Thèse en cotutelle pour un Doctorat en génie des matériaux et de la métallurgie, Université Laval, Québec, Canada et l'Université de Haute-Alsace, Mulhouse, France / L’absence de croissance en monocouche des cellules endothéliales sur la paroi des prothèses vasculaires est une des causes d’échec de leur implantation chez l’humain. Des études précédentes ont montré que le recouvrement de ces prothèses par un échafaudage de nanofibres d’acide polylactique (PLA), fabriqué par un système de filage par jet d’air innovant, peut être utilisé pour promouvoir la croissance des cellules endothéliales de façon adéquate. Ainsi, le caractère dégradable d’un matériau comme le PLA permettrait son remplacement graduel par la matrice extra-cellulaire produite par les cellules. D’autre part, la réussite d’une transition entre les nanofibres dégradables et la matrice extra-cellulaire nécessite un remplacement contrôlé et approprié. Or, la dégradation des nanofibres de PLA, dépendant de ses séquences stéréochimiques, est généralement trop longue et peut induire une cytotoxicité relative pendant sa dégradation. Dans ce contexte, les études de cette thèse ont pour objectifs de mieux comprendre la formation des fibres lors du filage, d’optimiser la fabrication des échafaudages permettant ainsi la création de nanofibres d’autres polymères, puis, de concevoir des nanofibres provenant d’un polymère mieux adapté à nos besoins, d’évaluer leur mécanisme de dégradation et sa cytotoxicité durant sa dégradation. Les travaux d’optimisation du système de filage ont démontré que la concentration avec un effet prépondérant. Ainsi, la mesure de la viscosité permet de trouver les paramètres adéquats pour le filage de polymère. Ensuite, un poly(L-lactide) semi-cristallin (PLLA) et un terpolymère de poly(lactide-co-ε-caprolactone) (PLCL) dédié pour des applications vasculaires ont été synthétisés et filés par jet d’air. Ces échantillons ont été dégradés en solution aqueuse et caractérisés par des méthodes physico-chimiques afin de mieux comprendre leurs mécanismes de dégradation et mis en présence de cellules endothéliales pour évaluer leur cytotoxicité. La comparaison entre les échafaudages des deux polymères a montré des comportements singuliers en dégradation, dépendants des caractéristiques thermiques des polymères. De plus, ces mécanismes de dégradation des nanofibres ont une influence directe sur la sensibilité des cellules endothéliales face aux produits de dégradation. En conclusion, ces travaux de doctorat présentent une solution prometteuse pour améliorer les prothèses vasculaires et qui pourrait être appliquée pour résoudre plusieurs problématiques en médecine régénératrice. / The absence of neo-endothelium on the intimal surface of vascular substitutes is known to be one cause of failure upon implantation of these prostheses in humans. Previous studies have shown that the coating of these substitutes with a nanofiber scaffold, made with an innovative air spinning device, can be used to promote a suitable endothelial cells growth. On one hand, the degradable feature of material as PLA enable the progressive replacement of the scaffold by the extracellular matrix of cells. On the other hand, the success of this replacement between degradable nanofibers and the extracellular matrix requires to be appropriate and controlled. Yet, the PLA nanofiber degradation process, which depends on its stereosequences, is generally too long for this application and could involve cell sensitivity during the degradation. In this context, studies from this thesis aim to understand the fibers formation during spinning, optimizing the scaffold fabrication as well as to promote the making of novel polymer scaffolds, then, design solution to polymeric nanofiber scaffolds for vascular application, evaluate its degradation mechanism and cytotoxicity during degradation process. The work on spinning device optimisation has demonstrated that the concentration had a dominant effect. Thus, viscosity measurements enable to find suitable parameters for polymer spinning. Then, a semi-cristalline poly(L-lactide) (PLLA) and a poly(lactide-co-ε-caprolactone) (PLCL) terpolymer specifically made for vascular application have been synthesized and air-spun. These samples were degraded in aqueous solution and characterized by physical and chemical methods to better understand their degradation mechanisms and seeded with endothelial cells to evaluate their cytotoxicity. The comparison between the two polymers scaffolds have shown surprising degradation behaviors depending on thermal properties of polymers. Moreover, these nanofiber degradation mechanisms have a direct influence on endothelial cells sensitivity with degradation by-products. To conclude, these works of doctorate display a promising solution to improve vascular prostheses and which could be applied to solve several issues in regenerative medicine field.

Le compartiment microvasculaire est une cible importante du stress oxydant qui est un facteur majeur de la dysfonction endothéliale, notamment au cours d’exposition aux rayonnements ionisants. L’altération de l’endothélium induite par le stress oxydant est impliquée dans la toxicité radio-induite des tissus sains. Limiter les dysfonctions endothéliales est donc un enjeu important des traitements radiothérapeutiques actuels. Cet objectif nécessite une meilleure caractérisation de la signalisation du stress oxydant dans les cellules endothéliales. La voie p38 MAPK est incontournable dans la réponse au stress oxydant mais reste encore insuffisamment caractérisée. Par une approche protéomique, nous avons identifié la nucléophosmine (NPM) comme nouveau partenaire de p38 dans le cytoplasme des cellules endothéliales. La phosphatase PP2a est aussi associée à ce complexe NPM/p38. Nos travaux montrent que le stress oxydant (H2O2, 500μM) régule la déphosphorylation de NPM via PP2a, entraine sa dissociation rapide du complexe et favorise sa translocation vers le noyau. De plus, nous montrons que la présence de NPM déphosphorylée au noyau altère la réponse des cellules aux dommages à l’ADN induits par le stress oxydant. Le céramide sphingolipide membranaire est également un facteur important des voies de stress, particulièrement dans les cellules endothéliales. Notre étude aborde donc l’implication de ce sphingolipide dans la régulation de la voie NPM/p38. Une meilleure caractérisation de la voie p38 et de ses acteurs permettra d’identifier de potentielles cibles afin de limiter les dysfonctions endothéliales et leurs conséquences délétères sur les tissus environnants. / The microvascular compartment is a significant target of oxidative stress that is a major factor in endothelial dysfunction, especially during exposure to ionizing radiation. The alteration of endothelium induced by oxidative stress is involved in radiation-induced toxicity of normal tissues. Limiting endothelial dysfunction is therefore an important issue of current radiotherapeutic treatments. This objective requires a better characterization of oxidative stress signaling in endothelial cells. p38 MAPK pathway is essential in oxidative stress response but still insufficiently characterized. By using a proteomic approach, we identified nucleophosmin (NPM) as a new partner of p38 in the cytoplasm of endothelial cells. PP2a phosphatase is also associated with the NPM/p38 complex. Our work shows that oxidative stress (H2O2, 500μM) regulates the NPM dephosphorylation via PP2a, causes a rapid dissociation of the complex, and promotes its translocation to the nucleus. In addition, we show that the presence of NPM dephosphorylated at T199 in the nucleus alters the cellular response to DNA damage induced by oxidative stress. The membrane sphingolipid ceramide is also an important factor in stress pathways, particularly in endothelial cells. Our study describes the involvement of this sphingolipid in the regulation of NPM/p38 pathway. A better characterization of the p38 pathway and its actors provided by our study will identify potential targets in order to limit endothelial dysfunction and its deleterious effect on surrounding tissues.

Cette recherche visait à étudier les interactions cellules-cellules qui interviennent entre les cellules du PRP, les cellules endothéliales et les ostéoblastes dans un modèle de co-culture in vitro. Ainsi, des quantités de PRP ou de surnageants de PRP, activés par l'ajout de TRAP-6 ou non, ont été ajoutées à des cellules endothéliales ou des ostéoblastes, séparés par une membrane semi-perméable et la prolifération cellulaire mesurée par une méthode colorimétrique. Les résultats obtenus montrent que les surnageants de PRP et les PRP sont mitogéniques pour les cellules endothéliales et pour les ostéoblastes en mono-culture. Cependant, l'effet mitogénique en co-culture n'est observé qu'en présence de surnageant de PRP et ce, uniquement sur la croissance des cellules endothéliales, suggérant un mode de régulation de la division cellulaire distinct de ces deux lignées cellulaires.

La migration des cellules endothéliales en réponse au VEGF est une étape cruciale du processus angiogénique. La liaison du VEGF sur son récepteur, le VEGFR2, conduit à l’autophosphorylation sur la tyrosine 1214 de ce dernier ce qui induit l’activation de la voie p38 MAP-kinase, le remodelage du cytosquelette d’actine et la migration cellulaire. Les microARNs sont de courts ARN non-codant qui régulent de façon post-transcriptionnelle l’expression des gènes. Nous avons identifié deux microARNs, miR-20a et miR-196a, dont les niveaux d’expression sont respectivement augmentés et diminués en réponse au VEGF dans les cellules endothéliales. Ces deux microARNs modulent le remodelage du cytosquelette d’actine, la migration et l’angiogenèse. Aussi, nous avons décrit leurs implications dans la régulation de la voie p38. Tout d’abord, miR-20a agit en amont de p38, et réprime l’expression de MKK3 en se liant de façon spécifique à sa région 3’UTR. MKK3 étant un activateur direct de p38 en réponse au VEGF, la surexpression de miR-20a empêche l’activation de p38, de son substrat la MAPKAP kinase-2 et la phosphorylation subséquente de HSP27. En conséquence, miR-20a inhibe la formation des fibres de tension, la migration endothéliale et l’angiogenèse. Ces résultats nous ont permis de conclure que miR-20a agit dans une boucle de régulation négative afin de moduler la migration dépendante de la voie p38 activée par VEGF. Ensuite, le niveau d’expression de miR-196a est diminué en réponse au VEGF et nous avons démontré sa liaison spécifique à la région 3’UTR de l’ANXA1. En accord avec nos précédents travaux démontrant que l’ANXA1 est importante pour la migration endothéliale dépendante de l’activation de p38 par le VEGF, la surexpression de miR-196a empêche la formation des lamellipodes, réduit les capacités migratoires des cellules endothéliales et inhibe ainsi l’angiogenèse in vitro et in vivo. En conclusion, une réduction de l’expression de miR-196a agit en synergie avec le VEGF, pour faciliter la migration endothéliale, en maintenant un niveau d’expression élevé de l’ANXA1 pro-migratoire. Nos résultats, en impliquant miR-20a et miR-196a dans la modulation de l’angiogenèse, apportent des concepts nouveaux sur la régulation de la voie p38 pro-migratoire en réponse au VEGF. Ces travaux ouvrent des perspectives pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à régulariser l’angiogenèse pathologique. / Endothelial cell migration in response to VEGF is a crucial step of angiogenesis. VEGF binding to its receptor VEGFR2 results in the autophosphorylation of the receptor at tyrosine 1214, which induces the downstream activation of the p38 MAP-kinase pathway leading to actin cytoskeleton remodeling and cell migration. MicroRNAs are short, non-coding RNAs that regulate post-transcriptionally gene expression. We identified two microRNAs, miR-20a and miR-196a, whose levels of expression were increased and decreased respectively in response to VEGF in endothelial cells. Both microRNAs modulate VEGF dependent-endothelial cell cytoskeleton remodeling, migration and angiogenesis. Also, we described that they are involved in regulating the p38 pathway. First, miR-20a acts upstream of p38, and negatively regulates MKK3 by specifically binding on MKK3 3’UTR. As MKK3 is a direct activator of p38 in response to VEGF, overexpression of miR-20a impairs p38 activation, the downstream activation of MAPKAPK2 and the phosphorylation of HSP27. Consequently, miR-20a reduces stress fibers formation, and subsequent endothelial cell migration and angiogenesis. We conclude that miR-20a may act in a feedback loop to regulate the p38 pathway-mediated VEGF-induced endothelial cell migration. Then, miR-196a is decreased in response to VEGF and we demonstrate its specific binding on ANXA1 3’UTR. In accordance with our previous work demonstrating that ANXA1 is important for VEGF-induced endothelial migration downstream of p38 pathway, overexpression of miR-196a impairs lamellipodia and endothelial cell migratory capacities upon VEGF treatment, leading to angiogenic defects. We conclude that miR-196a acts in a synergetic mechanism with VEGF to facilitate endothelial cell migration, by maintaining high level of the pro-migratory protein ANXA1. Finally, our results implicate miR-20a and miR-196a in the angiogenic process and give new insights in p38 pathway-dependent endothelial cell migration regulation in response to VEGF. The present work opens new avenues for strategies and future development of therapeutics in line with the treatment of angiogenic pathologies.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2007-2008. / La migration des cellules endothéliales est une étape nécessaire à l'angiogenèse. Le facteur pro-angiogénique VEGF {vascular endothelial growth factor) induit la réorganisation du cytosquelette d'actine en fibres de tension et la migration cellulaire en activant la stress-activated protein kinase-2 (SAPK2/p38 : p38) via le VEGFR-2 (vascular endothelial growth factor receptor-2). Cette étude vise à identifier puis à caractériser les fonctions des cibles de p38 dans les cellules endothéliales activées par le VEGF. Suite à une électrophorèse bi-dimensionnelle et à une analyse par spectrométrie de masse, nous avons isolé l'annexine 1 (ANXA1) comme une protéine dont la phosphorylation est induite par le VEGF et est diminuée en inhibant p38. L'ANXAl a d'abord été caractérisée comme une protéine qui module l'action anti-inflammatoire des glucocorticoïdes en inhibant la phospholipase A2. En outre, plusieurs études indiquent que l'ANXAl joue un rôle dans la prolifération et la différenciation cellulaires et qu'elle interagit avec des protéines du cytosquelette comme la tubuline et l'actine. Après avoir identifié l'ANXAl en aval de p38 nous avons caractérisé ses fonctions ainsi que la kinase responsable de sa phosphorylation. En utilisant des essais de phosphorylation in vitro et in vivo, nous avons montré que la MAPKAP kinase-2 activée par le VEGF régule la phosphorylation de l'ANXAl en aval de p38. Dans les cellules non stimulées, l'annexine 1 est prédominante dans le noyau, tandis que lorsque les cellules endothéliales sont stimulées au VEGF, elle se déplace du noyau vers le cytoplasme où elle co-localise avec l'actine F dans les lamellipodes. L'inhibition de la translocation par le SB203580 et la leptomycine B suggère qu'elle nécessite une phosphorylation et le système cargo CRM1. De plus, la migration cellulaire est inhibée à la suite du knockdown de l'ANXAl par l'utilisation d'un ARNi ciblant l'ARNm de la protéine. En outre, la migration cellulaire et la tubulogenèse initiées par le VEGF sont inhibées à la suite du knockdown de l'ANXAl. En conclusion, nos résultats suggèrent que la phosphorylation de l'ANXAl régule l'effet angiogénique associé à l'activation de la voie de signalisation p38/MAPKAP kinase-2 par le VEGF.

L'angiogénèse est un processus physiologique soutenu par la migration des cellules endothéliales. Le facteur pro-angiogénique VEGF (vascular endothelial growth factor) induit la réorganisation du cytosquelette d'actine en fibres de tension et la migration cellulaire en activant la stress-activated protein kinase-2 (SAPK2/p38 : p38) via le VEGFR-2 (vascular endothelial growth factor receptor-2). Cette étude vise à caractériser les mécanismes moléculaires, en aval de p38, impliqués dans la phosphorylation de l'annexine Al (ANXA1) chez les cellules endothéliales activées par le VEGF et de démontrer leur rôle dans la migration cellulaire. Les résultats suggèrent que l'ANXAl est une nouvelle cible du sentier p38/MAPKAP K2 (mitogen-activated protein kinase activated-protein kinase 2) et qu'elle régule la migration des cellules endothéliales stimulées par le VEGF. Premièrement, à l'aide d'une électrophorèse en 2D et d'une analyse de spectrométrie de masse, nous avons identifié l'ANXAl comme une protéine dont la phosphorylation est induite par le VEGF et diminuée suite à une inhibition de l'activité de p38. Deuxièmement, en utilisant des essais kinases in vitro et des essais de phosphorylation in vivo, nous avons découvert que l'activation de la LIMK1 (lin-ll/Isl-l/Mec-3 domain-containing protein kinase) par le VEGF en aval de p38 entraîne la phosphorylation de l'ANXAl. Troisièmement, nous avons démontré que l'ANXAl joue un rôle dans la migration des cellules endothéliales et dans la tubulogénèse, du fait que ces processus initiés par le VEGF sont inhibés à la suite de l'invalidation de l'ANXAl par un ARNi (ARN interférant). Toutefois, cette inhibition est renversée en ajoutant un plasmide contenant de l'ADN de l'ANXAl insensible au ARNi. En conclusion, nos résultats suggèrent que la LIMK1 activée par le sentier p38 phosphoryle l'ANXAl, une protéine indispensable à la migration des cellules endothéliales et à la formation de tubules induites par le VEGF.

Titre de l'écran-titre (visionné le 29 janvier 2024) / La dystrophie endothéliale cornéenne de Fuchs (FECD) est une pathologie qui touche la couche postérieure de la cornée, l'endothélium cornéen. Ce dernier fait office de barrière physique entre l'humeur aqueuse et le reste de la cornée. De ce fait, lorsqu'il est défectueux, une accumulation de l'humeur aqueuse dans le stroma entraîne l'apparition d'un œdème stromal et de bulles épithéliales. Il s'en suit une opacification cornéenne menant à une perte de vision irréversible. Cliniquement, la pathologie est associée à l'épaississement de la membrane de Descemet (DM) dû à un dépôt accru de matrice extracellulaire (MEC), entraînant la formation d'excroissances, appelées guttae. Puis, une perte de densité des cellules endothéliales cornéennes (CECs) se produit contribuant aux difficultés de maintenir la déturgescence du stroma. En Amérique du Nord, la FECD est la principale cause de transplantation de cornées qui représente son seul traitement. De nouveaux traitements sont à l'étude mais nécessitent une bonne compréhension de la maladie et des dérégulations de l'endothélium cornéen. La FECD étant une pathologie multifactorielle, son étiologie reste difficile à déterminer. La recherche a mené à la proposition de différentes hypothèses d'explications au développement de la maladie. Parmi elles, la transition endothélio-mésenchymateuse ou épithélio-mésenchymateuse (TEM). Ce processus cellulaire consiste au passage d'un phénotype endothélial ou épithélial vers un phénotype mésenchymateux. Malgré quelques mises en évidence de la TEM dans la FECD, des signes clés de cette transition manquent dans la maladie, tels que le passage à une morphologie fibroblastique et un changement de cadhérines. C'est pourquoi notre laboratoire a décidé de clarifier la présence de la TEM dans la FECD. L'objectif de ce projet est de comprendre comment la TEM est activée dans la FECD et son impact sur les CECs. De ce fait, notre laboratoire a étudié la TEM à un niveau intracellulaire et extracellulaire en utilisant aussi bien des CECs primaires que des modèles tissulaires. Notre attention s'est d'abord portée sur l'étude des protéines impliquées dans les voies TGF-β/Smad et Wnt/β-caténine (connues pour activer la TEM) dans les CECs *ex vivo* et *in vitro*. Dans un deuxième temps, nous nous sommes intéressées au dépôt anormal de MEC, un des signes d'une TEM. En effet, nous avons proposé que les protéines matricielles anormalement déposées seraient impliquées dans la perte cellulaire endothéliale dans la FECD. Nous avons donc étudié l'expression de protéines matricielles dans les stades précoces et avancés de la FECD et leur influence sur l'adhésion et la migration des CECs en culture. Pour répondre au premier objectif, des données transcriptomiques et l'expression des protéines liées à la TEM ont été étudiées *ex vivo*. Les protéines d'intérêt ont également été étudiées *in vitro* avec ou sans irradiation chronique d'UVA. Nos travaux en *ex vivo* FECD ont révélé l'absence de l'activité des voies Wnt/β-caténine et TGF-β/Smad. *In vitro*, ces deux voies de signalisations étaient actives et une augmentation de TGF-β2 a également été observée. Néanmoins, l'exposition aux UVA n'a pas modifié le profil d'expression des protéines. Pour le deuxième objectif, les données transcriptomiques du matrisome de CECs *ex vivo* et *in vitro* ont été analysées. Nous avons ensuite étudié la morphométrie des guttae en *ex vivo* et l'expression de nos protéines d'intérêt en *ex vivo* et sur les endothélia cornéens reconstruits sains et pathologiques. Des tests d'adhésion et de migration ont ensuite été réalisés. Les gènes *SPP1* (Ostéopontine), *FN1* (Fibronectine) et *TNC* (Ténascine-C) étaient régulés à la hausse en *ex vivo* et SPP1 était régulé à la hausse aussi bien *ex vivo* qu'*in vitro*. La fibronectine (FN), ténascine-C (TN-C), ostéopontine (OPN) et le collagène de type XIV (COL XIV) étaient exprimés dans les DM FECD mais seules la TN-C et la FN se retrouvaient dans les endothélia reconstruits FECD. La FN et la TN-C n'ont pas modifié l'adhésion des CECs mais l'OPN l'a diminuée. La FN et la combinaison de FN et TN-C ont augmenté significativement la migration des CECs. Les travaux de cette thèse permettent d'apporter plus de connaissances sur l'activation de la TEM dans la FECD et mettent en évidence une chronologie du dépôt de MEC anormale dans la pathologie ainsi que la façon dont les CECs y réagissent. Une meilleure compréhension du développement de la FECD pourrait apporter des clés pour la conception de nouveaux traitements. / Fuchs corneal endothelial dystrophy (FECD) is a pathology that affects the posterior layer of the cornea, the corneal endothelium. The endothelium acts as a physical barrier between the aqueous humor and the rest of the cornea, so when it is defective, an accumulation of aqueous humor in the stroma leads to stromal edema and epithelial bullae. This leads to corneal opacification and irreversible vision loss. Clinically, the pathology is associated with thickening of Descemet's membrane (DM) due to an increase of extracellular matrix (ECM), leading to the formation of outgrowths known as guttae. This is followed by a loss of corneal endothelial cell (CEC) density, making it difficult to maintain stromal deturgescence. In North America, FECD is the leading cause of corneal transplantation, which is its only treatment. New treatments are under study but require a good understanding of the disease and corneal endothelium dysregulation. As FECD is a multifactorial pathology, its etiology remains difficult to determine. Research has led to the proposal of various hypothesis to explain the development of the disease. One of these is endothelial to mesenchymal or epithelial to mesenchymal transition (EMT). This cellular process is characterized by the transition from an endothelial or epithelial phenotype to a mesenchymal one. Despite some evidence of EMT in FECD, key signs of this transition are missing in the disease, such as the transition to a fibroblastic morphology or the cadherins switch. Therefore, our laboratory decided to clarify the presence of EMT in FECD. The aim of this project is to understand how EMT is activated in FECD and its impact on CECs. Accordingly, our laboratory has studied EMT at both intracellular and extracellular levels, using both primary CECs and tissue models. Our first focus was on the study of proteins involved in the TGF-β/Smad and Wnt/β-catenin pathways (known to activate EMT) in *ex vivo* and *in vitro* CECs. In a second step, we focused on abnormal ECM deposition, one of the key signs of EMT. Indeed, we proposed that abnormally deposited matrix proteins would be involved in endothelial cell loss in FECD. We therefore studied the expression of matrix proteins in the early and late stages of FECD and their influence on the adhesion and migration of cultured CECs. To address the first objective, transcriptomic data and the expression of EMT-related proteins were studied *ex vivo*. Proteins of interest were also studied *in vitro* with or without chronic UVA irradiation. Our *ex vivo* FECD work revealed the absence of Wnt/β-catenin and TGF-β/Smad pathway activity. *In vitro*, both signaling pathways were active, and an increase in TGF-β2 was also observed. Nevertheless, UVA exposure did not alter the protein expression profile. For the second objective, transcriptomic data from the *ex vivo* and *in vitro* matrisome were analyzed. We then studied guttae morphometry in *ex vivo* specimens and the expression of our proteins of interest in *ex vivo* specimens and on healthy and pathological tissue engineered corneal endothelia. Adhesion and migration assays were then performed. *SPP1* (Osteopontin), *FN1* (Fibronectin) and *TNC* (Tenascin-C) genes were up-regulated *ex vivo*, and *SPP1* was up-regulated both *ex vivo* and *in vitro*. Fibronectin (FN), tenascin-C (TN-C), osteopontin (OPN) and collagen type XIV (COL XIV) were expressed in FECD DMs, but only TN-C and FN were found in reconstructed FECD endothelia. FN and TN-C had no impact on CEC adhesion, but OPN did. FN and the combination of FN and TN-C significantly increased CEC migration. The studies of this thesis provide further insight into the activation of EMT in FECD, highlight the chronological abnormal ECM deposition in the pathology and how CECs respond to it. A better understanding of the FECD development could bring keys to design new treatments.

L'enzyme de conversion de l'angiotensine (ECA) et le récepteur B₁. (RBO des kinines jouent des rôles essentiels dans la régulation de la pression artérielle et l'inflammation. Bien que les mécanismes par lesquels ils exercent leurs effets soient bien connus, leurs modes de régulation et d'expression au niveau cellulaire restent encore mal compris. La première partie de notre étude visait particulièrement à élucider l'ensemble des voies de signalisation responsables de la modulation de l'ECA. Dans la seconde partie, nous avons tenté de caractériser le RB₁ en identifiant les facteurs et les mécanismes intracellulaires essentiels à son expression. Les cellules vasculaires endothéliales et musculaires lisses, ainsi que des essais de contractilité d'aortes de lapin isolées étaient exploités pour répondre à nos objectifs. Les cytokines pro-inflammatoires régulent négativement l'expression de l'ECA tandis que le PMA augmente plutôt sa densité membranaire. L'effet des cytokines semble tributaire de l'activation du facteur de transcription NF-KB ainsi que de la MAP kinase p38. Le PMA, en activant les protéines kinase C (PKC), conduit à la mobilisation des voies de signalisation impliquant MEK1, ERK 1/2 et accessoirement, l'activation de la protéine c-Fos. Les PKC classiques, à l'exclusion de l'isoforme β joueraient un rôle essentiel dans cette expression. Dans la deuxième partie de nos travaux, nous avons montré que l'isolation de l'aorte de lapin activait la signalisation du récepteur EGF (R-EGF) et que cette signalisation serait responsable de la sensibilisation spontanée de cet organe en réponse aux agonistes du RBi, . L'EGF induirait la sécrétion de l'interleukine 1 qui, de façon autocrine, augmenterait le RBi. Au niveau des cellules vasculaires humaines, l'interféron-γ potentialise l'effet d'autres cytokines telles que le TNF-α et cause une augmentation considérable de l'expression membranaire du RB₁. L'interféron-y semble agir au niveau transcriptionnel en augmentant l'ARN messager codant pour ce récepteur. Cet effet serait la conséquence de la mobilisation, par cette cytokine, d'une voie de signalisation atypique impliquant l'interaction de Tyk2 et STAT1 dans les cellules vasculaires. Ainsi, notre étude nous à permis de mieux comprendre les mécanismes responsables de la modulation de l'ECA et du RB₁ au niveau vasculaire. Nous espérons que ces résultats permettront de mieux comprendre leur régulation en physiopathologie cardiovasculaire et inflammatoire.

Toward the objective to create or to replace impaired tissues, it is essential to establish a culture process allowing tissue growth in vitro . The Petri dish culture or the traditional 2D culture has only a limited potential, mainly caused by a poor oxygen mass transfer to feed larger tissue constructs. In this project, an autonomous and complete bioprocess has been built to fullfill these needs. The developed reactor is versatile because many cell culture chamber designs can be connected to it. Two proportional-integral algorithms (PI) can control the dissolved oxygen concentration and the pH. The pressure, the temperature and mass flow rate are recorded in real time. An actuator allows mimicking the cardiac output flow. In this mémoire , it will be demonstrated how the reactor has been optimized to reduce the risk of bioburden. Also, the procedures to develop the control tools of the PI algorithm will be detailed. To characterize the reactor, a RTD study will be presented. To characterize the cell culture chamber, a permeability analysis using fluorescent microscopy and magnetic resonance imaging (MRI) will be exposed. Finally, two cell culture chamber designs to orient microvessel formation have been tested and these results will be presented.

La neuroradiologie Interventionnelle est devenue une spécialité médicale à part entière en évolution permanente avec l'amélioration des technologies radiologiques et endovasculaires. Néanmoins, de trop nombreuses complications liées à la technique elle-même sont encore rapportées. Basés sur notre expérience clinico-radiologique, nous nous sommes plus particulièrement intéressés aux complications thromboemboliques grâce à de nouvelles technologies biologiques permettant d'envisager une analyse des lésions vasculaires à l'échelle cellulaire (Cellsearch®). Ainsi au cours de différents examens diagnostiques et thérapeutiques nous avons analysé les taux artériels et veineux de cellules endothéliales circulantes à différents temps de la procédure. Nous avons démontré l'agression du matériel endovasculaire sur les parois artérielles induisant un relargage immédiat de CECs unitaires et en amas de taille variable, parfois géants (300 µm). Les amas présentant une taille supérieure aux diamètres des microcapillaires ne peuvent pas migrer dans le compartiment veineux et sont donc potentiellement à l'origine d'une occlusion artérielle très distale responsable de lésions microischémiques qualifiées de silencieuses car asymptomatique dans l'ensemble des cas observés. Les lésions pariétales artérielles induites sont ensuite probablement réparées par un mécanisme dynamique mettant en jeu une augmentation lente et progressive des CEPs jusqu'à l'obtention d'une réparation de l'endothélium. Au delà des facteurs mécaniques endovasculaires, l'analyse cellulaire de cette cinétique destruction-régénération des parois artérielles pourrait s'avérer intéressante dans l'évaluation de l'endothélialisation des endoprothèses intracrâniennes. / Permanents Improvements in radiological and endovascular devices made the Interventional Neuroradiology considered as a complete medical specialty. However, too many procedural complications due to the devices remain observed in all reported series. On the basis of our clinical center experience we decided to analyze thromboembolic complications by using new biological tests allowing to the detection of circulating endothelial cells. During cerebral diagnostic or therapeutic angiography, arterial and venous CECs rates were analyzed before, during, and after endovascular procedures. Thus, we demonstrated the potential arterial wall injury following catheterization that induced unit and cluster of CECs, some of them were giants (300 µm). Clusters presenting with a size up than those described from microcapillary lumen cannot go through venous compartment, and potentially block into a distal artery inducing microischemic stroke (silent embolism) as observed in this work. In addition, the induced arterial wall injury is probably regenerated by a dynamic mechanism involving a delayed increase of CEPs rates, until the new endothelialization. Over endovascular mechanism factor analysis, the CECs-CEPs investigations could be an interesting strategy in the monitoring of intracranial endoprothesis endothelialization.