L'administration systémique de gènes représente une voie intéressante pour le traitement par thérapie génique de la mucoviscidose ou des cancers pulmonaires. Dans cette optique, les polyplexes (complexes ADN/polymère cationique) doivent atteindre le poumon et traverser les vaisseaux sanguins pour transfecter les cellules épithéliales mutées ou les cellules cancéreuses. Il existe peu de données sur le passage transendothélial de polyplexes. Afin d'en améliorer les connaissances, nous avons mis au point un modèle d'endothélium microvasculaire pulmonaire et étudié l'influence de la polarisation cellulaire sur les voies d'internalisation de polyplexes formés avec la polylysine histidylée (pLK-His) et la polyéthylènimine (PEI), leur efficacité de transfection, leur capacité à traverser la barrière endothéliale et leur adhésion sur la monocouche de cellules endothéliales en conditions de flux. Les travaux réalisés montrent que la polarisation des cellules endothéliales diminue l'internalisation et l'efficacité de transfection des polyplexes pLK-His mais pas celles des polyplexes PEI. Par contre, la polarisation des cellules épithéliales n'a pas d'influence sur l'efficacité des polyplexes pLK-His. Les polyplexes pLK-His et PEI sont capables de traverser la monocouche de cellules endothéliales et transfecter des cellules épithéliales à la fois par leur côté apical et basolatéral. L'incubation des cellules endothéliales avec des cytokines pro-inflammatoires permet d'augmenter ce passage. Enfin, l'adhésion des polyplexes sur les cellules endothéliales est plus importante dans les conditions de flux des microvaisseaux que dans les conditions de flux des veines. L'adhésion des polyplexes PEI est légèrement supérieure à celle des polyplexes pLK-His. Des polyplexes formés avec une PEI sur laquelle a été greffée des motifs de tétraglucose spécifiques des cellules endothéliales adhèrent trois fois plus que les polyplexes formés avec la PEI ce qui montre un ciblage des cellules endothéliales pulmonaires en conditions de flux. L'ensemble des résultats montre qu'il est indispensable de mieux considérer les effets des conditions physiologiques des cellules (polarisation, effets du flux sanguin, conditions d'inflammation) sur la transfection pour concevoir de nouveaux vecteurs synthétiques afin d'améliorer leur efficacité in vivo.

L'intégrité de l'endothelium vasculaire est maintenue par des structures d'adhérence jonctionelle, notamment les jonctions adhérentes, dont la VE-cadhérine est le constituant majeur. Cette cadhérine est exclusivement exprimée dans les cellules endothéliales et joue un rôle clé au cours de la formation du plexus vasculaire. Les cellules endothéliales expriment également une autre cadhérine : la N-cadhérine. Bien que possédant une forte homologie structurale avec la VE-cadhérine, celle-ci possède une localisation subcellulaire originale pour une cadhérine classique puisqu'elle est localisée de manière diffuse au niveau de la membrane. Dans le développement vasculaire, elle pourrait ainsi permettre le recrutement des cellules murales par l'endothelium conduisant à la stabilisation du vaisseau. Mon travail de thèse a été d'analyser les propriétés différentielles de ces deux cadhérines dans la cellule endothéliale ainsi que le mécanisme d'exclusion jonctionelle de la N-cadhérine. Nous avons montré que la VE- et la N-cadhérine interagissent similairement à l'- et à la -caténine mais à l'inverse, p120 caténine lie préférentiellement la VE-cadhérine. Cette propriété confère à la VE-cadhérine la capacité d'exclure la N-cadhérine de la jonction interendothéliale. D'autre part, nous avons montré qu'une petite proportion de la VE-cadhérine est enchâssée dans des microdomaines riches en cholestérol : les radeaux lipidiques, à laquelle p120 est très fortement associée. Cette fraction pourrait représenter un pool de VE-cadhérine assurant la stabilité de la jonction et le maintien de la force cohésive entre cellules endothéliales. Nous avons également montré dans un modèle de différenciation cellulaire dérivé des cellules ES murines (embryonic stem cell), que l'expression de la VE-cadhérine était nécessaire à l'expression d'autres gènes endothéliaux : PECAM, Flk-1 et Tie-1. La VE-cadhérine exercerait un contrôle transcriptionel de l'expression de ces gènes mais le mécanisme exact de régulation n'a pas pu être décrypté. L'ensemble de ce travail permet donc de montrer un autre visage de la VE-cadhérine dans la biologie de l'endothelium qui serait de réguler des protéines-clé de l'endothelium.

La maladie rénale chronique (MRC) par ses conséquences organiques et psychologiques représente unenjeu majeur de santé publique. Sa physiopathologie reste mal connue, mais il est établi que toute atteinte rénale,quelle qu'en soit la cause, aboutit à une réduction du nombre de néphrons fonctionnels. Cette réductionnéphronique est responsable de processus adaptatifs complexes des néphrons sains restants pour maintenir unefonction rénale satisfaisante. Si la perte néphronique est suffisamment importante, le parenchyme rénal vas'altérer progressivement aboutissant au remplacement des néphrons sains par un tissu fibreux puis au déclin dela fonction rénale. Les mécanismes moléculaires impliqués, tant dans l'adaptation à la réduction néphronique,que dans la dégradation progressive du parenchyme rénal sont mal connus et les possibilités d'interventionsthérapeutiques limitées.La voie AKT/mTOR est une voie de signalisation intracellulaire ubiquitaire, très conservée, jouant unrôle central dans l'homéostasie cellulaire par sa fonction de régulation de la croissance, de l'apoptose et du cyclecellulaire. L'extraordinaire complexité de son mode de recrutement témoigne du rôle de carrefour de cette voie.Elle intègre des signaux multiples et très variés (facteurs de croissance, acides-aminés, niveau énergétiquecellulaire, disponibilité de l'oxygène) modulant l'anabolisme cellulaire. Notre compréhension du rôle de cettevoie dans la progression de la MRC est encore très limitée et les données sont peu nombreuses et controversées.Mon travail de thèse a consisté à évaluer, en utilisant un modèle expérimental de réduction néphroniquechez la souris, le rôle de la voie AKT/mTORC au cours de la progression des MRC.Nous résultats démontrent que AKT, et plus précisément AKT2, est une molécule essentielle àl'adaptation podocytaire aux contraintes imposées par la réduction néphronique. En appliquant plusieursmodèles de réduction néphronique à des souris génétiquement modifiées, nous avons pu établir la fonctioncruciale de cette isoforme. En effet, l'inactivation d'Akt2, soit systémique soit conditionnelle dans le podocyte,est responsable d'une hyporéactivité de la voie AKT podocytaire, d'un remodelage du cytosquelette, d'uneaugmentation de l'apoptose glomérulaire avec raréfaction podocytaire et de lésions de glomérulosclérose.Transposant nos données à la pathologie humaine, nous avons mis en évidence une activation podocytaired'AKT2 après transplantation rénale chez les patients présentant une altération importante de la fonction rénale.De façon marquante, la survenue d'une protéinurie en réponse à un traitement par sirolimus s'associait à uneperte de cette activation et à une augmentation de l'apoptose glomérulaire.Parallèlement, nous avons évalué le rôle de cette voie chez l'homme au cours d'une MRC trèsparticulière secondaire à la présence d'anticorps antiphospholipides. Cette néphropathie est caractérisée par laprésence de lésions vasculaires sévères prolifératives, hypertrophiques et progressivement obstructivesaboutissant à la destruction du parenchyme rénal. Jusqu'à maintenant, aucun lien formel n'avait été établi entre laprésence de ces anticorps et le développement des lésions vasculaires, et aucune thérapeutique n'était disponible.Nos résultats indiquent que ces anticorps sont directement pathogènes pour l'endothélium induisant l'activationde la voie AKT/mTORC. L'activation de cette voie stimule la prolifération des cellules endothéliales mais aussi ....

Trop souvent diagnostiqués à des stades tardifs du fait de leur quasi asymptomatie, les adénocarcinomes séreux ovariens posent un véritable problème de santé publique. Malgré les progrès récents de prise en charge chirurgicale, l'émergence d'une maladie résiduelle microscopique chimiorésistante impacte grandement le pronostic des patientes.Le microenvironnement tumoral est un acteur clé de la progression tumorale et de l'émergence de résistances aux traitements anticancéreux. Durant ces travaux de thèse, nous nous sommes intéressés à deux composants majeurs du stroma tumoral, d'une part les cellules souches mésenchymateuses, d'autre part les cellules endothéliales.Nous avons pu démontrer que les cellules souches mésenchymateuses participent à la progression tumorale et l'émergence de résistances. Enfin nous avons démontré que les cellules endothéliales, via la production de facteurs angiocrines, participent à la chimiorésistance des cellules tumorales ovariennes.Dans ce travail, nous avons pu définir de nouvelles cibles thérapeutiques mettant en jeu la relation entre les cellules tumorales ovariennes et l'hôte.

L’actine est impliquée dans de nombreuses fonctions cellulaires physiologiques et pathologiques. Au cours de ma thèse j'ai analysé le rôle de l'actine i) lors de l’invasion tumorale et ii) dans la formation des fenêtres des cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques. i) Les cellules tumorales forment des structures d’actine permettant la dégradation de la matrice extracellulaire (MEC) nommés invadosomes. Mes travaux ont permis de démontrer que la RhoGTPase Cdc42 régule la formation de la structure d’actine qu’est l’invadosome, tandis que la protéine d’échafaudage Tks5 est requise pour l’activité de dégradation aboutissant à un invadosome fonctionnel. Ces deux molécules constituent la signature moléculaire minimale des invadosomes. Nous avons établi que le collagène de type I qui est surexprimé dans le microenvironnement tumoral induit la formation d’invadosomes linéaires (Lis). Nous avons identifié le récepteur à domaine discoïdine 1 (DDR1) comme spécifiquement responsable de la formation des Lis. Son interaction avec le collagène fibrillaire permet le recrutement du facteur d’échange des RhoGTPases, Tuba et l’activation de la Cdc42 conduisant à la formation d’un Li. DDR1 est impliqué dans l’invasion tumorale et sa surexpression est de mauvais pronostic dans plusieurs cancers comme le poumon ou encore le sein. Le récepteur DDR1 est également impliqué dans la cohésion cellulaire au cours de la migration collective des cellules tumorales. Nous avons démontré que dans un contexte riche en collagène de type I, DDR1 a une double localisation et donc différents rôles associés dans la migration collective. D’une part un rôle de cohésion cellulaire et d’autre part un rôle dans la dégradation de la MEC. Nous tentons de démontrer que ces différentes fonctions impliquent différentes isoformes de DDR1. Nous souhaitons par la suite déterminer les mécanismes moléculaires qui régulent l’expression, la localisation et la signalisation associées aux différentes isoformes de DDR1. ii) Dans un contexte physiologique, les capillaires sanguins du foie présentent des pores transcellulaires ou fenêtres, qui permettent les échanges bidirectionnels entre le sang et les hépatocytes pour assurer la fonction de filtration de cet organe. Au cours du processus de fibrose ces fenêtres sont perdues, réduisant les échanges. Nous avons démontré le caractère réversible de la perte des fenêtres mais aussi que l’actine n’était pas impliquée dans la formation de ces structures. Nous avons développé une méthode de visualisation en microscopie haute résolution STED de ces structures, permettant pour la première fois une analyse sur cellule vivante. Par une approche de spectrométrie de masse couplée à notre nouvelle méthode d’observation en STED, nous voulons valider la co-localisation des fenêtres avec des marqueurs potentiels identifiés. / Actin is involved in many physiological and pathological cellular functions. In my thesis I analyzed the role of actin i) during tumor invasion and ii) in the formation of fenestrae in liver sinusoidal endothelial cells. i) Tumor cells form actin-based structures, invadosomes, involved in extracellular matrix (ECM) degradation. My work has demonstrated that the RhoGTPase Cdc42 regulates the formation of invadosomes, while the Tks5 scaffold protein is required for the matrix degradation activity. These two molecules form a minimum molecular signature for invadosomes. We found that type I collagen, which is overexpressed in the tumor microenvironment, induces the formation of linear invadosomes (Lis). We have identified the discoidin receptor 1 (DDR1) to be specifically responsible for Lis formation. Its interaction with the fibrillar collagen allows the recruitment of GEF Tuba and the activation of Cdc42 RhoGTPase leading to Li formation. DDR1 is implicated in tumor invasion and its overexpression is a poor prognosis in many cancers like lung or breast. The DDR1 receptor is also involved in cell cohesion in the collective migration of tumor cells. We have demonstrated that in a context rich in type I collagen, DDR1 has a dual location and therefore possesses different roles in the collective migration of tumor cells: a role in cell cohesion and a role in ECM degradation. We are analyzing the role of the different DDR1 isoforms in this process. We wish subsequently to determine the molecular mechanisms that regulate the expression, localization and signaling associated with these different isoforms. ii) In a physiological context, the liver capillaries have transcellular pores that allow bidirectional exchanges between the blood and the hepatocytes to ensure the proper filtering function of that organ. During the fibrosis process, these pores are lost thus decreasing the exchanges. We have demonstrated that the loss of these “fenestrae” is reversible and also that actin does not play a role in their formation. We have developed a novel method to analyze these structures in living cells using high resolution STED microscopy. Now, by using mass spectrometry approach coupled to our new observation methods in STED, we want to validate the fenestrae co-localisation with potential markers identified.

Le gène Egfl7 codant une protéine majoritairement sécrétée par les cellules endothéliales a été découvert au sein du laboratoire. Ce gène a la particularité d’héberger dans sa séquence intronique deux microARNs complémentaires nommés miR126-3p et miR-126-5p. Les microARNs sont de petites séquences de 20 à 25 nucléotides régulant l’expression de leurs cibles en se fixant sur leurs ARNm pour induire leur dégradation ou l’inhibition de leur traduction. L’expression endothéliale et les fonctions du microARN miR126-3p (microARN principal du duplex miR126-3p/126-5p) ont déjà été très largement abordées alors que celles de miR126-5p (microARN secondaire du duplex) restent inconnues. Les objectifs de notre étude ont donc été d’établir le patron d’expression de miR-126-5p lors du développement vasculaire et de caractériser ses fonctions dans les cellules endothéliales. Par hybridation in situ, miR-126-5p a été détecté dans les vaisseaux sanguins embryonnaires de souris principalement dans les cellules endothéliales. Cette spécificité endothéliale a été retrouvée dans différents organes tels que le cœur et les poumons et est maintenue in vitro. L’inhibition et la surexpression de miR-126-5p dans des cellules endothéliales veineuses (HUVEC) in vitro n’affectent pas les capacités de prolifération, de migration ou d’organisation en pseudocapillaires de ces cellules. En revanche, l’inhibition de miR-126-5p dans les HUVECs entraine une répression de l’adhérence des leucocytes à la surface d’un tapis de cellules endothéliales ainsi qu’une augmentation de la transmigration de monocytes à travers une monocouche endothéliale. A l’inverse, sa surexpression génère des phénotypes opposés. Des analyses in silico de recherche de cibles pour miR-126-5p en lien avec le recrutement leucocytaire ont permis d’identifier une protéine participant à la transmigration des leucocytes in vitro et in vivo nommée ALCAM. A l’aide de test de transactivation, nous avons pu démontrer que miR-126-5p était capable de se fixer au 3’UTR de l’ARNm d’ALCAM afin de réprimer l’expression de la protéine. De plus, l’augmentation de la transmigration induite par la chute d’expression de miR-126-5p dans les cellules endothéliales est inhibée suite au blocage direct de la protéine ALCAM montrant ainsi que l’effet répresseur de miR-126-5p sur ce mécanisme est établi via ALCAM. Une étude par microarray, réalisée sur des HUVECs où miR-126-5p a été inhibé, a permis d’identifier une seconde cible pour miR-126-5p nommée SetD5 pour laquelle aucune fonction n’est connue à ce jour. Des tests de transactivation ont permis de confirmer que SetD5 était une cible de miR-126-5p. De plus, l’effet de miR-126-5p sur l’adhérence des leucocytes aux cellules endothéliales est directement lié à la modulation d’expression de ce gène. Enfin, l’analyse de l’inhibition de miR-126-5p in vivo a permis de montrer que notre microARN d’intérêt contrôle effectivement les expressions d’ALCAM et de SetD5. Cependant, alors que miR-126-5p régule uniquement l’expression d’ALCAM dans les poumons, celle de SetD5 est sous le contrôle de miR-126-5p dans la rétine.Nos travaux ont donc permis de mettre en évidence l’expression endothéliale de miR-126-5p et d’identifier deux de ses cibles lui permettant de jouer un rôle dans le recrutement des leucocytes au niveau de l’endothélium. / The Egfl7 gene which was identified within the laboratory codes for a protein mainly secreted by endothelial cells. This gene harbors in its intronic sequence two complementary microRNAs named miR-126-3p and miR-126-5p. MicroRNAs are 20-25 nucleotides-long non coding RNAs which repress protein expression through binding to a complementary sequence of their target mRNAs, leading to mRNA degradation or translation inhibition. Endothelial expression and functions of miR-126-3p (The main miRNAs of the miR-126-3p/miR-126-5p duplex) was widely described while those of miR-126-5p remain unknown. The goal of our study was to establish the expression of miR-126-5p during the vascular development and to characterize its functions in endothelial cells. By in situ hybridization, miR-126-5p was detected in mouse embryonic vessels mainly in endothelial cells. This miR-126-5p endothelial specific expression was also found in different organs such as in the heart or lungs and is maintained in vitro. The inhibition and overexpression of miR-126-5p in vein endothelial cells (HUVECs) did not affect HUVECs proliferation, neither their migration nor their ability to form pseudocapillaries in vitro. On the other hand, miR-126-5p inhibition in HUVEC led to a repression of leukocyte adhesion onto endothelial cells as well as an increase of leukocyte transmigration across an endothelial cell monolayer. Interestingly, opposite phenotypes were observed after miR-126-5p overexpression. In silico analyses of miR-126-5p targets led to identify ALCAM as a potential mRNA transcript that could be regulated by miR-126-5p and which was already involved in leukocyte transmigration in vitro and in vivo. By transactivation assays, we showed that miR-126-5p was able to bind the 3’UTR of ALCAM mRNA and to repress ALCAM protein expression. Furthermore, endothelial cell treatment with an ALCAM blocking antibody abolished the effect of miR-126-5p inhibition on leukocyte transmigration indicating that miR-126-5p controls this process via ALCAM. A microarray analysis performed on HUVEC after miR-126-5p inhibition allowed the identification of another target for miR-126-5p named SetD5, a gene with unknown function. Transactivation assays confirmed that SetD5 is a target for miR126-5p. Furthermore, we showed that miR-126-5p controls leukocyte adhesion onto endothelial cells by regulating SetD5 expression. Finally, the inhibition of miR-126-5p in vivo demonstrated that miR-126-5p controls ALCAM and SetD5 expression in mouse. However, while miR-126-5p exclusively regulates ALCAM expression in lungs, SetD5 expression is controlled by miR-126-5p in the retina.In this study, we demonstrated that miR-126-5p is a functional microRNA expressed in endothelial cells. We identified two targets for this microRNA indicating that miR-126-5p participates in the control of leukocyte trafficking onto endothelial cells.

Le pancréas est une glande mixte à composantes endocrine et exocrine. Le tissu endocrine, essentiellement composé de cellules bêta productrices d’insuline, joue un rôle prépondérant dans le maintient de l’homéostasie glucidique. La perte qualitative ou quantitative des cellules bêta conduit au développement de pathologies caractérisées par une hyperglycémie chronique et connues sous le nom de diabète. Le développement de stratégies thérapeutiques innovantes, thérapie cellulaire ou médecine régénérative, pour guérir le diabète repose sur une connaissance précise des mécanismes développementaux impliqués dans la formation des cellules bêta. Ainsi, au delà de l’intérêt cognitif, il est primordial de comprendre au mieux les évènements cellulaires et moléculaires qui régissent l’organogénèse pancréatique pour offrir des thérapies alternatives. Le développement embryonnaire s’effectue dans un environnement où la pression partielle en oxygène (pO2) est faible. Par ailleurs, une étude menée au sein du laboratoire a montré que la pO2 influence la différenciation des cellules bêta pancréatique in vitro. En effet, lorsque des pancréas embryonnaires sont cultivés sur filtre en hypoxie (pO2=3%), le développement des cellules bêta est drastiquement diminué comparativement à une condition de 21% d’O2. Le facteur de transcription HIF-1 (Hypoxia Inducible Factor-1), composé d’une sous-unité alpha sensible au niveau d’oxygène et d’une sous-unité bêta constitutivement présente, permet à la cellule de s’adapter à un environnement pauvre en O2, notamment en favorisant la formation de nouveaux vaisseaux sanguins au cours d’un processus appelé angiogénèse. L’objectif de ma thèse était d’étudier le rôle de HIF-1alpha au cours du développement embryonnaire du pancréas in vivo. Pour cela, nous avons utilisé des lignées murines génétiquement modifiées permettant de stabiliser constitutivement la protéine HIF-1alpha dans l’épithélium pancréatique. En utilisant ce modèle murin, nous avons montré que la différenciation endocrine et le développement des cellules bêta est altéré dans les pancréas mutants comparativement aux contrôles. Par ailleurs, en utilisant une approche pharmacologique in vitro conduisant à l’ablation des cellules endothéliales du pancréas, nous avons pu restaurer une différenciation endocrine comparable aux contrôles. Ce travail a permis d’éclaircir le rôle de HIF-1 et de la vascularisation au cours du développement embryonnaire du pancréas. Nos résultats indiquent que ces paramètres doivent être pris en compte pour améliorer les protocoles actuels permettant de générer des cellules bêta in vitro. / The pancreas is an endoderm-derived organ which is composed by both an exocrine and an endocrine compartment. Within the endocrine tissu, insulin-producing beta-cells are essential for the regulation of glucose homeostasis. The loss of beta-cells can lead to pathologies such as diabetes. Currently, people suffuring from diabetes can be treated but not permanently cured. The development of innovating therapeutical approaches, like cellular therapy or regenerative medecine, relies on the precise knowledge of the mechanisms regulating the ontogenesis of pancreatic beta-cells. Different studies have linked proper embryonic development and low-oxygen tension (pO2). Specifically, when embryonic pancreases are cultured in vitro under a hypoxic condition (pO2=3%), the beta-cells development is impaired compared to a normoxic condition (pO2=21%). Different pathways are involved in the cell adaptation to hypoxia, such as the ubiquitous Hypoxia Inducible Factor 1-alpha (HIF-1alpha). The aim of my PhD project was to elucidate the role of HIF-1alpha during pancreatic development in vivo. To do so, we used genetically modified mice allowing the constitutive stabilization of HIF-1alpha in pancreatic epithelial cells. We have shown that HIF-1alpha stabilization leads to a reduction of endocrine differentiation and beta-cells development. Moreover, using a pharmacological approach in vitro consisting in deleting endothelial cells, we rescued the endocrine differentiation in the mutant pancreases. In conclusion, my data demonstrated the negative influence of both HIF-1 and endothelial cells on endocrine differentiation processes.

Au cours de l'obésité, le Tissu Adipeux blanc (TAB) est le siège d'un important remaniement de sa Matrice Extracellulaire avec des amas fibrotiques autour des adipocytes et des vaisseaux. Cette organisation caractéristique semble avoir une incidence dans la physiopathologie de l'obésité. Les composés spécifiques à la Membrane Basale ont été mis en évidence autour des adipocytes et des cellules endothéliales et leur expression est fortement induite dans l'adipocyte obèse. L'expression de COL4A1 est positivement corrélée à l'insulino-résistance de sujets présentant une obésité modérée. De plus, dans un autre groupe de sujets massivement obèses candidats à la chirugie bariatrique, la diminution de l'expression génique de COL4A1 est à relier avec l'amélioration de l'insulino-résistance après l'intervention. Enfin, nous observons que, dans le TAB, l'expression de COL4A1 est positivement associée à l'expression génique de deux facteurs de croissance pro-fibrotiques, le TGF 1 et le TGF 3, dans le TAB. La culture tridimensionnelle d'adipocytes ou de cellules endothéliales exposés à ces deux facteurs induit un phénotype fibro-inflammatoire dans ces types cellulaires. Néanmoins, le traitement par le TGF 1 ou TGF 3 induit uniquement dans les cellules endothéliales une sur-expression de COL4A1 et non dans les adipocytes.En conclusion, nos données proposent un nouvel acteur de la fibrose du TAB au cours de l'obésité, la Membrane Basale adipocytaire et vasculaire, participant ainsi à la dysfonction tissulaire et métabolique. / During obesity, White Adipose Tissue (WAT) undergoes an important remodeling of its Extracellular Matrixwith fibrotic depots around adipocytes and vessels. This typical organization seems to have an impact in the pathophysiology of obesity. Basement Membrane components were detected around adipocytes and endothelial cells and their expression were significantly increased in obese adipocytes. COL4A1 expression in WAT is positively correlated to insulin-resistance parameters in moderate obese subjects, and its reduction is associated to insulin-resistance improvement after gastric bypass in a group of morbidly obese subjects. Finally, we demonstrated a postive correlation between COL4A1 expression and two pro-fibrotic growth factor (TGF1 and TGF3) in obese WAT. In vitro treatment of isolated adipocytes and endothelial cells with these TGF isoforms induced inflammatory and fibrotic phenotype. However, TGF1 and TGF3 exposure only provoked COL4A1 over-expression in endothelial cells, and not in adipocytes. In conclusion, our work have highlighted a new actor in WAT fibrosis during obesity, adipocytes and endothelial cells Basement Membrane, participating in the pathological alterations of obese adipose tissue and metabolism.

No description available.

Neisseria meningitidis, ou méningocoque, est une bactérie responsable de méningites et de septicémies, dont la forme la plus grave, purpura fulminans, est souvent fatale. Cette bactérie, qui réside naturellement dans le rhinopharynx de l’Homme, est pathogène lorsqu’elle atteint la circulation sanguine et entre en contact avec les cellules endothéliales. L’établissement d’une interaction étroite entre le méningocoque et les cellules endothéliales est essentiel à la résistance des bactéries au flux sanguin et à la colonisation vasculaire. Cette interaction peut conduire à une désorganisation massive des endothéliums périphériques et cérébraux permettant la dissémination de la bactérie. Ces processus dépendent de la primo-interaction des pili de type IV du méningocoque avec le récepteur endothélial CD147 et de l’activation du récepteur β2-adrénergique (β2AR). L’activation de voies de signalisation en aval du β2AR dans les cellules hôtes permet l’adhérence efficace et intime des bactéries à la surface des cellules endothéliales. Toutefois, comment les récepteurs CD147 et β2AR coopèrent pour promouvoir une interaction initiale efficace et rapide n’était pas connu. Au cours de ma thèse, j’ai donc analysé les éventuelles interactions et liens fonctionnels existants entre les récepteurs CD147 et β2AR et suivi, à l’aide de nouvelles approches d’imagerie à haute résolution, leur organisation moléculaire aux sites de contact bactéries/cellule. Mes travaux ont permis de révéler l’existence d’une interaction fonctionnelle entre les récepteurs CD147 et β2AR, et d’identifier un nouveau partenaire cytosolique interagissant directement avec ces récepteurs, l’α-actinine4 (Actn4). L’expression de l’Actn4 est requise pour l’assemblage organisé de ces récepteurs en complexes multimoléculaires aux sites de contact bactéries/cellule endothéliale. Cette organisation est déterminante pour générer une force suffisante à l’interaction initiale du méningocoque aux cellules endothéliales, et promouvoir l’activation rapide des voies de signalisation nécessaires à la consolidation de cette interaction. L’infection des cellules endothéliales par le méningocoque s’accompagne de la désorganisation des jonctions intercellulaires et l’ouverture d’une voie paracellulaire favorisant la dissémination tissulaire des bactéries. Ces évènements dépendent de l’activation de la petite GTPase Cdc42 et, en aval, de la relocalisation du complexe de polarité Par3/Par6/aPKC au site d’adhérence bactérien. Ce complexe moléculaire très conservé est impliqué dans la mise en place de la polarité baso-apicale des cellules endothéliales. La perte de la polarité cellulaire constituant un élément déterminant de la perte de l’intégrité vasculaire, dans une seconde partie de ma thèse, j’ai donc entrepris une analyse des événements de signalisation précoces conduisant au remodelage de l’organisation apico-basale des cellules endothéliales par N. meningitidis. Mes travaux montrent que rapidement après adhésion aux cellules endothéliales, le méningocoque induit la ré-orientation de l’axe de polarité noyau-centrosome des cellules en direction des bactéries et mettant en jeu un mécanisme original indépendant de l’activation de Cdc42 par le β2AR. Le recrutement des ERM (Ezrine et Moesin) et la polymérisation d’actine corticale au site d’infection semblent constituer des facteurs clé de cette étape précoce de modification de la polarité endothéliale induite par le méningocoque. Ainsi, ces études ont permis une avancée majeure dans notre compréhension du mécanisme d’adhésion du méningocoque aux cellules endothéliales et des événements moléculaires précoces conduisant à l’altération de l’intégrité vasculaire, deux étapes clés au cœur de la pathogénèse des infections invasives à méningocoque. / Neisseria meningitidis or meningococcus is a commensal bacterium of the human nasopharynx responsible for septicemia and meningitis. Establishment of a close interaction between meningococcus and endothelial cells is an important step in meningococcal pathogenesis as it promotes bacterial resistance to blood flow and vascular colonization, leading to major endothelial dysfunctions and bacterial dissemination into perivascular tissues. This process depends on the interaction of meningococcal type IV pili with the endothelial receptor CD147 and the activation of the β2 adrenergic receptor (β2AR). Activation of a cellular response downstream of β2AR activation is important to allow the efficient adhesion of meningococci at the endothelial cell surface. However, how CD147 and the β2AR cooperate to promote a rapid and efficient initial adhesion remained to be explored. During my thesis, I have analyzed the interaction and the functional link between these two receptors and, using super resolution microscopy, I have investigated their molecular organization at sites of bacterial adhesion. My work revealed a functional interaction in cis between CD147 and the β2AR and binding of these receptors complexes to the molecular scaffold protein α-actinin 4 (Actn4). Actn4 expression is required for the organized assembly of these receptors in highly-ordered complexes at bacterial adhesion sites. This specific organization is decisive to provide a sufficient binding strength of meningococcal type IV pili with endothelial receptors and to promote a rapid activation of downstream signaling events in a short time frame. Endothelial cell infection by N. meningitidis is associated with the disruption of intercellular junctions and the opening of a paracellular route favoring bacterial dissemination into tissues. These events are dependent on Cdc42 activation and on the relocalization of the Par3/Par6/aPKC polarity complex at bacterial adhesion sites. This molecular complex is conserved and involved in baso-apical polarity establishment in endothelial cells. Since endothelial polarity is essential in maintaining junction integrity, in a second part of my thesis work I have analyzed the early signaling events triggered by meningococcal infection with a particular emphasis on endothelial cell polarity modifications. I observed that bacterial adhesion rapidly induced a re-orientation of the nucleus-centrosome axis toward bacterial adhesion sites. Unexpectedly, this re-orientation was independent of Cdc42 activation downstream of the β2AR. In place, the ERM proteins (Ezrin and Moesin), along with cortical actin polymerization seem to be key factors in this process. This work contributes to the understanding of the meningococcal adhesion mechanism to endothelial cells and the early molecular events leading to the loss of vascular integrity. These two key steps are very important in the meningococcal pathogenesis.