Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) issues de la gelée de Wharton (GW) du cordon ombilical sont immuno-privilégiées et immunosuppressives. Dans le cadre d’une utilisation en ingénierie vasculaire, la persistance de ces propriétés après différenciation endothéliale a été explorée. La différenciation a été induite par ensemencement des CSM-GW sur des films multicouches de polyélectrolytes en présence du milieu EGM-2. L’immunogénicité des cellules endothéliales-« like » (CEL) a été vérifiée en évaluant l’expression de 2 marqueurs immunologiques HLA-DR et CD86. Afin d’évaluer l’effet immunosuppresseur des CSM-GW avant et après différenciation, celles-ci ont été cultivées en premier lieu en présence de cellules mononucléées stimulées en contact cellulaire direct ou séparées, puis avec des cellules Natural Killer (NK) et lymphocytes T (LT). Les résultats ont montré que les CEL expriment les marqueurs endothéliaux, n’expriment pas HLA-DR et CD86 et qu’elles inhibent la prolifération des différentes populations immunitaires selon un mécanisme dépendant de facteurs solubles tels que IDO, les IL-6 et -1β et de la PGE2, et de contacts cellulaires. La co-culture de LT avec les CEL a induit l’apparition d’une population de LT régulateurs de manière similaire aux CSM-GW. La co-culture des cellules NK en présence de CEL a induit une diminution du récepteur activateur NKG2D et a aussi induit un transfert du CD73 à leur surface, suggérant leur capacité à produire de l’adénosine, un puissant immunosuppresseur. Les CEL maintiennent le caractère immunoprivilégié et immunosuppresseur des CSM-GW, suggérant leur possible utilisation en ingénierie vasculaire / Umbilical cord Wharton’s jelly mesenchymal stem cells (WJ-MSC) are immune-privileged and immunosuppressive. Our study sought to determine the effect of endothelial differentiation on the immunomodulatory capacities of WJ-MSC. Endothelial-like cells (ECL) differentiation was performed by seeding MSC on polyelectrolyte multilayer films as substrate and stimulating them by EGM-2 culture medium. The expression of two immunological markers HLA-DR and CD86 was followed during the differentiation time. The effect of co-culture with ELC or MSC either in contact or separated by a transwell on different immune cells (peripheral blood mononuclear cells, T Lymphocytes (LT), Natural Killer (NK) cells) was assessed by evaluating immune cells proliferation. The results showed that ELC expressed endothelial markers, expressed low level of HLA-DR and CD86 and inhibited the proliferation of the different immune cell populations, and this inhibition is thought to be mediated by soluble factors as IDO, IL-6, IL-1β and PGE2, and by direct cellular contact. We reported also the capacity of ELC to generate a population of regulatory T cells and to decrease the expression of activating receptor NKG2D by NK cells. Moreover, we demonstrated that co-cultures with ELC induce CD73 expression on NK cells, a mechanism that may induce adenosine (a potent immunosuppressor) secretion by NK cells. Thus, ELC maintain the hypo-immunogenic and immunosuppressive characters of WJ-MSC suggesting their possible use in vascular engineering

Depuis près de 20 ans, l’ingénierie vasculaire est en plein essor, tentant d’apporter des solutions durables dans le traitement de pathologies cardio-vasculaires dont l’incidence est croissante. Utilisés pour le remplacement ou le pontage de vaisseaux obstrués voire lésés, les substituts vasculaires de petit calibre présentent encore des limites importantes, induisant, à plus ou moins court terme, le développement d’hyperplasie intimale ou de thrombose. Les multiples exemples de substituts vasculaires issus de l’ingénierie tissulaire décrits dans la littérature témoignent des difficultés rencontrées pour obtenir une prothèse qui réunirait à la fois des propriétés mécaniques adaptées au site d’implantation et des propriétés biologiques optimales pour assurer la fonction vasculaire. C’est dans cette problématique que se situe cette étude dont l’objectif est de définir la composante matricielle et la composante cellulaire idéales pour un substitut vasculaire de petit calibre. Pour cela, nous nous sommes intéressés aux hydrogels physiques de chitosane, dont les propriétés d’hémocompatibilité et de biorésorption sont reconnues. La composition physico- chimique adéquate d’un point de vue biologique et mécanique a été déterminée afin d’élaborer des tubes qui ont été par la suite endothélialisés. Par ailleurs, le mécanisme d’alignement cellulaire en réponse à un flux laminaire de type artériel, a été particulièrement étudié car il constitue un phénomène d’adaptation des CEs aux contraintes mécaniques perçues in vivo par l’endothélium. Cette caractérisation a permis de mettre en évidence le rôle essentiel d’IQGAP1 dans ce processus et d’initier une seconde étude visant la compréhension du mécanisme d’adhésion des CEs sur le chitosane. Finalement, en alliant recherche fondamentale et recherche appliquée nous avons élaboré un substitut vasculaire cellularisable in vitro et implantable in vivo. / Abstract

Objectifs. Les substituts vasculaires synthétiques sont à l’origine de nombreux échecs pour le remplacement des vaisseaux de petit calibre. L'émergence de l'ingénierie vasculaire ouvre des perspectives face à ce problème de santé publique. Le chitosane, polymère naturel, peut être utilisé comme matrice en ingénierie vasculaire. L'objectif de cette thèse était de produire des hydrogels de chitosane et d’étudier les propriétés mécaniques, biologiques et la biointégration. Matériel et Méthodes. Les hydrogels ont été caractérisés mécaniquement in vitro. En augmentant la concentration en chitosane, la résistance à la suture, à l’éclatement et les modules élastiques augmentaient de manière significative. Une série d'expériences, allant de l’évaluation in vitro à l’analyse in vivo de la biocompatibilité a été réalisée. In vitro, les hydrogels permettaient la prolifération des progéniteurs endothéliaux (EPCs) et étaient hémocompatibles. In vivo, les hydrogels n’étaient pas résorbés après 60 jours, dans un modèle d'implantation hétérotopique chez le rat. De plus, la biointégration du chitosane a été étudiée. In vitro, l’endothélium à la surface des hydrogels se comportait comme celui d’un vaisseau natif. In vivo, les hydrogels de chitosane étaient capables de moduler la réponse inflammatoire, dans un modèle d'implantation ectopique chez le rat, en favorisant la polarisation des macrophages vers le phénotype M2. Enfin, 2 tubes de chitosane ont été implantés avec succès pour des pontages carotidiens pendant 3 jours chez le mouton. Conclusion. En modulant la concentration de chitosane, nous avons produit des matrices avec des propriétés adaptées pour l’ingénierie vasculaire. / Aims. Vascular grafts made of synthetic polymers perform poorly in small-diameter applications. Consequently, there is strong clinical to produce small caliber vessels with better patency. The emergence of vascular engineering opens new possibilities. Chitosan, a natural polymer, can provide a scaffold for vascular engineering. The goal of this thesis was to produce chitosan-based hydrogels and to assess their biological and mechanical properties and their biointegration. Methods and Results. Hydrogels were mechanically characterized in vitro. By increasing chitosan concentration, suture retention value, average burst strength and elastic moduli increased significantly. A series of experiments ranging from in vitro biocompatibility tests to in vivo studies was performed. In vitro, chitosan supported human endothelial progenitor cells (EPCs) proliferation and was hemocompatible. In vivo, no resorption of chitosan was observed in a rat heterotopic implantation model. In addition biointegration of chitosan hydrogels were investigated. In vitro, chitosan endothelialized with EPCs behave as a native endothelium. In vivo, chitosan hydrogels were able of modulating the inflammatory response of injured host tissue by favouring polarization of macrophages towards the beneficial M2 phenotype in a rat ectopic implantation model. Finally, as a proof of concept, 2 chitosan tubes were implanted successfully as carotid interposition grafts for 3 days in sheep. Conclusion. By modulating chitosan concentration, we produced scaffolds with suitable properties to be implanted in vivo.

L’incidence des maladies cardiovasculaires d’origine athéromateuse demeure un problème majeur en santé publique et malgré le développement de techniques curatives endovasculaires, la chirurgie demeure nécessaire chez de nombreux patients. Le remplacement vasculaire se fait par une veine autologue qui reste le « gold standard » ou, lorsque les patients n’ont pas le capital vasculaire suffisant, par une prothèse. Actuellement, si les techniques utilisant des prothèses synthétiques sont satisfaisantes pour le remplacement d’artères de gros calibre, celui des artères de petit calibre demeure toujours un défi du fait du caractère thrombogène des biomatériaux utilisés et de leurs mauvaises propriétés mécaniques. Depuis quelques années, le concept d’ingénierie tissulaire a émergé et évolué. Il pourrait permettre de proposer de nouveaux types de substituts vasculaires hybrides et/ou biologiques, grâce en particulier à l’utilisation de cellules souches et de leurs progéniteurs, ouvrant d’intéressantes perspectives dans le domaine de l’ingénierie vasculaire. Le but de ce travail a été d’obtenir de manière fiable et reproductible des cellules à phénotype endothélial mature à partir de progéniteurs endothéliaux issus de moelle osseuse et sang périphérique humains et de définir leurs réponses dans des conditions proches de celles observées dans un vaisseau natif. Des cellules (PDECs : Progenitor Derived Endothelial Cells) ont pu être amplifiées à partir de progéniteurs, elles présentent les marqueurs membranaires classiquement utilisés pour définir des cellules endothéliales matures. Elles sont capables, sur différents revêtements utilisés cliniquement tels le collagène de type I et la colle de fibrine ainsi que sur un revêtement plus expérimental (Multicouches de PolyElectrolytes), de former une monocouche confluente. Ces PDECs résistent à des contraintes mécaniques de cisaillement de type artériel et l’analyse de gènes et protéines impliqués dans la biologie de l’endothélium a montré qu’elles répondent à ces stimulations par l’expression d’un phénotype en lien avec une activité antithrombogène. De plus, les travaux préliminaires réalisés sur ces PDECs cocultivés avec des progéniteurs ostéoblastiques, ouvrent d’intéressantes perspectives concernant leur utilisation dans le cadre de l’ingénierie du tissu osseux vascularisé. / The incidence of atherosclerotic arterial disease is still a major public health problem and despite endovascular surgery therapies, surgical treatment is necessary for many patients. Vascular bypass is performed with an autologous vein which remains the gold standard, or when patients do not have appropriate blood vessels to be used as replacement, with a synthetic prosthesis. Nowadays, synthetic vascular grafts have been successfully used in the treatment of the pathology of large arteries, but the replacement of the smaller sized arteries is still a challenge because synthetic vascular grafts are known to be highly thrombogenic and have poor mechanical properties. Recently, the tissue engineering concept has emerged and advances. It can allow to propose development of new hybrid or biologic vascular substitutes, using stem cells and progenitor cells, holding great promise for vascular tissue engineering. The aim of the present study was to obtain reliably and reproducibly, cells with mature endothelial phenotype from endothelial progenitor cells isolated from human bone marrow and peripheral blood and investigate cell response in conditions similar to those observed in a native vessel. We were able to expand cells (PDECs: Progenitor Derived Endothelial Cells) from progenitors which exhibit markers conventionally used to define mature endothelial cells. They were able, on scaffolds currently used in clinic like collagen type I and fibrin glue or on more experimental scaffold (Polyelectrolytes multilayers films), to form a confluent monolayer. These PDECs are able to withstand arterial shear stress and analysis of genes and proteins implicated in endothelium biology shows that these cells respond to shear stress stimulation with a phenotype connected to an anti-thrombogenic activity. Moreover, preliminary studies using co-cultures of PDECs and osteoblastic progenitors, open interesting perspectives concerning PDECs to be used in the field of vascularized bone tissue engineering.

L'incidence des maladies cardiovasculaires d'origine athéromateuse constitue un problème majeur en santé publique et malgré le développement de techniques curatives endovasculaires, la chirurgie demeure nécessaire chez de nombreux patients. La faible disponibilité des vaisseaux naturels, autologues ou non, et les limites mécaniques et biologiques des substituts artificiels pour le remplacement des vaisseaux de petit calibre, imposent le recours à une nouvelle science : l'ingénierie vasculaire. Ce concept a émergé et évolué depuis quelques années. Il pourrait permettre de proposer de nouveaux types de substituts vasculaires synthétiques et/ou biologiques, en particulier grâce à l'utilisation de cellules souches, ouvrant d'intéressantes perspectives dans le domaine de l'ingénierie vasculaire. Le but de ce travail a été d'obtenir de manière fiable et reproductible des cellules à phénotype endothélial mature à partir de cellules souches mésenchymateuses (CSMs) issus de la gelée de Wharton (GW) du cordon ombilical et de la moelle osseuse (MO). Cependant, la différenciation de ces cellules nécessite une fonctionnalisation de la surface de culture, et notre groupe a démontré l'avantage des films multicouches de polyélectrolytes, constitués de PAH (hydrochlorure de poly(allylamine)) et de PSS (poly(styrène sulfonate)), sur l'adhésion, la prolifération et la différenciation cellulaire. Les cellules ont été cultivées sur films (PAH-PSS)4 ou sur collagène de type I (témoin), en présence de facteurs de croissance angiogéniques. La différenciation en cellules endothéliales (CEs) a été suivie par l'expression des marqueurs endothéliaux (PCR et western blot), et la fonctionnalité par leur capacité à incorporer les lipoprotéines acétylées (Ac-LDLs) ainsi que la capacité à produire du monoxyde d'azote et à exprimé le facteur von Willebrand (vWF). Après 14 jours de stimulation, seules les CSM-GWs étaient différenciées en CEs fonctionnelles démontrant l'intérêt de combiner l'utilisation des CSM-GWs et des films (PAH-PSS)4 dans le domaine de l'ingénierie vasculaire / The incidence of cardiovascular disease remains a major public health problem. Despite the development of endovascular therapies, surgical treatment is necessary for many patients. The low availability of natural vessels, autologous or not, and the mechanical and biological limits of artificial substitutes, led to the use of a new domain: vascular engineering. In recent years, the concept has emerged and evolved. He could afford to offer new types of synthetic vascular substitutes and / or biological, in particular through the use of stem cells, offering interesting perspectives in the field of vascular engineering. The purpose of this study was to obtain a reliable and reproducible protocol to generate functional endothelial cells (ECs) from mesenchymal stem cells (MSCs) derived from the umbilical cord Wharton's jelly (WJ) and bone marrow (BM). Nevertheless, their differentiation into vascular cells needs a culture surface functionalization; our group demonstrated the potential use of polyelectrolyte multilayer made of poly(allylamine hydrochloride): PAH, and poly(styrene sulfonate): PSS, in promoting cells adhesion, proliferation and differentiation. Cells were cultured on (PAH-PSS)4 films or collagen type I (used as control), in the presence of angiogenic growth factors. Cells differentiation into EC was followed through the expression of endothelial markers (PCR and western blot); cell functionality was checked through their ability to incorporate acetylated LDL (Low Density Lipoprotein), to produce NO (Nitric oxide) and to express the von Willebrand factor (vWF). After 14 days of stimulation, only WJ-MSCs were able to generate functional ECs demonstrating the potential of combining WJ-MSCs and (PAH-PSS)4 films in vascular tissue engineering field

Les taux élevés de mortalité et de morbidité associés aux maladies vasculaires en font des pathologies dont les conséquences physiopathologiques, chirurgicales et socio-économiques sont d’une importance majeure pour le système de santé. Malgré leurs avantages, la disponibilité limitée des vaisseaux autologues a conduit au développement de prothèses synthétiques. Cependant, leur surface hautement thrombogène limite leur utilisation dans la substitution des vaisseaux de petit calibre (< 6 mm). De ce fait, à cause de leur obstruction précoce, la reconstitution d’une surface luminale proche de l’endothélium natif est incontournable. Pourtant, les revêtements de surface actuellement disponibles possèdent de médiocres qualités de rétention des néo-endothélium lorsqu’ils sont soumis à des contraintes de cisaillement physiologiques. Dans ce travail, nous proposons un substitut vasculaire de petit calibre endothélialisé réalisé à partir de trois éléments : 1) une matrice préparée à partir d’une artère ombilicale désendothélialisée, 2) un recouvrement de surface innovant constitué du film multicouche de polyélectrolytes (MPE) (PAH-PSS)3-PAH, et 3) un néo-endothélium constitué de cellules endothéliales matures ou progénitrices. Les études in vitro menées sur ces substituts ont montré que la formation, la rétention sous contraintes de cisaillement et la fonctionnalité du néoendothélium élaboré sur la surface luminale étaient améliorées par le film MPE. L’implantation du substitut par pontage termino-latéral sur le lapin a montré que le cahier des charges imputé aux substituts de petit calibre était rempli, principalement en termes de perméabilité et de diamètre, mais aussi de résistance à la suture et aux infections. En conclusion, le film MPE favorise le développement d’un substitut vasculaire de petit diamètre perméable à « long » terme et qui pourrait répondre aux exigences des chirurgiens / Vascular diseases with their high rate of mortality and morbidity belong to the pathologies involving important socio-economic factors for health system. Despite the advantages of autografts, the limited availability of autologous vessels has led to the development of synthetic prostheses. However, their high thrombogenic surface limits their use as small calibre vascular substitutes (< 6 mm). To prevent narrowing of small diameter vascular grafts, the reconstruction of a luminal surface close to the native endothelium is essential. However, the retention of the neo-endothelium subjected to shear stress is poor on the coatings currently available. In this work, we developed a small calibre endothelialized vascular substitute thanks to three elements: 1) a natural matrix prepared from umbilical artery, 2) an innovative coating based on the polyelectrolytes multilayer film (PEM) (PAH-PSS)3-PAH, and 3) used for cell culture of mature or progenitor endothelial cells. In vitro studies have shown that the formation, the retention under shear stress and the endothelial function of the neoendothelium on the luminal surface were improved by PEM film. The anastomosis of this substitute on rabbits has shown that the specifications essential to small calibre vascular grafts were reached, mainly in terms of permeability and diameter but also of resistance to suture and infections. In conclusion, PEM films helped us to develop a small diameter vascular substitute with long term patency

Résumé soumis à confidentialité / Not available