La maladie rénale chronique (MRC) par ses conséquences organiques et psychologiques représente unenjeu majeur de santé publique. Sa physiopathologie reste mal connue, mais il est établi que toute atteinte rénale,quelle qu'en soit la cause, aboutit à une réduction du nombre de néphrons fonctionnels. Cette réductionnéphronique est responsable de processus adaptatifs complexes des néphrons sains restants pour maintenir unefonction rénale satisfaisante. Si la perte néphronique est suffisamment importante, le parenchyme rénal vas'altérer progressivement aboutissant au remplacement des néphrons sains par un tissu fibreux puis au déclin dela fonction rénale. Les mécanismes moléculaires impliqués, tant dans l'adaptation à la réduction néphronique,que dans la dégradation progressive du parenchyme rénal sont mal connus et les possibilités d'interventionsthérapeutiques limitées.La voie AKT/mTOR est une voie de signalisation intracellulaire ubiquitaire, très conservée, jouant unrôle central dans l'homéostasie cellulaire par sa fonction de régulation de la croissance, de l'apoptose et du cyclecellulaire. L'extraordinaire complexité de son mode de recrutement témoigne du rôle de carrefour de cette voie.Elle intègre des signaux multiples et très variés (facteurs de croissance, acides-aminés, niveau énergétiquecellulaire, disponibilité de l'oxygène) modulant l'anabolisme cellulaire. Notre compréhension du rôle de cettevoie dans la progression de la MRC est encore très limitée et les données sont peu nombreuses et controversées.Mon travail de thèse a consisté à évaluer, en utilisant un modèle expérimental de réduction néphroniquechez la souris, le rôle de la voie AKT/mTORC au cours de la progression des MRC.Nous résultats démontrent que AKT, et plus précisément AKT2, est une molécule essentielle àl'adaptation podocytaire aux contraintes imposées par la réduction néphronique. En appliquant plusieursmodèles de réduction néphronique à des souris génétiquement modifiées, nous avons pu établir la fonctioncruciale de cette isoforme. En effet, l'inactivation d'Akt2, soit systémique soit conditionnelle dans le podocyte,est responsable d'une hyporéactivité de la voie AKT podocytaire, d'un remodelage du cytosquelette, d'uneaugmentation de l'apoptose glomérulaire avec raréfaction podocytaire et de lésions de glomérulosclérose.Transposant nos données à la pathologie humaine, nous avons mis en évidence une activation podocytaired'AKT2 après transplantation rénale chez les patients présentant une altération importante de la fonction rénale.De façon marquante, la survenue d'une protéinurie en réponse à un traitement par sirolimus s'associait à uneperte de cette activation et à une augmentation de l'apoptose glomérulaire.Parallèlement, nous avons évalué le rôle de cette voie chez l'homme au cours d'une MRC trèsparticulière secondaire à la présence d'anticorps antiphospholipides. Cette néphropathie est caractérisée par laprésence de lésions vasculaires sévères prolifératives, hypertrophiques et progressivement obstructivesaboutissant à la destruction du parenchyme rénal. Jusqu'à maintenant, aucun lien formel n'avait été établi entre laprésence de ces anticorps et le développement des lésions vasculaires, et aucune thérapeutique n'était disponible.Nos résultats indiquent que ces anticorps sont directement pathogènes pour l'endothélium induisant l'activationde la voie AKT/mTORC. L'activation de cette voie stimule la prolifération des cellules endothéliales mais aussi ....

Trop souvent diagnostiqués à des stades tardifs du fait de leur quasi asymptomatie, les adénocarcinomes séreux ovariens posent un véritable problème de santé publique. Malgré les progrès récents de prise en charge chirurgicale, l'émergence d'une maladie résiduelle microscopique chimiorésistante impacte grandement le pronostic des patientes.Le microenvironnement tumoral est un acteur clé de la progression tumorale et de l'émergence de résistances aux traitements anticancéreux. Durant ces travaux de thèse, nous nous sommes intéressés à deux composants majeurs du stroma tumoral, d'une part les cellules souches mésenchymateuses, d'autre part les cellules endothéliales.Nous avons pu démontrer que les cellules souches mésenchymateuses participent à la progression tumorale et l'émergence de résistances. Enfin nous avons démontré que les cellules endothéliales, via la production de facteurs angiocrines, participent à la chimiorésistance des cellules tumorales ovariennes.Dans ce travail, nous avons pu définir de nouvelles cibles thérapeutiques mettant en jeu la relation entre les cellules tumorales ovariennes et l'hôte.

L’actine est impliquée dans de nombreuses fonctions cellulaires physiologiques et pathologiques. Au cours de ma thèse j'ai analysé le rôle de l'actine i) lors de l’invasion tumorale et ii) dans la formation des fenêtres des cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques. i) Les cellules tumorales forment des structures d’actine permettant la dégradation de la matrice extracellulaire (MEC) nommés invadosomes. Mes travaux ont permis de démontrer que la RhoGTPase Cdc42 régule la formation de la structure d’actine qu’est l’invadosome, tandis que la protéine d’échafaudage Tks5 est requise pour l’activité de dégradation aboutissant à un invadosome fonctionnel. Ces deux molécules constituent la signature moléculaire minimale des invadosomes. Nous avons établi que le collagène de type I qui est surexprimé dans le microenvironnement tumoral induit la formation d’invadosomes linéaires (Lis). Nous avons identifié le récepteur à domaine discoïdine 1 (DDR1) comme spécifiquement responsable de la formation des Lis. Son interaction avec le collagène fibrillaire permet le recrutement du facteur d’échange des RhoGTPases, Tuba et l’activation de la Cdc42 conduisant à la formation d’un Li. DDR1 est impliqué dans l’invasion tumorale et sa surexpression est de mauvais pronostic dans plusieurs cancers comme le poumon ou encore le sein. Le récepteur DDR1 est également impliqué dans la cohésion cellulaire au cours de la migration collective des cellules tumorales. Nous avons démontré que dans un contexte riche en collagène de type I, DDR1 a une double localisation et donc différents rôles associés dans la migration collective. D’une part un rôle de cohésion cellulaire et d’autre part un rôle dans la dégradation de la MEC. Nous tentons de démontrer que ces différentes fonctions impliquent différentes isoformes de DDR1. Nous souhaitons par la suite déterminer les mécanismes moléculaires qui régulent l’expression, la localisation et la signalisation associées aux différentes isoformes de DDR1. ii) Dans un contexte physiologique, les capillaires sanguins du foie présentent des pores transcellulaires ou fenêtres, qui permettent les échanges bidirectionnels entre le sang et les hépatocytes pour assurer la fonction de filtration de cet organe. Au cours du processus de fibrose ces fenêtres sont perdues, réduisant les échanges. Nous avons démontré le caractère réversible de la perte des fenêtres mais aussi que l’actine n’était pas impliquée dans la formation de ces structures. Nous avons développé une méthode de visualisation en microscopie haute résolution STED de ces structures, permettant pour la première fois une analyse sur cellule vivante. Par une approche de spectrométrie de masse couplée à notre nouvelle méthode d’observation en STED, nous voulons valider la co-localisation des fenêtres avec des marqueurs potentiels identifiés. / Actin is involved in many physiological and pathological cellular functions. In my thesis I analyzed the role of actin i) during tumor invasion and ii) in the formation of fenestrae in liver sinusoidal endothelial cells. i) Tumor cells form actin-based structures, invadosomes, involved in extracellular matrix (ECM) degradation. My work has demonstrated that the RhoGTPase Cdc42 regulates the formation of invadosomes, while the Tks5 scaffold protein is required for the matrix degradation activity. These two molecules form a minimum molecular signature for invadosomes. We found that type I collagen, which is overexpressed in the tumor microenvironment, induces the formation of linear invadosomes (Lis). We have identified the discoidin receptor 1 (DDR1) to be specifically responsible for Lis formation. Its interaction with the fibrillar collagen allows the recruitment of GEF Tuba and the activation of Cdc42 RhoGTPase leading to Li formation. DDR1 is implicated in tumor invasion and its overexpression is a poor prognosis in many cancers like lung or breast. The DDR1 receptor is also involved in cell cohesion in the collective migration of tumor cells. We have demonstrated that in a context rich in type I collagen, DDR1 has a dual location and therefore possesses different roles in the collective migration of tumor cells: a role in cell cohesion and a role in ECM degradation. We are analyzing the role of the different DDR1 isoforms in this process. We wish subsequently to determine the molecular mechanisms that regulate the expression, localization and signaling associated with these different isoforms. ii) In a physiological context, the liver capillaries have transcellular pores that allow bidirectional exchanges between the blood and the hepatocytes to ensure the proper filtering function of that organ. During the fibrosis process, these pores are lost thus decreasing the exchanges. We have demonstrated that the loss of these “fenestrae” is reversible and also that actin does not play a role in their formation. We have developed a novel method to analyze these structures in living cells using high resolution STED microscopy. Now, by using mass spectrometry approach coupled to our new observation methods in STED, we want to validate the fenestrae co-localisation with potential markers identified.

Le gène Egfl7 codant une protéine majoritairement sécrétée par les cellules endothéliales a été découvert au sein du laboratoire. Ce gène a la particularité d’héberger dans sa séquence intronique deux microARNs complémentaires nommés miR126-3p et miR-126-5p. Les microARNs sont de petites séquences de 20 à 25 nucléotides régulant l’expression de leurs cibles en se fixant sur leurs ARNm pour induire leur dégradation ou l’inhibition de leur traduction. L’expression endothéliale et les fonctions du microARN miR126-3p (microARN principal du duplex miR126-3p/126-5p) ont déjà été très largement abordées alors que celles de miR126-5p (microARN secondaire du duplex) restent inconnues. Les objectifs de notre étude ont donc été d’établir le patron d’expression de miR-126-5p lors du développement vasculaire et de caractériser ses fonctions dans les cellules endothéliales. Par hybridation in situ, miR-126-5p a été détecté dans les vaisseaux sanguins embryonnaires de souris principalement dans les cellules endothéliales. Cette spécificité endothéliale a été retrouvée dans différents organes tels que le cœur et les poumons et est maintenue in vitro. L’inhibition et la surexpression de miR-126-5p dans des cellules endothéliales veineuses (HUVEC) in vitro n’affectent pas les capacités de prolifération, de migration ou d’organisation en pseudocapillaires de ces cellules. En revanche, l’inhibition de miR-126-5p dans les HUVECs entraine une répression de l’adhérence des leucocytes à la surface d’un tapis de cellules endothéliales ainsi qu’une augmentation de la transmigration de monocytes à travers une monocouche endothéliale. A l’inverse, sa surexpression génère des phénotypes opposés. Des analyses in silico de recherche de cibles pour miR-126-5p en lien avec le recrutement leucocytaire ont permis d’identifier une protéine participant à la transmigration des leucocytes in vitro et in vivo nommée ALCAM. A l’aide de test de transactivation, nous avons pu démontrer que miR-126-5p était capable de se fixer au 3’UTR de l’ARNm d’ALCAM afin de réprimer l’expression de la protéine. De plus, l’augmentation de la transmigration induite par la chute d’expression de miR-126-5p dans les cellules endothéliales est inhibée suite au blocage direct de la protéine ALCAM montrant ainsi que l’effet répresseur de miR-126-5p sur ce mécanisme est établi via ALCAM. Une étude par microarray, réalisée sur des HUVECs où miR-126-5p a été inhibé, a permis d’identifier une seconde cible pour miR-126-5p nommée SetD5 pour laquelle aucune fonction n’est connue à ce jour. Des tests de transactivation ont permis de confirmer que SetD5 était une cible de miR-126-5p. De plus, l’effet de miR-126-5p sur l’adhérence des leucocytes aux cellules endothéliales est directement lié à la modulation d’expression de ce gène. Enfin, l’analyse de l’inhibition de miR-126-5p in vivo a permis de montrer que notre microARN d’intérêt contrôle effectivement les expressions d’ALCAM et de SetD5. Cependant, alors que miR-126-5p régule uniquement l’expression d’ALCAM dans les poumons, celle de SetD5 est sous le contrôle de miR-126-5p dans la rétine.Nos travaux ont donc permis de mettre en évidence l’expression endothéliale de miR-126-5p et d’identifier deux de ses cibles lui permettant de jouer un rôle dans le recrutement des leucocytes au niveau de l’endothélium. / The Egfl7 gene which was identified within the laboratory codes for a protein mainly secreted by endothelial cells. This gene harbors in its intronic sequence two complementary microRNAs named miR-126-3p and miR-126-5p. MicroRNAs are 20-25 nucleotides-long non coding RNAs which repress protein expression through binding to a complementary sequence of their target mRNAs, leading to mRNA degradation or translation inhibition. Endothelial expression and functions of miR-126-3p (The main miRNAs of the miR-126-3p/miR-126-5p duplex) was widely described while those of miR-126-5p remain unknown. The goal of our study was to establish the expression of miR-126-5p during the vascular development and to characterize its functions in endothelial cells. By in situ hybridization, miR-126-5p was detected in mouse embryonic vessels mainly in endothelial cells. This miR-126-5p endothelial specific expression was also found in different organs such as in the heart or lungs and is maintained in vitro. The inhibition and overexpression of miR-126-5p in vein endothelial cells (HUVECs) did not affect HUVECs proliferation, neither their migration nor their ability to form pseudocapillaries in vitro. On the other hand, miR-126-5p inhibition in HUVEC led to a repression of leukocyte adhesion onto endothelial cells as well as an increase of leukocyte transmigration across an endothelial cell monolayer. Interestingly, opposite phenotypes were observed after miR-126-5p overexpression. In silico analyses of miR-126-5p targets led to identify ALCAM as a potential mRNA transcript that could be regulated by miR-126-5p and which was already involved in leukocyte transmigration in vitro and in vivo. By transactivation assays, we showed that miR-126-5p was able to bind the 3’UTR of ALCAM mRNA and to repress ALCAM protein expression. Furthermore, endothelial cell treatment with an ALCAM blocking antibody abolished the effect of miR-126-5p inhibition on leukocyte transmigration indicating that miR-126-5p controls this process via ALCAM. A microarray analysis performed on HUVEC after miR-126-5p inhibition allowed the identification of another target for miR-126-5p named SetD5, a gene with unknown function. Transactivation assays confirmed that SetD5 is a target for miR126-5p. Furthermore, we showed that miR-126-5p controls leukocyte adhesion onto endothelial cells by regulating SetD5 expression. Finally, the inhibition of miR-126-5p in vivo demonstrated that miR-126-5p controls ALCAM and SetD5 expression in mouse. However, while miR-126-5p exclusively regulates ALCAM expression in lungs, SetD5 expression is controlled by miR-126-5p in the retina.In this study, we demonstrated that miR-126-5p is a functional microRNA expressed in endothelial cells. We identified two targets for this microRNA indicating that miR-126-5p participates in the control of leukocyte trafficking onto endothelial cells.

Le pancréas est une glande mixte à composantes endocrine et exocrine. Le tissu endocrine, essentiellement composé de cellules bêta productrices d’insuline, joue un rôle prépondérant dans le maintient de l’homéostasie glucidique. La perte qualitative ou quantitative des cellules bêta conduit au développement de pathologies caractérisées par une hyperglycémie chronique et connues sous le nom de diabète. Le développement de stratégies thérapeutiques innovantes, thérapie cellulaire ou médecine régénérative, pour guérir le diabète repose sur une connaissance précise des mécanismes développementaux impliqués dans la formation des cellules bêta. Ainsi, au delà de l’intérêt cognitif, il est primordial de comprendre au mieux les évènements cellulaires et moléculaires qui régissent l’organogénèse pancréatique pour offrir des thérapies alternatives. Le développement embryonnaire s’effectue dans un environnement où la pression partielle en oxygène (pO2) est faible. Par ailleurs, une étude menée au sein du laboratoire a montré que la pO2 influence la différenciation des cellules bêta pancréatique in vitro. En effet, lorsque des pancréas embryonnaires sont cultivés sur filtre en hypoxie (pO2=3%), le développement des cellules bêta est drastiquement diminué comparativement à une condition de 21% d’O2. Le facteur de transcription HIF-1 (Hypoxia Inducible Factor-1), composé d’une sous-unité alpha sensible au niveau d’oxygène et d’une sous-unité bêta constitutivement présente, permet à la cellule de s’adapter à un environnement pauvre en O2, notamment en favorisant la formation de nouveaux vaisseaux sanguins au cours d’un processus appelé angiogénèse. L’objectif de ma thèse était d’étudier le rôle de HIF-1alpha au cours du développement embryonnaire du pancréas in vivo. Pour cela, nous avons utilisé des lignées murines génétiquement modifiées permettant de stabiliser constitutivement la protéine HIF-1alpha dans l’épithélium pancréatique. En utilisant ce modèle murin, nous avons montré que la différenciation endocrine et le développement des cellules bêta est altéré dans les pancréas mutants comparativement aux contrôles. Par ailleurs, en utilisant une approche pharmacologique in vitro conduisant à l’ablation des cellules endothéliales du pancréas, nous avons pu restaurer une différenciation endocrine comparable aux contrôles. Ce travail a permis d’éclaircir le rôle de HIF-1 et de la vascularisation au cours du développement embryonnaire du pancréas. Nos résultats indiquent que ces paramètres doivent être pris en compte pour améliorer les protocoles actuels permettant de générer des cellules bêta in vitro. / The pancreas is an endoderm-derived organ which is composed by both an exocrine and an endocrine compartment. Within the endocrine tissu, insulin-producing beta-cells are essential for the regulation of glucose homeostasis. The loss of beta-cells can lead to pathologies such as diabetes. Currently, people suffuring from diabetes can be treated but not permanently cured. The development of innovating therapeutical approaches, like cellular therapy or regenerative medecine, relies on the precise knowledge of the mechanisms regulating the ontogenesis of pancreatic beta-cells. Different studies have linked proper embryonic development and low-oxygen tension (pO2). Specifically, when embryonic pancreases are cultured in vitro under a hypoxic condition (pO2=3%), the beta-cells development is impaired compared to a normoxic condition (pO2=21%). Different pathways are involved in the cell adaptation to hypoxia, such as the ubiquitous Hypoxia Inducible Factor 1-alpha (HIF-1alpha). The aim of my PhD project was to elucidate the role of HIF-1alpha during pancreatic development in vivo. To do so, we used genetically modified mice allowing the constitutive stabilization of HIF-1alpha in pancreatic epithelial cells. We have shown that HIF-1alpha stabilization leads to a reduction of endocrine differentiation and beta-cells development. Moreover, using a pharmacological approach in vitro consisting in deleting endothelial cells, we rescued the endocrine differentiation in the mutant pancreases. In conclusion, my data demonstrated the negative influence of both HIF-1 and endothelial cells on endocrine differentiation processes.

Au cours de l'obésité, le Tissu Adipeux blanc (TAB) est le siège d'un important remaniement de sa Matrice Extracellulaire avec des amas fibrotiques autour des adipocytes et des vaisseaux. Cette organisation caractéristique semble avoir une incidence dans la physiopathologie de l'obésité. Les composés spécifiques à la Membrane Basale ont été mis en évidence autour des adipocytes et des cellules endothéliales et leur expression est fortement induite dans l'adipocyte obèse. L'expression de COL4A1 est positivement corrélée à l'insulino-résistance de sujets présentant une obésité modérée. De plus, dans un autre groupe de sujets massivement obèses candidats à la chirugie bariatrique, la diminution de l'expression génique de COL4A1 est à relier avec l'amélioration de l'insulino-résistance après l'intervention. Enfin, nous observons que, dans le TAB, l'expression de COL4A1 est positivement associée à l'expression génique de deux facteurs de croissance pro-fibrotiques, le TGF 1 et le TGF 3, dans le TAB. La culture tridimensionnelle d'adipocytes ou de cellules endothéliales exposés à ces deux facteurs induit un phénotype fibro-inflammatoire dans ces types cellulaires. Néanmoins, le traitement par le TGF 1 ou TGF 3 induit uniquement dans les cellules endothéliales une sur-expression de COL4A1 et non dans les adipocytes.En conclusion, nos données proposent un nouvel acteur de la fibrose du TAB au cours de l'obésité, la Membrane Basale adipocytaire et vasculaire, participant ainsi à la dysfonction tissulaire et métabolique. / During obesity, White Adipose Tissue (WAT) undergoes an important remodeling of its Extracellular Matrixwith fibrotic depots around adipocytes and vessels. This typical organization seems to have an impact in the pathophysiology of obesity. Basement Membrane components were detected around adipocytes and endothelial cells and their expression were significantly increased in obese adipocytes. COL4A1 expression in WAT is positively correlated to insulin-resistance parameters in moderate obese subjects, and its reduction is associated to insulin-resistance improvement after gastric bypass in a group of morbidly obese subjects. Finally, we demonstrated a postive correlation between COL4A1 expression and two pro-fibrotic growth factor (TGF1 and TGF3) in obese WAT. In vitro treatment of isolated adipocytes and endothelial cells with these TGF isoforms induced inflammatory and fibrotic phenotype. However, TGF1 and TGF3 exposure only provoked COL4A1 over-expression in endothelial cells, and not in adipocytes. In conclusion, our work have highlighted a new actor in WAT fibrosis during obesity, adipocytes and endothelial cells Basement Membrane, participating in the pathological alterations of obese adipose tissue and metabolism.

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Neisseria meningitidis, ou méningocoque, est une bactérie responsable de méningites et de septicémies, dont la forme la plus grave, purpura fulminans, est souvent fatale. Cette bactérie, qui réside naturellement dans le rhinopharynx de l’Homme, est pathogène lorsqu’elle atteint la circulation sanguine et entre en contact avec les cellules endothéliales. L’établissement d’une interaction étroite entre le méningocoque et les cellules endothéliales est essentiel à la résistance des bactéries au flux sanguin et à la colonisation vasculaire. Cette interaction peut conduire à une désorganisation massive des endothéliums périphériques et cérébraux permettant la dissémination de la bactérie. Ces processus dépendent de la primo-interaction des pili de type IV du méningocoque avec le récepteur endothélial CD147 et de l’activation du récepteur β2-adrénergique (β2AR). L’activation de voies de signalisation en aval du β2AR dans les cellules hôtes permet l’adhérence efficace et intime des bactéries à la surface des cellules endothéliales. Toutefois, comment les récepteurs CD147 et β2AR coopèrent pour promouvoir une interaction initiale efficace et rapide n’était pas connu. Au cours de ma thèse, j’ai donc analysé les éventuelles interactions et liens fonctionnels existants entre les récepteurs CD147 et β2AR et suivi, à l’aide de nouvelles approches d’imagerie à haute résolution, leur organisation moléculaire aux sites de contact bactéries/cellule. Mes travaux ont permis de révéler l’existence d’une interaction fonctionnelle entre les récepteurs CD147 et β2AR, et d’identifier un nouveau partenaire cytosolique interagissant directement avec ces récepteurs, l’α-actinine4 (Actn4). L’expression de l’Actn4 est requise pour l’assemblage organisé de ces récepteurs en complexes multimoléculaires aux sites de contact bactéries/cellule endothéliale. Cette organisation est déterminante pour générer une force suffisante à l’interaction initiale du méningocoque aux cellules endothéliales, et promouvoir l’activation rapide des voies de signalisation nécessaires à la consolidation de cette interaction. L’infection des cellules endothéliales par le méningocoque s’accompagne de la désorganisation des jonctions intercellulaires et l’ouverture d’une voie paracellulaire favorisant la dissémination tissulaire des bactéries. Ces évènements dépendent de l’activation de la petite GTPase Cdc42 et, en aval, de la relocalisation du complexe de polarité Par3/Par6/aPKC au site d’adhérence bactérien. Ce complexe moléculaire très conservé est impliqué dans la mise en place de la polarité baso-apicale des cellules endothéliales. La perte de la polarité cellulaire constituant un élément déterminant de la perte de l’intégrité vasculaire, dans une seconde partie de ma thèse, j’ai donc entrepris une analyse des événements de signalisation précoces conduisant au remodelage de l’organisation apico-basale des cellules endothéliales par N. meningitidis. Mes travaux montrent que rapidement après adhésion aux cellules endothéliales, le méningocoque induit la ré-orientation de l’axe de polarité noyau-centrosome des cellules en direction des bactéries et mettant en jeu un mécanisme original indépendant de l’activation de Cdc42 par le β2AR. Le recrutement des ERM (Ezrine et Moesin) et la polymérisation d’actine corticale au site d’infection semblent constituer des facteurs clé de cette étape précoce de modification de la polarité endothéliale induite par le méningocoque. Ainsi, ces études ont permis une avancée majeure dans notre compréhension du mécanisme d’adhésion du méningocoque aux cellules endothéliales et des événements moléculaires précoces conduisant à l’altération de l’intégrité vasculaire, deux étapes clés au cœur de la pathogénèse des infections invasives à méningocoque. / Neisseria meningitidis or meningococcus is a commensal bacterium of the human nasopharynx responsible for septicemia and meningitis. Establishment of a close interaction between meningococcus and endothelial cells is an important step in meningococcal pathogenesis as it promotes bacterial resistance to blood flow and vascular colonization, leading to major endothelial dysfunctions and bacterial dissemination into perivascular tissues. This process depends on the interaction of meningococcal type IV pili with the endothelial receptor CD147 and the activation of the β2 adrenergic receptor (β2AR). Activation of a cellular response downstream of β2AR activation is important to allow the efficient adhesion of meningococci at the endothelial cell surface. However, how CD147 and the β2AR cooperate to promote a rapid and efficient initial adhesion remained to be explored. During my thesis, I have analyzed the interaction and the functional link between these two receptors and, using super resolution microscopy, I have investigated their molecular organization at sites of bacterial adhesion. My work revealed a functional interaction in cis between CD147 and the β2AR and binding of these receptors complexes to the molecular scaffold protein α-actinin 4 (Actn4). Actn4 expression is required for the organized assembly of these receptors in highly-ordered complexes at bacterial adhesion sites. This specific organization is decisive to provide a sufficient binding strength of meningococcal type IV pili with endothelial receptors and to promote a rapid activation of downstream signaling events in a short time frame. Endothelial cell infection by N. meningitidis is associated with the disruption of intercellular junctions and the opening of a paracellular route favoring bacterial dissemination into tissues. These events are dependent on Cdc42 activation and on the relocalization of the Par3/Par6/aPKC polarity complex at bacterial adhesion sites. This molecular complex is conserved and involved in baso-apical polarity establishment in endothelial cells. Since endothelial polarity is essential in maintaining junction integrity, in a second part of my thesis work I have analyzed the early signaling events triggered by meningococcal infection with a particular emphasis on endothelial cell polarity modifications. I observed that bacterial adhesion rapidly induced a re-orientation of the nucleus-centrosome axis toward bacterial adhesion sites. Unexpectedly, this re-orientation was independent of Cdc42 activation downstream of the β2AR. In place, the ERM proteins (Ezrin and Moesin), along with cortical actin polymerization seem to be key factors in this process. This work contributes to the understanding of the meningococcal adhesion mechanism to endothelial cells and the early molecular events leading to the loss of vascular integrity. These two key steps are very important in the meningococcal pathogenesis.

La forme non musculaire de la kinase de la chaine légère de la myosine (MLCKnm) est une kinase principalement exprimée par les cellules endothéliales dont le rôle principal est de phosphoryler la chaine légère de myosine. Cette phosphorylation modifie la conformation des têtes de myosine, augmente l’interaction actine/myosine, et induit une rétraction des cellules endothéliales. Ce processus augmente la perméabilité de la barrière endothéliale. L’activation de MLCKnm permet l’infiltration de cellules inflammatoires en réponse à certains stimuli dont le lipopolysaccharide (LPS) bactérien. Dans ce modèle expérimental de sepsis, la déficience de MLCKnm dans un modèle murin protège les souris injectées avec du LPS, associée à une prévention des stress oxydant et nitrosant ainsi que de l’activation de voies de signalisation inflammatoire. Cependant les mécanismes moléculaires mis en jeu ne sont pas totalement connus. Dans le contexte inflammatoire, le syndrome d’apnées/hypopnées obstructives du sommeil, caractérisé par une obstruction des voies aériennes lors du sommeil menant à une hypoxie intermittente (HI), partage certaines caractéristiques dans l’activation inflammatoire observée lors du sepsis. L’HI modifie le métabolisme des cellules endothéliales en diminuant la biodisponibilité du monoxyde d’azote, augmentant le stress oxydant ainsi que la production de certains facteurs inflammatoires. A long terme, une réponse inflammatoire systémique est observée augmentant les risques d’athérosclérose. L’objectif de ce travail est d’étudier l’implication de MLCKnm dans l’inflammation vasculaire dans deux modèles physiopathologiques, induits par le LPS et l’HI. / Non muscular myosin light chain kinase (nmMLCK) is aprotein mainly expressed by endothelial cells whose roleis to phosphorylate myosin light chain. This phosphorylation modifies the conformation of myosin heads, increasing actin/myosin interaction, and inducing endothelial cells retraction. This process increases endothelial barrier permeability. The activation of nmMLCK increases inflammatory cell infiltration in response to several stimuli such as the bacterial lipopolysaccharide (LPS). In this experimental model of sepsis, nmMLCK deficiency in a murine model protects mice injected with LPS, associated with oxidative and nitrative stresses prevention as well as inflammatory pathway inhibition. However, molecular mechanisms are not fully known. In this inflammatory context, obstructive sleep apnea hypopnea syndrome, characterized by obstruction of upper airway during sleep leading to intermittent hypoxia (IH), share several characteristics in inflammatory activation observed during sepsis. IH modifies the metabolism of endothelial cells decreasing nitric oxide bioavailability, increasing oxidative stress aswell as inflammatory mediators. Long-term, systemic inflammatory response is observed increasing atherosclerosis risk. The objective of this work is to study the implication of nmMLCK in vascular inflammation in two pathophysiological models induced by LPS and IH.

Le système lymphatique joue un rôle clé dans le transport du cholestérol hors de la paroi artérielle et une dysfonction lymphatique précède l'apparition de l'athérosclérose. Cette dysfonction est associée à une diminution de l’expression du récepteur des lipoprotéines de faible densité (LDLR) et est à priori indépendante des taux de cholestérol circulant. Il a été démontré que les souris dépourvues de la proprotéine subtilisine/kexine de type 9 (PCSK9), une proprotéine qui mène à la dégradation du LDLR, ont une fonction lymphatique améliorée, tandis que les souris dépourvues de LDLR développent une dysfonction lymphatique. Nous visons maintenant à mieux comprendre les mécanismes par lesquels la présence de PCSK9 dans la lymphe ou la modulation du LDLR sur les cellules endothéliales lymphatiques (CEL) affecte la fonction lymphatique. Les CEL sont incubées avec du PCSK9 ou traitées avec un ARN inhibant spécifiquement l’expression du LDLR afin d’évaluer comment la présence de PCSK9 ou la modulation du LDLR affecte l'intégrité des CEL. Nos résultats démontrent que le PCSK9 n’induit pas la sécrétion de cytokines inflammatoires et n'affecte pas l'expression des marqueurs lymphatiques. L’inhibition de l’expression du LDLR entraîne une diminution des marqueurs lymphatiques membranaires endothéliaux. La diminution du LDLR a aussi entrainé une diminution des taux de certains lipides intracellulaires et en particulier des phospholipides, des sphingolipides et des triglycérides. Ces résultats suggèrent qu'une perte du LDLR, mais pas la présence de PCSK9 en circulation, pourrait induire à une altération de l'endothélium lymphatique causée par une diminution de l’expression de protéines membranaires essentielles au bon transport de la lymphe. / The lymphatic system plays a key role in the removal of cholesterol from the artery wall and lymphatic dysfunction is known to occur prior to the onset of atherosclerosis. This dysfunction is associated with reduced expression of the low-density-lipoprotein receptor (LDLR) and is first independent of circulating cholesterol levels. It has been shown that mice lacking proprotein subtilisin/kexin type 9 (PCSK9), a proprotein that degrades LDLR, have improved lymphatic function while mice lacking LDLR had a lymphatic dysfunction. We now aim to better understand the mechanisms by which the presence of PCSK9 in lymph or the modulation of LDLR on lymphatic endothelial cells (LECs) affects lymphatic function. Incubation of LECs with PCSK9 and specific targeting of LDLR expression with silencing RNAs were used to further evaluate how PCSK9 or modulation of LDLR affect the metabolism and integrity of LECs. Our results demonstrate that PCSK9 does not induce the secretion of inflammatory cytokines and does not affect the expression of lymphatic markers. LDLR silencing RNA leads to a decrease of membrane-bound lymphatic endothelial cell markers. A decrease in LDLR expression also led to a decrease in the content of some intracellular lipids and particularly phospholipids, sphingolipids and triglycerides. These results suggest that loss of LDLR expression, but not circulating PCSK9, could lead to alterations in the lymphatic endothelium caused by loss of membrane integrity which could in turn affect lymph transport.