Il est maintenant établi que les cellules souches mésenchymateuses (MSC), résident dans la même niche que les cellules souches hématopoïétiques (HSC), au sein de la moelle osseuse (MO). Il est connu que la pression en O2 (pO2) de la niche est inférieure à la normale, soit moins de 5% pO2 contre 12-15 % pO2 dans le sang artériel. Cette hypoxie a des conséquences sur le métabolisme, en protégeant les cellules contre le stress oxydatif et en favorisant leur caractère multipotent. Notre hypothèse est que les MSC cultivées en hypoxie devraient être plus proches de leur condition physiologique, donc plus multipotentes. Des MSC de la MO humaine ont été cultivées en pO2 de 21% et 5%. Leur morphologie, capacité de différenciation en ostéocytes et adipocytes, et transcriptome ont été comparés à différents passages. Nous avons observé un ralentissement de la prolifération à des temps précoces à pO2 5%, caractérisée par une inhibition de l'expression de gènes impliqués dans la réplication et le cycle cellulaire, puis une augmentation à des passages tardifs. Les gènes codant pour des molécules d'adhérence et de la matrice extracellulaire sont stimulés par l'hypoxie. A des temps tardifs, la capacité de différenciation des MSC est stimulée en hypoxie, les cellules présentent un aspect plus immature et une diminution de synthèse des mitochondries. Surtout, l'hypoxie stimule la synthèse de « gènes de la plasticité » suivant le logiciel « Gene Ontology », et de gènes impliqués dans le développement épithélial et neuronal. En conclusion, la culture des MSC de MO en hypoxie semble plus physiologique et pourrait être utile pour des applications en médecine régénératrice / It is now settled that mesenchymal stem cells (MSC), reside in the same microenvironment or niche than hematopoietic stem cells (HSC), within the bone marrow (BM). It is also known that the O2 tension (pO2) of the niche is below 5% as compared to 21% O2 in the air and 12-15% in the arterial blood. As developed in our recent review, this physiological hypoxia protects stem cells from oxidative stress and maintains their multipotential state. Our hypothesis is that MSC cultured in hypoxia should be closer to their physiological condition and therefore more "multipotent". MSC from human BM were cultured et 21% and at 5% pO2. Their morphology, their ability to differentiate into osteocytes and adipocytes, and their transcriptome were compared at different passages. We observed a decrease of proliferation rate in early times in hypoxia, characterized by inhibition of the expression of genes involved in cell replication and cell cycle, and an increase in later passages. Whatever the passage, the genes encoding adhesion molecules and extracellular matrix are stimulated by hypoxia. At later times, the ability of MSC differentiation is stimulated by hypoxia, the cells look to be more immature and show decreased synthesis of mitochondria. Indeed, hypoxia stimulates the synthesis of plasticity genes according to "Gene Ontology" (GO) terms, and of several genes involved in neuronal- and epithelial-cell development. In conclusion, the culture of MSC from BM in hypoxia seems to be more physiological and may be useful for regenerative medicine applications.

Τα κύτταρα της νευρικής ακρολοφίας (Neural Crest Cells - NCCs) αποτελούν έναν πολυδύναμο, μεταναστευτικό πληθυσμός βλαστικών κυττάρων τα οποία δίνουν γένεση σε μια πληθώρα κυτταρικών τύπων κατά την ανάπτυξη των σπονδυλωτών, συμπεριλαμβανομένων των νευρώνων και των νευρογλοιακών κυττάρων του περιφερικού νευρικού συστήματος (ΠΝΣ). Η δημιουργία των κυττάρων της νευρικής ακρολοφίας πραγματοποιείται στο στάδιο της γαστριδίωσης μετά την επαγωγή της νευρικής πλάκας. Οι διαδικασίες αυτές επηρεάζονται από σηματοδοτικά μονοπάτια στα οποία εμπλέκονται τόσο μεταγραφικοί παράγοντες όσο και επιγενετικοί τροποποιητές . Το Εντερικό Νευρικό Σύστημα (ΕΝΣ), προέρχεται από τα κύτταρα της νευρικής ακρολοφίας της αυχενικής και της ιερής μοίρας και ελέγχει την ομαλή λειτουργία της γαστρεντερικής οδού. Τα κύτταρα της νευρικής ακρολοφίας της αυχενικής μοίρας αποικίζουν ολόκληρο τον εντερικό σωλήνα και δίνουν γένεση στο ΕΝΣ ξεκινώντας από την 9η εμβρυική ημέρα. Η δημιουργία ενός πλήρως λειτουργικού ΕΝΣ εξαρτάται από την ικανότητα μετανάστευσης, πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης των NCCs. Στόχος της παρούσας διπλωματικής εργασίας ήταν η μελέτη της έκφρασης γονιδίων που ελέγχουν τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση τόσο των πρόδρομων κυττάρων της νευρικής ακρολοφίας όσο και των NCCs που έχουν δεσμευτεί προς εντερική μοίρα σε έμβρυα μυός απουσία της πρωτεΐνης Geminin. Η Geminin είναι μια πρωτεΐνη που έχει δειχθεί να επηρεάζει την ισορροπία μεταξύ αυτο-ανανέωσης και διαφοροποίησης, μέσω της αλληλεπίδρασης της με μεταγραφικούς παράγοντες και πρωτεΐνες αναδιαμόρφωσης της χρωματίνης. Με σκοπό να διερευνήσουμε τον in vivo ρόλο της Geminin στα κύτταρα της νευρικής ακρολοφίας, δημιουργήσαμε διαγονιδιακούς μύες από τους οποίους αδρανοποιήσαμε το γονίδιο της Geminin ειδικά στα κύτταρα της νευρικής ακρολοφίας. Τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι η απουσία της Geminin από τα κύτταρα της νευρικής ακρολοφίας, οδηγεί στη δημιουργία εμβρύων με μορφολογικές αλλοιώσεις κατά τα πρώιμα στάδια της ανάπτυξης ενώ σε μεταγενέστερα αναπτυξιακά στάδια χαρακτηρίζονται από σοβαρές κρανιοπροσωπικές δυσμορφίες. Επιπλέον, η ιστοειδική αδρανοποίηση της Geminin οδήγησε σε απορρύθμιση των επιπέδων έκφρασης γονιδίων που επηρεάζουν τόσο την επαγωγή όσο και τη μετανάστευση των NCCs (mChd7, mSnail2, mTwist2,mFoxD3) κατά την 10.5η εμβρυική ημέρα. Μελέτη του κυτταρικού κύκλου των εντερικών κυττάρων νευρικής ακρολοφίας έδειξε ότι η αποσιώπηση της Geminin διαταράσσει το προφίλ του κυτταρικού τους κύκλου καθώς τα κύτταρα αυτά «μπλοκάρουν» κατά τη μετάβαση από την G2 στη Μ φάση (E9.5). Συμπερασματικά, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η Geminin συμμετέχει ενεργά στον ρύθμιση της έκφρασης γονιδίων που παίζουν σημαντικό ρόλο στην επαγωγή και τη μετανάστευση των NCCs κατά τα πρώιμα στάδια της εμβρυικής ανάπτυξης (Ε10.5). Τέλος, η Geminin διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στον πολλαπλασιασμό των πρόδρομων κυττάρων του εντερικού νευρικού συστήματος (Ε9.5). / Neural Crest cells (NCCs) comprise a multipotent, migratory cell population that generates a diverse array of cell and tissue types during vertebrate development, including neurons and glial cells of Peripheral Nervous System (PNS). The induction of neural crest specification occurs at the end of gastrulation at the neural plate border initiate an epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) that transforms these stationary cells into migratory cells. These processes are influenced by changes in the expression of transcription factors and epigenetic regulators. The Enteric Nervous System (ENS), is a subdivision of the PNS that controls the function of the gastrointestinal (GI) tract and is derived from the Vagal and Sacral NCCs. The formation of a fully functional ENS depends on the coordinated proliferation and differentiation decisions of NCCs. Vagal NCCs emigrate from the vagal region of the neural tube (somites 1-7), in a rostal to caudal direction and enter the foregut at embryonic day E9-9.5 (in mice), generating the ENS. The formation of a fully functional ENS depends on proliferation and differentiation decisions of NCCs. The aim of our work was to study the expression of genes that control self-renewal decisions and migration ability of the NCCs in mouse embryos in the absence of Geminin. Towards this direction we studied the in vivo role of Geminin in the early stages of NCCs development and in the developing ENS. Geminin is a Protein that has been shown to affect the balance between self-renewal and differentiation through multiple interactions with transcription factors and chromatin remodeling proteins. In order to further elucidate the in vivo role of Geminin in NCCs, we generated transgenic mice lacking Geminin expression specifically in NCCs. We have shown that the deletion of Geminin in NCCs, causes severe morphological and craniofacial malformation during embryonic development. The conditional inactivation of Geminin resulted in the deregulation of various genes that affect the induction and migration of NCCs (mChd7, mSnail2, mTwist2, mFoxD3) at E10.5. Examination of the cell cycle profile of enteric NCCs showed that the deletion of Geminin disrupted the proliferation of NCCs as cells are blocked at the transition from G2 to M phase (E9.5). In conclusion, our results highlight Geminin as an important molecule during the induction and migration of NCCs at the early stages of mouse embryonic development (10.5). Finally, Geminin plays an important role for the proliferation of ENS progenitor cells (E9.5).

Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) issues de la gelée de Wharton (GW) du cordon ombilical sont immuno-privilégiées et immunosuppressives. Dans le cadre d’une utilisation en ingénierie vasculaire, la persistance de ces propriétés après différenciation endothéliale a été explorée. La différenciation a été induite par ensemencement des CSM-GW sur des films multicouches de polyélectrolytes en présence du milieu EGM-2. L’immunogénicité des cellules endothéliales-« like » (CEL) a été vérifiée en évaluant l’expression de 2 marqueurs immunologiques HLA-DR et CD86. Afin d’évaluer l’effet immunosuppresseur des CSM-GW avant et après différenciation, celles-ci ont été cultivées en premier lieu en présence de cellules mononucléées stimulées en contact cellulaire direct ou séparées, puis avec des cellules Natural Killer (NK) et lymphocytes T (LT). Les résultats ont montré que les CEL expriment les marqueurs endothéliaux, n’expriment pas HLA-DR et CD86 et qu’elles inhibent la prolifération des différentes populations immunitaires selon un mécanisme dépendant de facteurs solubles tels que IDO, les IL-6 et -1β et de la PGE2, et de contacts cellulaires. La co-culture de LT avec les CEL a induit l’apparition d’une population de LT régulateurs de manière similaire aux CSM-GW. La co-culture des cellules NK en présence de CEL a induit une diminution du récepteur activateur NKG2D et a aussi induit un transfert du CD73 à leur surface, suggérant leur capacité à produire de l’adénosine, un puissant immunosuppresseur. Les CEL maintiennent le caractère immunoprivilégié et immunosuppresseur des CSM-GW, suggérant leur possible utilisation en ingénierie vasculaire / Umbilical cord Wharton’s jelly mesenchymal stem cells (WJ-MSC) are immune-privileged and immunosuppressive. Our study sought to determine the effect of endothelial differentiation on the immunomodulatory capacities of WJ-MSC. Endothelial-like cells (ECL) differentiation was performed by seeding MSC on polyelectrolyte multilayer films as substrate and stimulating them by EGM-2 culture medium. The expression of two immunological markers HLA-DR and CD86 was followed during the differentiation time. The effect of co-culture with ELC or MSC either in contact or separated by a transwell on different immune cells (peripheral blood mononuclear cells, T Lymphocytes (LT), Natural Killer (NK) cells) was assessed by evaluating immune cells proliferation. The results showed that ELC expressed endothelial markers, expressed low level of HLA-DR and CD86 and inhibited the proliferation of the different immune cell populations, and this inhibition is thought to be mediated by soluble factors as IDO, IL-6, IL-1β and PGE2, and by direct cellular contact. We reported also the capacity of ELC to generate a population of regulatory T cells and to decrease the expression of activating receptor NKG2D by NK cells. Moreover, we demonstrated that co-cultures with ELC induce CD73 expression on NK cells, a mechanism that may induce adenosine (a potent immunosuppressor) secretion by NK cells. Thus, ELC maintain the hypo-immunogenic and immunosuppressive characters of WJ-MSC suggesting their possible use in vascular engineering

Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) de la moelle osseuse ont été intensivement étudiées pour leur capacité de régénération et leurs propriétés immunomodulatrices. Beaucoup d’études ont montré que la thérapie qui utilise les CSM améliore les fonctions de tissu ostéo-articulaire particulièrement le cartilage en vue de leur capacité de différenciation en chondrocytes. Les CSM présentent un certain nombre d'avantages pour la médecine régénérative, ces cellules peuvent être facilement isolées et multipliées en culture pour obtenir un nombre approprié pour la thérapie cellulaire. De plus, elles ont une faible immunogénicité, ce que les rende aptes à la transplantation allogénique. Depuis les années 1960, de nombreuses études ont souligné les propriétés médicinales des polysaccharides notamment les β-glucanes qui ont une place particulière du fait de leurs effets immunostimulants. L’objectif de notre travail était de mettre en évidence les capacités d’un β-glucane particulier, la laminarine, sur la prolifération et la différenciation des CSM dans la perspective d’applications dans l’arthrose. Les CSM ont été cultivés dans les milieux de croissance et de différenciation chondrocytaire. La viabilité et l'apoptose des cellules ont été explorées par le comptage, les tests MTT et la coloration à l'annexine V. En outre, l'analyse des protéines spécifiques de la prolifération a été effectuée par le western blott. De plus, l'expression des marqueurs spécifiques des CSM et des chondrocytes a été étudiée à l'aide de la RT-qPCR et de l’immunofluorescence. Nos résultats ont démontré que la stimulation des CSM à la laminarine avec la dose de 1 mg/ml soit en condition de culture de croissance basique ou en chondrogenèse a inhibé la prolifération des cellules sans induire leur apoptose. Encore, dans les conditions de culture chondrogénique, la laminarine à une dose similaire a empêché la différenciation des CSM en chondrocytes. / Mesenchymal stems cells (MSCs) are a population of multipotent cells residing in several readily available adult tissue compartments, thus allowing for their ex vivo expansion. MSCs have a reliable potential for differentiation (plasticity) into cells of the mesodermal lineage (chondrocytes, osteoblasts, adipocytes). Bone marrow-derived MSCs have been a focus of stem cell research in light of their relative ease of isolation and expansion and of their high potential for differentiation. Herein, the aim of the present PhD is to explore the potential of a β-glucan (laminarin) on Mesenchymal stem cell proliferation and differentiation for future benefit for osteoarthritis treatment. MSCs were cultured in MSC growth and chondrogenic differentiation mediums. Cells viability and apoptosis were explored by cell count, MTT assays and Annexin V staining. In addition, Analysis of the specific protein of cell proliferation was performed by western blott. Furthermore, mRNA and protein expression of specifics markers for MSCs and chondrocytes were studied using qPCR and immunofluorescence. Our results demonstrated that stimulation of MSC with laminarin at a dose of 1 mg/ml in either basic growth culture or chondrogenesis inhibited cell proliferation without inducing their apoptosis. Furthermore, under chondrogenic culture conditions, laminarin at a similar dose prevented the differentiation of MSC into chondrocytes.

Les lésions cartilagineuses survenant majoritairement dans un contexte de traumatisme, ne se réparent pas spontanément. Les traitements chirurgicaux et les techniques d'ingénierie cellulaire, utilisés en clinique, donnent des résultats perfectibles. L'ingénierie tissulaire du cartilage fait l'objet de nombreux travaux dans le but de produire au sein de la lésion un tissu de réparation dont les caractéristiques structurales et fonctionnelles sont similaires à celles du cartilage natif. Le diagnostic précoce de ces lésions et l'évaluation du tissu de réparation sont également des enjeux majeurs en orthopédie. L'IRM est une technique d'imagerie non invasive et à haute résolution permettant une évaluation du cartilage tant d'un point de vue architectural que biochimique en utilisant des séquences dédiées. En raison de leurs potentialités chondrogéniques, les cellules souches, provenant de différents tissus, sont une piste encourageante pour induire la régénération du cartilage lésé par des traumatismes articulaires. Des cellules provenant de différents tissus (moelle osseuse, membrane synoviale) ainsi que des chondrocytes dédifférenciés ont été ensemencés dans une structure tridimensionnelle poreuse à base de collagène I (éponge de collagène I) et soumis à un environnement chondrogénique afin de produire un implant fonctionnalisé. L'évaluation de la qualité de la synthèse matricielle in vitro dans l'implant a démontré le potentiel chondrogénique des différents contingents. La faisabilité d'un marquage de cellules souches mésenchymateuses (CSM) par des particules d'oxyde de fer superparamagnétiques (SPIO), diminuant le signal en IRM a été démontrée in vitro à 3 Teslas (3T) et 7 Teslas (7T). Des concentrations inférieures à 25 µg Fe/mL peuvent être utilisées sans endommager massivement la synthèse d'une matrice cartilagineuse par des CSM osté-médullaires. L'implantation des biomatériaux fonctionnalisés en site ectopique chez la souris nude a conduit à une dérive phénotypique ostéoïde de l'implant. En revanche, en site articulaire, chez le rat nude, les implants induisent la production d'un tissu de réparation comblant l'intégralité de la lésion et présentant des caractéristiques proche du cartilage sain environnant / Cartilaginous lesions mainly occur from a traumatic background and do not heal spontaneously. The chirurgical treatment and the cellular engineering techniques, usually used in clinic, produce perfectible results. Cartilage tissue engineering is the subject of many works in order to produce a repair tissue into the lesion. This repair tissue aims to have the same structural an functional characteristics as the native cartilage. In orthopaedic field, the early diagnostic of chondral lesions and the evaluation of the repair tissue are major issues. MRI is a high resolution and non invasive imaging technique that could be used to evaluate the architectural and biochemical structures of the cartilage by using dedicated sequences. Because of their chondrogenic capacities, stem cells provide a promising avenue to regenerate damaged cartilage in articular traumas. The stem cells from various origins (bone marrow, synovium) and the dedifferentiated chondrocytes were seeded into a porous 3D scaffold in collagen I (collagen I sponge). These cells were cultivated in chondrogenic conditions to produce a functionalized implant. The quality of the matrix synthesis was evaluated in vitro and demonstrated the chondrogenic potential of these various cell types. Superparamagnetic iron oxid particle (SPIO) labelling of the mesenchymal stem cells (MSC) is feasible in vitro at 3 Teslas (3T) and 7 Teslas (7T). A SPIO concentration lower than 25 ?g Fe/mL could be used without reducing the cartilaginous matrix synthesis by bone marrow MSC. The functionalized biomaterial implantation in an ectopic site in a nude mouse model showed an osseous split. However, in articular site in a nude rat model, the implants produced a repair tissue filling the totality of the lesion. This tissue seems to have similar characteristics of the surrounding healthy cartilage

L'utilisation grandissante des cellules souches mésenchymateuses (CSM) en ingénierie tissulaire augmente la nécessité d'améliorer leur expansion. Ces travaux ont concerné l'étude d'un procédé performant d'expansion de CSM porcines en mode agité. Tout d'abord, un milieu de culture a été adapté aux CSM porcines multipotentes. Puis, différents modes d'expansion en conditions agitées ont été évalués avec les cellules fixées sur des microporteurs. La culture sur le microporteur Cytodex 1 a permis d'atteindre une vitesse spécifique de croissance de 0,54 j-1, supérieure à celle observée en flacon statique (0,31 j-1), avec les mêmes conditions de culture. En parallèle, une méthode de comptage innovante a été proposée pour le dénombrement automatique des cellules cultivées sur Cytodex 1, sans passer par une étape de trypsination. Enfin, les conditions opératoires du procédé d'expansion ont été étudiées. En comparaison d'une culture de CSM sur Cytodex 1 sans agitation, une agrégation des cellules et une baisse apparente de la concentration cellulaire ont été observées à 25 et 75 rpm. Par ailleurs, l'ajout de microporteurs au cours d'une culture de 300 h, réalisée dans un système de culture agité à 25 rpm et dans un volume de 200 mL, a permis de prolonger la prolifération cellulaire en évitant l'agrégation tout en maintenant la multipotence des CSM. Une concentration cellulaire de 3 x 105 cellules/mL a été obtenue, au lieu de 1,2 x 105 cellules/mL en flacons statiques avec les mêmes conditions de culture. Un procédé performant d'expansion de CSM porcines en conditions agitées a ainsi pu être proposé / The extensive use of mesenchymal stem cells (MSC) in tissue engineering increases the necessity to improve the expansion performance. This work aimed at studying an efficient expansion process for porcine MSC in agitated mode. First, a culture medium was adapted to the multipotent porcine MSC. Then, various expansion modes and agitation conditions were evaluated with the cells fixed on microcarriers. Cultures on the Cytodex 1 microcarrier enabled to reach a specific growth rate of 0.54 d-1, which was higher than the one observed in static T-flasks (0.31 d-1), with the same culture conditions. In parallel, an innovative counting method was proposed for the automatic enumeration of cells cultivated on Cytodex 1, without passing by a trypsination step. Finally, the operating conditions of the expansion process were studied. Compared to a culture of MSC on non-agitated Cytodex 1 microcarriers, cell aggregation occurred and an apparent decrease in the cell concentration was observed at an agitation rate of 25 and 75 rpm. Moreover, the addition of microcarriers during a 300 h culture, performed in an agitated culture at 25 rpm and in a volume of 200 mL enabled to prolong the cell proliferation without any aggregation, while maintaining the multipotency of the cells. A cell concentration of 3 x 105 cells/mL was obtained, instead of the 1.2 x 105 cells/mL in static flasks with the same culture conditions. An efficient expansion process for porcine MSC under agitated conditions has therefore been proposed

Les cellules souches suscitent de grands espoirs pour la thérapie cellulaire et l'ingénierie tissulaire. Les CSM du tissus foetaux (sang placentaire et gelée de Wharton du cordon ombilical), à l'origine d'épiblaste embryonnaire, sont considérées comme plus primitives que les CSM provenant de sources adultes. Les conditions de culture ayant un impact sur le comportement des cellules, dans notre étude, nous avons exploré l'effet de la concentration de l'oxygène sur l'expansion, l'immunophénotypage et la différenciation de ces cellules. L'objectif de ce travail est d'identifier la méthode optimale d'isolation des CSM issues de tissus foetaux. Compte tenu du faible taux de succès dans l'isolement des CSM extraites du sang placentaire, nous nous sommes dirigés vers les CSM-GW. Nous y avons déterminé in situ, les marqueurs spécifiques exprimés dans la gelée de Wharton et à la périphérie. Des études sur la morphologie, la cinétique de croissance, et sur l'expression phénotypique des marqueurs de surface, des CSM-GW, ont été effectuées sur une longue durée (7 passages) à différentes conditions de culture. Nous avons montré que la GW est composée d'une abondante matrice extracellulaire riche en collagènes et glycosaminoglycannes et que les cellules possèdent un phénotype variable selon leur localisation dans la gelée. Ce tissu est capable de fournir une quantité importante de CSM (6,7x105 Cs/cm de cordon) qui gardent une morphologie constante. Enfin, quel que soit le passage, la concentration de l'oxygène ne semble pas avoir d'effet sur le phénotype des cellules. En revanche, une faible teneur en oxygène durant l'expansion semble diminuer le temps de doublement des cellules, favoriser la chondrogénèse et inhiber la différenciation ostéogénique. Enfin, quelles que soient les conditions de culture, la différenciation adipogénique des CSM-GW semble difficile à obtenir / Stem cells are the hopes for cell therapy and tissue engineering. MSCs from fetal tissue (umbilical cord blood and WJ), which are a source of embryonic epiblast grow relatively faster comparing to other adult sources. The culture condition can affect cell behavior. In our study, we explored the effect of oxygen concentration on the expansion, immunophenotyping, and differentiation of these cells. The aim of this work is to identify the optimal method for isolation of MSCs derived from fetal tissue. Given the low rate of success in the isolation of MSCs from cord blood, we headed to WJ-MSCs. We have determined in siu, the specific markers expressed in the WJ and in the perivascular region. Studies on the morphology growth kinetics, and phenotypic expression of surface makers of MSCs isolated from WJ were made over a long period (7 passages) in different culture conditions. We have shown that WJ is composed of an abundant extracellular matrix rich in collagen and glycasominoglycans and have variable phenotype depending from their localization in the jelly. This tissue is able to provide a large amount of MSCs (6.7x105 Cs/cm of cord) that maintain a constant morphology. Finally, regardless of the passage, the oxygen concentration does not effect on the phenotype of the cells. In contrast, a low oxygen concentration during expansion appears to decrease the doubling time of MSCs, promote chondrogenesis and inhibit osteogenic differentiation. Finally, whatever the culture conditions, adipogenic differentiation of WJ-MSC seems difficult to obtain

Les propriétés centrales des cellules souches sont la pluripotence et la capacité d'auto-renouvellement. Les cellules souches hématopoïétiques (CSHs) sont dotées de ces caractéristiques qui leur permettent de générer toutes les cellules du compartiment hématopoïétique, tout en maintenant en parallèle leur compartiment. Nous menons des approches visant à amplifier ex vivo les CSHs en les activant par HOXB4 exogène (CSHs humaines) ou via la signalisation Notch/DLL-4 (CSHs murines). Or deux analyses transcriptomiques indépendantes de ces deux modes d'activation ont de manière étonnante convergé sur une augmentation de l'expression de deux gènes jamais identifiés auparavant comme étant impliqués dans le maintien des CSHs : Pumilio1 (Pum1) et Pumilio2 (Pum2). Pum1 et Pum2 sont des régulateurs post-transcriptionnels appartenant à la famille Pumilio-FBF (PUF) des protéines liant l'ARN. Bien qu'il ait été établi que le rôle princeps de ces protéines PUF est de soutenir la prolifération des cellules souches chez les Invertébrés, jusqu'à présent on ne sait rien du rôle de Pum1 et Pum2 dans les CSH humaines et murines.Pour toutes ces raisons, nous avons étudié le rôle et les mécanismes d'action de Pum1 et Pum2 dans les CSH murines et humaines en utilisant l'interférence ARN (ARNi). L'invalidation de Pum1 ou de Pum2 dans les CSHs murines conduit à une réduction de l'expansion et du potentiel clonogénique ex vivo, associée à une apoptose accrue et l'arrêt du cycle cellulaire en phase G0/G1. L'invalidation concomitante de Pum1 et Pum2 majore ces effets ce qui suggère un effet coopératif entre les deux protéines. L'expansion et le potentiel clonogénique des CSH invalidées pour Pum1 sont restaurés suite à l'expression forcée de Pum1 (insensible au shRNA utilisé), validant ainsi la spécificité de nos shRNAs. Par contre la surexpression de Pum1 dans les CSHs invalidées pour Pum2 ne restaure pas leurs fonctions, soulignant le rôle non redondant de chaque protéine. En outre, lorsque les CSHs invalidées pour Pum1 ou Pum2 sont inoculées à des souris irradiées létalement de suivre le potentiel hématopoïétique à long terme, seules quelques rares cellules de la moelle osseuse issues des CSH KD pour Pum1 ou Pum2 sont mises en évidence après 4 mois de reconstitution, contrairement aux CSH contrôles. Des résultats identiques ont été obtenus en invalidant Pum1 ou Pum2 dans les CSH humaines.En conclusion, nos résultats démontrent l'implication des facteurs Pumilio dans le maintien du potentiel souche, l'expansion et la survie des CSHs murines et humaines. L'identification des facteurs Pumilio et de leurs cibles comme nouveaux régulateurs des CSHs permettra d'envisager de nouveaux outils en vue de perspectives thérapeutiques. / The central properties of stem cells are the pluripotency and the capacity of self-renewal. Hematopoietic stem cells (HSCs) posses such common features that allows them to generate all the cells of the hematopoietic compartments, maintaining in the same time the HSC pool. We develop approaches focused on ex vivo HSC expansion through activation by exogenous HOXB4 (human HSCs) or Notch/Dll-4 ligand (murine HSCs). Two independent transcriptomic analyses surprisingly converged toward an increased expression of two genes never identified sofar as crucial for HSC functions: Pumilio1 (Pum1) and Pumilio2 (Pum2). Pum1 and Pum2 are posttranscriptional regulators belonging to the Pumilio-FBF (PUF) family of RNA-binding proteins. Although it was established that the primordial role of PUF proteins is to sustain mitotic proliferation of stem cells in Invertebrates, so far nothing is known about the role of Pum1 and Pum2 in human and murine HSCs.For these reasons, we have investigated the roles and mechanisms of action of Pum1 and Pum2 in murine and human HSCs through shRNA strategy. Pum1 and Pum2 knockdown (KD) in murine HSCs led to a decreased HSC expansion and clonogenic potential ex vivo, associated with an increased apoptosis and a cell cycle arrest in G0/G1 phase. KD of both Pum1 and Pum2 enhanced these effects, suggesting a cooperative effect. Expansion and clonogenic potential of KD Pum1 HSCs were rescued by enforced expression of Pum1 (insensitive to our shRNA), thus validating the specificity of our shRNA. Enforced expression of Pum1 could not rescue the functions of Pum2 KD HSCs, highlighting the non-redundant role of these proteins. Furthermore, when Pum1 or Pum2 KD HSCs were inoculated into lethally irradiated mice to follow the long-term hematopoietic potential, only rare bone marrow cells derived from Pum1 and Pum2 KD HSCs were evidenced after 4 months, contrary to control HSCs. Identical results were obtained with human Pum1 or Pum2 KD HSCs.In conclusion, our results demonstrate the involvement of Pumilio factors in stemness maintenance, expansion and survival of murine and human HSCs. Identification of Pumilio factors and their targets as new regulators of HSCs expansion will allow consider them as new tools for therapeutic perspectives.

Ce travail a pour objet de déterminer les conditions optimales de production de substituts allogéniques capables de combler les lésions cartilagineuses dans le cadre du traitement de l’arthrose. Il s’oriente particulièrement sur la composante cellulaire de ces substituts. L’usage de cellules souches mésenchymateuses issues de cordons ombilicaux (CSM-GW) implique de déterminer quels facteurs obstétricaux, liés à l’environnement direct et indirect des CSM-GW, peuvent influencer leur prolifération ainsi que leur différenciation chondrocytaire. Dans une première partie de ce travail, trois types de facteurs ont été étudiés : les facteurs liés à l’enfant donneur, au déroulement de l’accouchement et de la délivrance, à la grossesse et à la mère. Nos données montrent que les CSM-GW ont des capacités prolifératives améliorées lorsque l’accouchement s’est déroulé à terme et sans complication, avec utilisation de Syntocinon® pendant le travail. Sur la base de ces résultats, nous avons utilisé les CSM-GW les plus efficaces dans le cadre de l’ingénierie du cartilage. Il a ensuite été essentiel d’élucider le profil d’action des CSM-GW dans un contexte allogénique. Le deuxième temps de ce travail a donc consisté à chercher le profil de stimulation le plus performant, au regard de la viabilité des cellules et de l’évolution de la sécrétion des facteurs solubles responsables des propriétés immunomodulatrices des CSM-GW au cours de la différenciation chondrocytaire. Nous avons alors mimé, in vitro et en biomatériaux d’Alginate/Acide hyaluronique (Alg/HA) une telle situation en stimulant les CSM-GW avec différentes doses d’IFN-γ et de TNF-α. Selon nos résultats, la stimulation par IFN-γ et TNF-α sur les CSM-GW en biomatériaux d’Alg/HA est plus efficace lorsque ces deux cytokines sont utilisées conjointement et n’est pas délétère pour la viabilité cellulaire aux concentrations respectives de 20 et 30 ng/mL. Cette double stimulation induit une augmentation de la sécrétion d’IL-6 et de PGE-2 par les CSM-GW, ne modifie pas leur sécrétion de TGF-β, et diminue la sécrétion de VEGF. Nous avons confirmé ces données lors d’une mise en situation fonctionnelle : des cocultures avec des cellules mononucléées de sang périphérique (PBMC) de donneurs sains nous ont permis d’évaluer la réponse des CSM-GW lors d’une situation allogénique. Ces mises en situations allogéniques ont été étudiées à différents temps afin d’évaluer les propriétés immunologiques des CSM-GW au cours du temps passé en biomatériaux. Nos résultats montrent que les CSM-GW peuvent exprimer des molécules HLA-G ainsi qu’IDO, mais ces expressions sont limitées en biomatériaux d’Alg//HA. Les CSM-GW en biomatériaux d’Alg/HA en situation allogénique ne sont pas immunogènes, quel que soit le temps de différenciation. En revanche, leurs capacités immunomodulatrices décroissent au cours du temps et sont plus fortes à J0 et J3 de la différenciation chondrocytaire, ce qui oriente vers une utilisation précoce de ces cellules. Les conclusions de ce travail permettent de (i) sélectionner les cordons idoines à l’ingénierie cellulaire et l’ingénierie du cartilage, (ii) définir les conditions permettant de mimer une situation allogénique in vitro, (iii) connaitre les propriétés immunomodulatrices des CSM-GW au cours de la culture en biomatériaux d’Alg/HA, y compris en situation allogénique / The purpose of this work is to determine the optimal conditions for allogeneic substitutes production, adapted to filling the cartilaginous lesions in osteoarthritis treatment. It focuses on the cellular component of these substitutes. The use of mesenchymal stem cells from umbilical cords (WJ-MSC) involves determining which factors, related to direct and indirect environment of the WJ-MSC, can influence their proliferation and chondrogenic differentiation. In a first part of our work, three types of factors were studied: related to the donor child, the course of labor and delivery, pregnancy and the mother. Our results show that WJ-MSC have enhanced proliferative capacities when coming from full-term birth and without complications, with the use of Syntocinon® during labor. On this basis, we used the most effective WJ-MSC for cartilage engineering. It was then essential to elucidate their action profile in allogeneic context. We stimulated WJ-MSC embedded in Alginate/Hyaluronic Acid (Alg/HA) scaffolds with different concentrations of IFN-γ and TNF-α in order to determine the most effective stimulation profile, with regard to viability of the cells and evolution of immunomodulatory soluble factors secretion. According to our results, the stimulation by IFN-γ and TNF-α on WJ-MSC in Alg/HA scaffolds is more effective when these two cytokines are used together and is not deleterious for cell viability at the concentrations of 20 and 30 ng/mL, respectively. This double stimulation induces an increase in the secretion of IL-6 and PGE-2 by the WJ-MSC, a decrease in the secretion of VEGF and does not modify the secretion of TGF-β. We confirmed these data during a functional study: cocultures with peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from healthy donors allowed us to evaluate the response of WJ-MSC in an allogeneic situation. These allogeneic situations have been studied at different times to evaluate the immunological properties of WJ-MSC during the time of chondrogenic differentiation. Our results show that WJ-MSC can express HLA-G molecules as well as IDO, but these expressions are limited in Alg/HA biomaterials. Finally, the WJ-MSC in Alg/HA biomaterials in allogeneic conditions are not immunogenic, regardless of the time of differentiation. On the other hand, their immunomodulatory capacities decrease over time and are stronger at day 0 and day 3 of chondrogenic differentiation, which leads to an early use of these cells. Finally, this work allows us to (i) select the umbilical cords suitable for cellular and cartilage engineering, (ii) define the conditions mimicking in vitro an allogeneic situation, (iii) elucidate the immunomodulatory properties of WJ-MSC during Alg/HA biomaterials chondrogenic differentiation, including allogeneic situations

La thérapie cellulaire et les médicaments de thérapie innovante sont des solutions prometteuses pour la régénération des tissus ou organes présentant des défauts fonctionnels ou organiques. Avant le stade de l'insuffisance cardiaque terminale (stade IV NYHA) suite à un infarctus du myocarde, l'implantation d'un patch de fibrine cellularisé avec des progéniteurs myocardiques sur le site de nécrose de l'infarctus, est l'une des perspectives qui permettrait de régénérer un muscle cardiaque fonctionnel et apparait comme étant une alternative nouvelle avec notamment un essai clinique de phase I en cours (ESCORT : NCT02057900). Cependant, cette thérapie innovante présente de réelles contraintes, parmi lesquelles, un protocole nécessitant, i) une utilisation pour la production de cellules progénitrices myocardiques CD15+, de DMSO, de sérum foetal bovin, de trypsine porcine, de fibroblastes murins pouvant être la source d'une contamination chimique ou microbiologique, ii) une caractérisation importante des cellules produites, pour déterminer leur viabilité, leur pureté, leur état de différenciation, iii) d'implanter le patch de fibrine cellularisé dans un délai limité avant l'obtention des résultats de stérilité et d'endotoxines, iv) d'inciser le péricarde et de former une poche, geste chirurgical très invasif, afin d'implanter le patch cellularisé. Avec l'objectif de limiter ces contraintes et de renforcer la sécurisation pharmaceutique de ce médicament de thérapie innovante, les différents axes de ce travail ont porté sur i) l'ajout, juste avant l'implantation, d'une étape de cryoconservation des cellules dans un milieu sans sérum et sans DMSO, mais avec des agents cryoprotectants de qualité pharmaceutique. L'avantage apporté par la cryoconservation étant de rendre possible une production par lot, et la réalisation des contrôles sans contrainte de temps avant l'implantation, ii) la vectorisation des cellules par une encapsulation dans des microsphères formant une suspension injectable et permettant une implantation directement au travers du péricarde et immédiatement après la décongélation, iii) l'utilisation de polymères bioadhésifs afin de maintenir les microsphères au site d'implantation. Dans un premier temps, ce travail a permis d'identifier l'alginate de sodium de faible viscosité à 1,2% comme polymère pour réaliser l'encapsulation à l'aide d'une buse vibrante de 120 µm de diamètre. La nature et la concentration d'agents cryoprotectants ont également été définies. Les agents cryoprotectants ont été sélectionnés parmi les oses (glucose, saccharose, tréhalose), les polyols (glycérol, mannitol, sorbitol) et l'urée, à une concentration permettant d'atteindre une osmolarité totale de 500 mOsm/L pour abaisser le point de congélation de l'eau. Enfin le chitosane de faible viscosité à 0,5% a été utilisé comme polymère bioadhésif de surface pour maintenir les propriétés mécaniques et la forme des microsphères après la congélation. Dans un second temps, une évaluation biologique a permis de mesurer l'impact des étapes du procédé d'encapsulation et de cryoconservation, sur des cellules souches mésenchymateuses humaines utilisées comme modèle. Il a ainsi été possible d'optimiser le protocole ce qui a eu pour effet d'augmenter la viabilité, évaluée après encapsulation et congélation par une analyse en cytométrie de flux avec le 7AAD, de moins de 5% à environ 35%. / Cell therapy and advanced therapy medicinal products are promising solutions for the regeneration of tissues or organs with functional or organic defects. Before the terminal heart failure stage (stage IV NYHA) following a myocardial infarction, the implantation of a cellularized fibrin patch with myocardial progenitors at the location of the infarct necrosis, is one of the perspectives that would allow a functional heart muscle to regenerate and appears to be a new alternative, in particular, with an ongoing Phase I clinical trial (ESCORT : NCT02057900). However, this innovative therapy presents real constraints, among which, a protocol requiring, i) the use for the production of CD15+ myocardial progenitor cells of, DMSO, bovine fetal serum, porcine trypsin, and murine fibroblasts which may be the source of chemical or microbiological contamination, ii) an important characterization of the produced cells, to determine their viability, purity, and state of differentiation, iii) to implant the cellularized fibrin patch within a limited time frame before getting the results of sterility and endotoxins, iv) to incise the pericardium and to form a pouch, a very invasive surgical gesture, in order to implant the cellularized patch inside. With the objective of limiting these constraints and strengthening the pharmaceutical safety of this innovative therapy medication, different axes of this work have focused on i) the addition, just before the implantation, of a step of cryopreservation of the cells in a medium without serum and without DMSO, but with pharmaceutical-grade cryoprotectants. The advantages of cryopreservation is to allow production in batches, and controls to be carried out without time constraints before the implantation, ii) the vectorization of the cells by encapsulation in microspheres forming an injectable suspension and allowing direct implantation through the pericardium immediately after thawing, iii) the use of bioadhesive polymers to maintain the microspheres at the location of the implantation. This study initially enabled to identify a low-viscosity sodium alginate at 1.2% as a polymer being used for the encapsulation with the use of a vibrating nozzle which diameter is of 120 µm. The nature and the concentration of the cryoprotectants have also been defined. The cryoprotectants were selected from oses (glucose, sucrose, trehalose), polyols (glycerol, mannitol, sorbitol) and urea, at a concentration which achieves a total osmolarity of 500 mOsm/L in order to lower the freezing point of water. Finally, low viscosity chitosan at 0.5% was used as a bioadhesive polymer at the surface of the microspheres to maintain their shapes and mechanical properties after freezing. In a second step, a biological evaluation allowed to measure the impact of the encapsulation and the cryopreservation processes, on human mesenchymal stem cells used as a model. It was thus possible to optimize the protocol, which in return increased the viability ; evaluation made after encapsulation and freezing by a flow cytometry analysis with 7AAD ; from less than 5% to about 35%.