικο ιστό. Επιπλέον, στην παρούσα εργασία προσδιορίστηκαν τα επίπεδα έκφρασης του mRNA των Cdt1 και Geminin, με τη μέθοδο της Real-Time PCR, σε δύο καρκινικές κυτταρικές σειρές (HeLa και MCF7) και σε πρωτογενείς ανθρώπινους ινοβλάστες. Διαπιστώθηκε αύξηση των επιπέδων έκφρασης του mRNA του Cdt1 κατά δύο φορές στις δύο καρκινικές κυτταρικές σειρές, σε σχέση με τους ινοβλάστες. Αντίθετα, η Geminin, εκφράζεται περισσότερο κατά δύο φορές στα HeLa σε σχέση με τα φυσιολογικά κύτταρα, ενώ στα MCF7 τα επίπεδά της είναι υποδιπλάσια σε σχέση με τους ινοβλάστες. Επομένως, ο λόγος των Cdt1/Geminin επηρεάζεται με διαφορετικό τρόπο στις δύο καρκινικές σειρες: στα HeLa φαίνεται ότι διατηρείται σταθερός, σε σχέση με τους ινοβλάστες, ενώ στα MCF7 παρουσιάζεται τετραπλάσιος. / -

Η ισορροπία μεταξύ κυτταρικού πολλαπλασιασμού και κυτταρικής διαφοροποίησης είναι εξέχουσας σημασίας κατά την ανάπτυξη των πολυκύτταρων οργανισμών. Κεντρικοί ρυθμιστές του κυτταρικού κύκλου έχει δειχθεί να συμμετέχουν και σε διαδικασίες κυτταρικής διαφοροποίησης, όπως η οικογένεια των E2F μεταγραφικών παραγόντων, το pRb και οι αναστολείς των κυκλινοεξατώμενων κινασών (CKIs). H Geminin είναι μία πρωτεΐνη με διττό ρόλο τόσο στον κυτταρικό κύκλο όσο και στην ανάπτυξη, η οποία έχει προταθεί σαν ένας πιθανός ρυθμιστής αυτών των διαδικασιών. H Geminin εμφανίζει διαφορετικές δράσεις, αλληλεπιδρώντας με ένα σημαντικό αριθμό κυτταρικών παραγόντων. Σε αυτές τις αλληλεπιδράσεις σημαντικό ρόλο παίζει η περιοχή του σπειροειδούς σπειράματος της Geminin. Πρόσφατα, μέσω βιοπληροφορικών αναλύσεων βρέθηκε ένας γενετικός τόπος στο ανθρώπινο γονιδίωμα ο οποίος κωδικοποιεί για μία πρωτεϊνική αλληλουχία με σημαντική ομολογία με το σπειροειδές σπείραμα της Geminin. H πρωτεΐνη αυτή ονομάστηκε Castor. Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν εργαλεία βιοπληροφορικής, για την ανάλυση της πρωτεϊνικής αλληλουχίας του Castor και τη σύγκριση αυτής με την Geminin. Στη συνέχεια, μελετήθηκε με την μέθοδο της ανοσοκατακρήμνισης η αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης Castor με τη Geminin και ο ομοδιμερισμός του Castor και χαρτογραφήθηκαν οι περιοχές που ευθύνονται για τις αλληλεπιδράσεις αυτές.. Ο Castor σχηματίζει σύμπλοκο με την Geminin και η αλληλεπίδραση αυτή απαιτεί το σπειροειδές σπείραμα της Geminin και τα 254 καρβοξυτελικά αμινοξέα του Castor, στα οποία περιέχεται το σπειροειδές σπείραμα του. Τα τελευταία 254 αμινοξέα είναι υπεύθυνα και για τον ομοδιμερισμό του μορίου. Σύγκριση της ισχύος αλληλεπιδράσεων έδειξε ότι η αλληλεπίδραση μεταξύ Castor και Geminin είναι ισχυρότερη από τον ομοδιμερισμό του Castor, αφού η Geminin δύναται να ανταγωνιστεί την πρόσδεση του Castor στον εαυτό του. Τέλος, αναπτύχθηκαν μοριακά εργαλεία απαραίτητα για τη μελέτη του Castor. To πρώτο αφορά την παραγωγή και καθαρισμό πολυκλωνικού αντισώματος κατά αμινοτελικού τμήματος της Castor πρωτεΐνης. Η ειδικότητα του αντισώματος ελέγχθηκε με ανοσοτύπωση Western. To αντίσωμα είναι λειτουργικό αφού αναγνωρίζει την εξωγενή πρωτεΐνη CastorGFP ενώ δεν μπορούν να εξαχθούν ασφαλή συμπεράσματα για την ενδογενή ανθρώπινη πρωτεΐνη. Το δεύτερο αφορά την 7 ανάπτυξη της μεθοδολογίας RNAi για την αποσιώπηση του γονιδίου του Castor σε κυτταρικές σειρές. Η λειτουργικότητα του RNAi ελέγχθηκε τόσο σε ανοσοτύπωση Western όσο και σε ανοσοφθορισμό σε σταθερά διαμολυσμένη με CastorGFP κυτταρική σειρά και είναι λειτουργικό. Τα παραπάνω εργαλεία είναι απαραίτητα για μελλοντικές λειτουργικές μελέτες του Castor. / Τhe coordination of cellular proliferation and differentiation is of critical importance for the development of multicellular organisms. Cell cycle regulators have been shown to participate in the regulation of these two processes, such as E2F transcriptional factors family, pRb and Cdk inhibitors (CKIs). Geminin is a bifunctional protein participating in cell cycle regulation and in developmental processes and has been proposed as a candidate for the regulation of these two processes. Geminin balanced interactions with various binding partners are central to its different function. In these interactions the coiled coil of Geminin plays an important role not only as a binding interface but also maintaining the structural integrity of the molecule. Recently in silico analysis has revealed a new genetic locus in the human genome that codes for a protein with significant homology to the Geminin coiled coil region. This protein is named Castor. In this study, in silico analysis was performed to examine the expression of the molecule by analyzing the available ESTs, sequence analysis of Castor protein and comparison to Geminin structural and functional motifs. . We also studied the molecular interaction between Geminin and Castor and Castror homodimerization. We show that Geminin formes a complex with Castor.The coiled coil of Geminin is required for the interaction. Castor interacts with Geminin through its 254 C-terminal amino acids which include its coiled coil. The 254 C-terminal amino acids are also responsible for the self-association of the molecule. We further wanted to established which interaction, the heterodimerazition with Geminin or Castor homodimerazition is stronger. Geminin interacts stronger with Castor, than Castor with itself since overexpressing Geminin and Castor together results in full binding of Castor to Geminin Finally we developed molecular tools required for the functional study of the molecule. Firstly, a specific polyclonal antibody against the N terimus of Castor was 8 produced and then affinity purified. The specificity of the antibody was tested by Western blotting analysis. The antibody recognizes the transfected CastorGFP protein, but no safe conclusion can be drawn for the endogenous protein. Secondly, silencing Castor by RNAi technique for silencing Castor gene in cell lines was set up. The effect of the RNAi was tested by Western blotting and immunofluorescence in CastorGFP stable cell lines. These tools will be required in future studies for investigating the function of Castor.

Η απόπτωση είναι μια βασικής σημασίας βιολογική διαδικασία η οποία απαιτείται για τη διατήρηση της ακεραιότητας και της ομοιόστασης στους πολυκύτταρους οργανισμούς. Αντίθετα, δυσλειτουργία της αποπτωτικής διαδικασίας διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην παθογένεια μιας ευρείας κλίμακας ανθρώπινων παθολογικών καταστάσεων συμπεριλαμβανομένων νευροεκφυλιστικών διαταραχών και καρκίνο. Η αποπτωτική διαδικασία περιλαμβάνει την ενεργοποίηση ενός αρκετά συντηρημένου μεταξύ των οργανισμών βιοχημικού μονοπατιού, στο τελευταίο στάδιο του οποίου βρίσκεται η ενεργοποίηση μιας οικογένειας πρωτεασών που ονομάζονται κασπάσες. Οι πρωτεάσες αυτές κατατμούν μεγάλο αριθμό πρωτεϊνών – στόχων, η κατάτμηση των οποίων και η αλλαγή των λειτουργικών χαρακτηριστικών τους προάγει τον αποπτωτικό φαινότυπο. Στις πρωτεΐνες-στόχους της αποπτωτικής διαδικασίας περιλαμβάνονται δομικές πρωτεΐνες του πυρήνα και του κυτταροσκελετού, πρωτεΐνες που ενέχονται άμεσα στην αποπτωτική διαδικασία, στην κυτταρική σηματοδότηση, στην αντιγραφή του DNA, την επιδιόρθωση των βλαβών του, αλλά και πρωτεΐνες που συμμετέχουν στην αδειοδότηση της αντιγραφής. Η αδειοδότηση της αντιγραφής είναι μια διαδικασία η οποία εξασφαλίζει πως μόνο μετά από τη διαμεσολάβηση της φάσης της μίτωσης η χρωματίνη καθίσταται ικανή για έναν νέο κύκλο αντιγραφής του DNA. Ένα σύμπλοκο πρωτεϊνών ρυθμίζει τη διαδικασία αυτή, μείζον συστατικό του οποίου είναι η πρωτεΐνη Cdt1 η οποία είναι συντηρημένη από τις ζύμες έως τα θηλαστικά. Στα σπονδυλωτά, η πρωτεΐνη Geminin, είναι ο αρνητικός ρυθμιστής του Cdt1 προσφέροντας ένα επιπρόσθετο επίπεδο ρύθμισης του Cdt1. Στις πρωτεΐνες που ενέχονται στην παραπάνω διαδικασία συμπεριλαμβάνονται οι πρωτεΐνες Orc1-6, Cdc6, MCM2-7, από τις οποίες οι πρωτεΐνες Cdc6 και MCM3 έχει δειχθεί ότι αποτελούν στόχους των κασπασών και της αποπτωτικής διαδικασίας. Στόχος της παρούσης εργασίας ήταν ο έλεγχος μιας πιθανής στόχευσης του μέλους του προαντιγραφικού συμπλόκου Cdt1 και του αρνητικού ρυθμιστή του Geminin κατά την απόπτωση. Διαπιστώθηκε πως σε αποπτωτικά κύτταρα η πρωτεΐνη Geminin στοχεύεται και κατατμείται. Η κατάτμηση αυτή προκύπτει μετά από στόχευση της Geminin από την κασπάση-3 και παρατηρήθηκε τόσο σε in vivo συνθήκες όσο και μετά την in vitro επώαση ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης Geminin με ανασυνδυασμένη κασπάση-3. Η χαρτογράφηση της θέσης της κατάτμησης της Geminin από την κασπάση-3 επέδειξε το καρβοξυτελικό της άκρο της Geminin ως τον πρωτεολυτικό στόχο της κασπάσης-3, προτείνοντας υποθετικές αλλαγές στη φυσιολογική λειτουργία της πρωτεΐνης. / Apoptosis is an essential biological process required for the maintenance of integrity and homeostasis of multicellular organisms. Deregulation of apoptosis plays an important role in the pathogenesis of a wide range of human diseases including neurodegenerative disorders and cancer. Apoptosis induces the activation of a conserved biochemical pathway of specific proteases called caspases. These proteases cleave a great number of protein-targets, promoting the alteration of their functional characteristics and leading to apoptotic phenotype. Structural cytoskeleton and nucleolar proteins that are involved in apoptotic process, signalling cellular transduction, DNA replication and repair of its damage as well as proteins involved in replication licensing, are among the protein-targets of caspases. Replication licensing is a process which ensures that only after a passage through mitosis chromatin becomes competent for a new round of DNA replication. A protein complex regulates this process and a major component of this complex is Cdt1 protein, which is conserved from yeast to mammals. In vertebrates, another protein, namely Geminin, is the negative regulator of Cdt1 offering an additional regulation level over Cdt1. In the replication licensing process, other proteins such as Orc1-6, Cdc6, MCM2-7 are involved. Cdc6 and MCM3 have been shown to be targets of caspases during apoptosis. The aim of the present study was the investigation of a possible targeting of Cdt1 and Geminin during apoptosis. We showed that in apoptotic cells, Geminin is cleaved producing a lower molecular weight cleavage product. The cleavage of Geminin occurs by caspase-3 in apoptotic cells treated with a variety of apoptotic triggers in vivo, and after the incubation of recombinant Geminin with recombinant caspase-3, in vitro. The cleavage site of Geminin by caspase-3 was mapped in carboxy-terminus of Geminin, suggesting possible alterations in its functions.

No description available.