La cicatrisation cutanée est un système complexe qui regroupe différents processus biologiques comme l'hémostase, l'inflammation, Pangiogenèse et la synthèse matricielle. Les myofibroblastes sont au coeur de ce système et bien que plusieurs fonctions aient été associées aux myofibroblastes, on en sait peu sur la relation qu'ils entretiennent avec les autres cellules impliquées dans la formation du tissu de granulation. Nous avons exploré la possibilité que les myofibroblastes influencent le développement angiogénique au cours de la cicatrisation cutanée. Les fibroblastes sont connus pour avoir des propriétés proangiogéniques, mais nous avons observé à l'aide d'un modèle tridimensionnel in vitro à base de fibrine que la différenciation vers un phénotype myofibroblastique permet aux cellules d'accroître leur potentiel proangiogénique. Ce potentiel proangiogénique acquis n'est pas dû à une augmentation de la sécrétion de facteurs de croissance associés à Pangiogenèse comme le VEGF ou le bFGF, mais serait plutôt associé à une augmentation de la sécrétion d'inhibiteurs des métalloprotéinases dont TIMP-1 au cours des premières étapes du développement angiogénique, et plus tardivement par la sécrétion de TIMP-3. TIMP-1 est connu pour son effet proangiogénique alors que TIMP-3, identifié comme un inhibiteur de Pangiogenèse, permet la stabilisation du réseau vasculaire évitant ainsi sa régression. Nous avons également observé que les myofibroblastes produisaient dans le surnageant de culture des microparticules capables d'induire la prolifération des cellules endothéliales et des fibroblastes. Ces microparticules, qui contiennent du VEGF et du bFGF, ne résultent pas d'un processus apoptotique, mais d'une activation suite à l'induction par un ou des médiateur(s) contenu(s) dans les fluides corporels, représentés par le sérum et le plasma sanguin. Ces microparticules sont connues comme étant des médiateurs permettant le transfert direct entre cellules d'un ensemble de molécules bioactives. Leur présence démontre qu'il existe un réseau de communication intercellulaire spécialisé au sein du processus de cicatrisation. En conclusion, nous avons montré que les myofibroblastes, déjà associés à la synthèse de la matrice extracellulaire, sont également favorables au développement angiogénique et à la prolifération cellulaire. Chacune de ces fonctions contribue à la formation du tissu de granulation et par conséquent, elles sont importantes dans le processus de cicatrisation cutanée.

Lors de la revascularisation d'un tissu lésé, les (myo)fibroblastes et les cellules endothéliales sont recrutés concomitamment au site de la lésion. Ce projet étudie les interactions existant entre ces deux types cellulaires lors de la cicatrisation normale et hypertrophique à partir de deux modèles : derme reconstruit par auto-assemblage et gel de fibrine. La détection par immunofluorescence (collagène IV) a démontré un développement plus important du réseau pseudo-angiogénique lorsque les cellules endothéliales microvasculaires étaient en présence de myofibroblastes du tissu de granulation dans le modèle de gel de fibrine, comparé à la présence des myofibroblastes pathologiques ou des fibroblastes. Aussi, le dépôt de protéines matricielles variait en fonction du type et de l'origine des cellules mésenchymateuses ainsi que de la présence des cellules endothéliales. Ceci suggère que les interactions entre les cellules endothéliales et les cellules fibroblastiques sont importantes dans le processus d'angiogenèse lors de la cicatrisation normale et pathologique.

Les produits de glycation avancée résultent d'une réaction chimique entre les sucres réducteurs, comme le glucose, avec les protéines et ainsi causer la réticulation des tissus exposés. L'hyperglycémie chronique observée dans la pathologie du diabète expose les tissus à des concentrations de glucose beaucoup plus importantes et amplifie la formation de réticulations. Les tissus vasculaires sont la voie de distribution périphérique du glucose et en sont donc directement exposés. La réticulation du système circulatoire serait la cause de complications majeures associées au diabète. Afin de mieux comprendre l'impact de la réticulation sur les vaisseaux sanguins, nous avons effectué des analyses mécaniques de différents éléments structurels composant les tissus vasculaires comme le collagène et les cellules endothéliales. Nous avons, dans un premier temps, étudié les propriétés mécaniques du collagène dans des expériences mécaniques sur des fibres de collagène. La microscopie à force atomique nous a permis d'identifier des déterminants structuraux majeurs dans la compréhension de la mécanique d'élongation des tissus de collagène. Des expériences mécaniques, suite à une réticulation par les produits de glycation avancée, ont révélé que le collagène réticulé perd une grande partie de sa capacité à dissiper la tension appliquée à sa structure. De plus, dans la phase"Toe", représentant le régime de fonctionnement physiologique et associée à une phase de déformation non linéaire, les fibres de collagène requièrent une dépense d'énergie beaucoup plus importante pour leur déformation. Le collagène réticulé par les produits de glycation avancée s'avère effectivement beaucoup plus rigide et cohésif. Ainsi, dans le contexte d'un tissu vasculaire, la réticulation par les produits de glycation avancée pourrait affecter leurs propriétés mécaniques ce qui aurait des impacts directs sur la rigidité et la compliance des vaisseaux sanguins. Parallèlement, nous avons mesuré l'impact de la réticulation sur la rigidité des cellules endothéliales suite à une exposition chronique à de fortes concentrations de glucose par une méthode de spectroscopie de force dérivée de la microscopie à force atomique. Les cellules endothéliales exposées à une forte concentration de glucose sont beaucoup plus rigides. Cette rigidité accrue serait associée à la formation de réticulations par les produits de glycation avancée. L'hyperglycémie diabétique favorise la réticulation de l'endothélium pour en modifier sa structure et affecter ses fonctions. Nous pensons que les impacts de la réticulation sur ces deux éléments des tissus vasculaires sont des facteurs majeurs de la rigidification des vaisseaux sanguins et de la dysfonction endothéliale. Ces phénomènes sont d'ailleurs clairement identifiés comme des causes directes des complications associées au diabète comme l'hypertension et l'artériosclérose.

Le TGFB(bêta) est un facteur clé dans l'homéostasie du réseau vasculaire. Le laboratoire a découvert que le TGFB(bêta) induit des podosomes dans les cellules endothéliales (CE) artérielles in vitro. Ces microdomaines riches en F-actine, sont capables de dégrader localement la matrice extracellulaire. Nous avons mis en évidence des structures de même type dans l’endothélium natif, démontrant la pertinence des observations in vitro. Les CE expriment 2 récepteurs de type I au TGFB(bêta), ALK5 et ALK1, dont les fonctions respectives sur les CE font l’objet de controverses. Nous montrons in vitro, que l’assemblage des podosomes est dépendant de ALK1 et est induit dans un contexte d'activation de la CE. La fibronectine, présente dans la matrice lors de situations d'activation de la CE, est régulée par TGFB(bêta) /ALK1 dans notre modèle et est essentielle à la formation des podosomes. L'ensemble des données obtenues laisse présager un rôle des podosomes endothéliaux dans le remodelage artériel en réponse au TGFB(bêta). / TGFB(beta), a pleiotrop cytokine, acts as an important regulator for the maintenance of vascular homeostasis. Our team has discovered, for the first time, that TGFB(beta) induces podosomes formation in aortic endothelial cells (EC) in vitro. Podosomes are highly dynamic adhesion microdomains formed at the ventral membrane, consisting of a core of F-actin and actin-associated proteins, surrounded by a ring structure which in turn is consisting of plaque proteins as well as signaling proteins. In addition to the presence of specific markers, they are distinguished from other adhesion structures by the presence of metalloproteases, endowing them with the ability to degrade the extracellular matrix locally. We have bringing to light these structures in the endothelium of native arterial vessel exposed to biologically active TGFB(beta), showing relevance of these structures. Endothelial cells express two types I receptors of TGFB(beta), ALK5 and ALK1, which relative function on EC are controversial. We show in our model in vitro, that podosomes formation is ALK1-dependent and are induced when EC are in an active background. Fibronectin, an extracellular matrix component which is present during active situation, is regulated by TGFB(beta)/ALK1 signaling pathway and is essential for podosomes formation. This work open up new avenues to study the role of podosomes in vascular pathophysiology. We propose that podosomes are involved in arterial vessel remodeling.

L'endothélium cornéen joue un rôle important dans le maintien de la transparence cornéenne, notamment en assurant le rôle de barrière entre la chambre antérieure et la cornée, et en créant des gradients ioniques nécessaires à la déturgescence stromale. Dans le cas de dysfonctions de l'endothélium, une perte progressive de la vision est engendrée. Parmi les causes de dysfonctions, la dystrophie endothéliale cornéenne de Fuchs (DECF) est la plus importante. Présentement, le seul traitement disponible pour les endothéliopathies cornéennes est la greffe de cornée. Comme la demande en tissus oculaires est grandissante, des alternatives incluant l'expansion in vitro des cellules endothéliales cornéennes (CECs) ont été proposées, soit l'endothélium reconstruit et l'injection de CECs intracamérale. L'enjeu principal lors de la culture des CECs est la transition endothélio-mésenchymateuse (TEM), phénomène où les CECs perdent leur phénotype fonctionnel pour acquérir un phénotype fibroblastique non fonctionnel. Plusieurs étapes de la culture des CECs, comme l'isolement ou le milieu utilisé, peuvent être optimisées afin de conserver la fonctionnalité des CECs. Dans cet ordre d'idée, notre laboratoire a récemment démontré que l'ajout de TGF-β1 permettait de maintenir le phénotype fonctionnel lorsqu'il était ajouté à des CECs confluentes. L'objectif général du projet est d'optimiser les paramètres d'isolement et de culture afin de générer des CECs fonctionnelles pouvant être utilisées en alternative à la greffe de cornées cadavériques. Plus spécifiquement, les objectifs de cette thèse sont 1) d'identifier les paramètres d'isolement permettant de générer des CECs de haute densité et de phénotype endothélial, 2) de comparer l'efficacité des trois isoformes du TGF-β sur le maintien du phénotype endothélial en phase de maturation, de déterminer quels sont les mécanismes impliqués dans la maturation en présence de TGF-β ainsi que de confirmer la fonctionnalité tissulaire dans un modèle de chambres antérieures artificielles et 3) d'étudier l'effet du TGF-β2 sur les CECs provenant de spécimens pathologiques (DECF), notamment l'effet sur la mort cellulaire, sur l'expression des récepteurs du TGF-β et sur la TEM. Afin de répondre à l'objectif 1, deux méthodes d'isolement des CECs ont été comparées (EDTA et collagénase). Les résultats ont montré qu'une plus grande quantité de CECs viables étaient extraites des spécimens post-mortem avec la collagénase et que ces CECs avaient une morphologie plus circulaire. En ce qui a trait à l'objectif 2, les trois isoformes du TGF-β ont été ajoutées aux CECs en phase de maturation et ont permis de générer des cultures de CECs ayant un phénotype fonctionnel in vitro. Le transcriptôme et les voies de signalisation activées par le TGF-β ont été étudiés par la suite. Les résultats de profilage génique ont révélé une augmentation de l'expression de gènes liés à l'adhésion matricielle. Le profilage des voies de signalisation a, pour sa part, permis d'identifier 8 kinases significativement plus actives, dont la kinase AKT. Pour le dernier volet de cet objectif, la fonctionnalité tissulaire a été évaluée en utilisant un modèle d'injection de CECs sur cornées dévitalisées contenues dans des bioréacteurs. Une meilleure adhésion des CECs ayant préalablement été exposées au TGF-β2 ainsi qu'un rétablissement plus rapide des jonctions a été observé dès 2 jours de culture dynamique. Pour répondre à l'objectif 3, des CECs provenant de spécimens DECF ont été exposées au TGF-β2 avant que la mort cellulaire, l'expression des récepteurs du TGF-β et l'expression des jonctions intercellulaires soient mesurées. Aucune différence quant à la mort cellulaire n'a été observée. Seul le récepteur I du TGF-β est augmenté suite à l'exposition au TGF-β2. Les CECs pathologiques exprimaient plus fortement les protéines reliées aux jonctions intercellulaires et localisées à la membrane. Les travaux présentés dans cette thèse proposent une méthode de culture qui génère des CECs fonctionnelles. Ils démontrent également que le TGF-β2 aurait un rôle protecteur sur l'intégrité de la barrière endothéliale lorsque les CECs sont confluentes.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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Les glucocorticoïdes (GCs) présentent un intérêt majeur dans le traitement de nombreuses pathologies. Dans l’œil, ils sont injectés à fortes doses directement dans le globe oculaire pour traiter les inflammations, l’œdème maculaire et la néovascularisation qui menacent la vision. Bien que spectaculaires, les effets anatomiques bénéfiques obtenus par ce traitement ne sont pas toujours corrélés avec les résultats fonctionnels et la récupération d’une acuité visuelle normale. En effet, cette thérapeutique empirique (hors AMM) a montré une corticotoxicité sur les cellules de la rétine et les vaisseaux assurant leur viabilité. Un double effort s’impose pour pallier ces inconvénients. D’une part, les études fondamentales visant à mieux comprendre les mécanismes de toxicité des glucocorticoïdes sont encore nécessaires pour être en mesure deproposer des schémas thérapeutiques rationnels. D’autre part, la mise en œuvre des compétences des laboratoires pharmaceutiques, avec le développement de nouvelles molécules, pour répondre au compromis d’obtenir une efficacité thérapeutique équivalente aux glucocorticoids avec moins d’effets secondaires sur les tissus s’impose. Dans cette optique, l’objectif de mon travail de thèse a été de mieux comprendre les mécanismes de toxicité cellulaire induits par different glucocorticoïdes sur les cellules endothéliales de la microcirculation générale dermique et rétinienne. J’ai montré que la toxicité varie selon le type cellulaire et du type GC, aussi que les mécanismes de mort déclenchés avec ces principes actifs ne sont pas toujours les mêmes. Le second vol et de ma thèse a porté sur la confirmation et l’évaluation de l’efficacité préclinique d’un nouveau traitement anti-inflammatoire, conçu par un laboratoire pharmaceutique suisse, dans le traitement des états inflammatoires en ophtalmologie. Ces travaux améliorent notre connaissance de la toxicité cellulaire des glucocorticoïdes en général et de la cytotoxicité microvasculaire en particulier. / Glucocorticoids (GCs) present a major interest in the treatment of numerous pathologies. In the eye, they are injected directly in high doses to treat inflammation, macular edema, and vision-threatening neovascularization. Although spectacular, the beneficial anatomical effects obtained by this treatmentare not still correlated to the functional resultsand the recovery of a normal visual acuteness. These empirical therapeutics (except AMM) showed a corticotoxicity on the cells of the retina and the vessels that assure their viability. A two-fold effort is imperative to mitigate these inconveniences. First, fundamental studies to better understand the mechanisms of toxicity of glucocorticoids are still necessary to be able to propose rational therapeutic plans. Second, the implementation of the skills of pharmaceutical companies, with the development of new molecules, in order to obtain an equivalently efficient therapy using glucocorticoids with fewer side effects on tissues is imperative. From this perspective, the objective of my work was to understandthe mechanisms of cellular toxicity caused by different glucocorticoids on endothelial cellsof the dermic and retinal general microcirculation. I showed that toxicity varies according to the cellular type and that the mechanisms of cells death activated with these drugs are not always the same. The second part of my thesis concerned the confirmation and the evaluation of the preclinical efficiency of a new anti-inflammatory treatment, conceived by a Swiss pharmaceutical company, in the treatment of the inflammatory states in ophthalmology. These works improve our knowledge of the general cellular toxicity of glucocorticoids and provides further insight to the microvascular cytotoxicity associated with this treatment option.

La modulation phénotypique des cellules musculaires lisses (CML) artérielles d’un phénotype contractile vers un phénotype synthétique en réponse à des stimuli pathogènes est impliquée dans le développement de l’artériosclérose. Il est clairement établi que l'homocystéine (HCY) induit un remodelage de type artériosclérose au niveau des artères élastiques. Ce remodelage pathologique induit par l'HCY est dominé par l'accumulation de CML présentant un phénotype synthétique associée à une dysfonction endothéliale. Cependant, l'effet de l'HCY sur le phénotype des CML n’a pas été clairement décrit. Compte tenu du rôle déterminant des cellules endothéliales dans la modulation du phénotype des CML artérielles, l’objectif de notre travail est de déterminer dans quelle mesure l’effet de l’HCY sur le phénotype des CML est direct ou est dépendant d’une dysfonction endothéliale. Nous avons montré que des concentrations pathologiques d’HCY augmentent la prolifération de CML d’artères ombilicales humaines en culture et augmentent leur potentiel protéolytique par un mécanisme dépendant des espèces réactives de l'oxygène. Dans le même temps, l’HCY ne modifie pas l'expression des collagènes de type I et III et de la fibronectine, ni l'expression de protéines contractiles (SM a-actine, calponine hl, SMMHC et smoothéline B). Que ce soit sur des CML pré-conditionnées ou non par du milieu de culture conditionné (MC) de cellules endothéliales de veine ombilicales (HUVEC), nous avons montré que le MC d’HUVEC stimulées par 100µM d'HCYne lève pas l'inhibition de la prolifération des CML induite par les HUVEC et ne modifie pas l'expression des collagènes de type I et III et de la fibronectine, ni l'expressìon de protéines contractiles. Nos résultats sont en faveur d’un effet modulateur direct de l'HCY orientant le phénotype des CML vers un phénotype synthétique. S’il est connu que l'HCY induit une dysfonction endothéliale, cette dysfonction ne semble pas avoir de conséquences sur le phénotype des CML. / Phenotype switching of arterial smooth muscle cells (SMC) from a contractile phenotype through a synthetic phenotype in response to pathogenic stimuli is involved in the development of arteriosclerosis. It is well established that homocysteine (HCY) induces arteriosclerosis in elastic arteries. This pathologic arterial remodelling is characterized by the accumulation of SMC showing synthetic phenotype associated with an endothelial dysfunction. However, the effects of HCY on SMC phenotype are unclear. Since endothelial cells play a key role in the regulation of SMC phenotype, the goal of our study is to determine whether HCY modulates the SMC phenotype through a direct effect or through the induction of an endothelial dysfunction. We found that pathologic concentrations of HCY increase the proliferation of human arterial umbilical SMC in culture and increase their proteolytic potential through a reactive oxygen species dependant mechanism. We also found that HCY has not effect on the expression of type I and III collagen and fibronectin, as well as contractile proteins (SM a-actine, calponine hl, SMMHC et smootheline B). Using pre-conditionned or not pre-conditionned SMC by conditionned culture medium (MC) from human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), we found that MC from HUVEC stimulated with 100µM of HCY prevent the inhibition of proliferation induced HUVEC and did not altered the expression of type I and III collagen and fibronectin, as well as contractile proteins. Our results suggest that HCY can directly modulate the SMC phenotype towards a synthetic phenotype. Although HCY as been previously shown to induce an endothelial dysfunction, this latter does not seem to be involve in the modulation of SMC phenotype associated with hyper homocysteinemia.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.