Les anticorps (Ac) marqués à l'aide de phthalocyanines (Pc) ont un grand potentiel d'applications pour des essais d'immunofluorescence tout comme pour la thérapie photodynamique (PDT). La PDT est une forme relativement nouvelle de traitement du cancer ou d'autres maladies bénignes tel le psoriasis. Cette technique implique l'administration et l'activation par la lumière d'un photosensibilisateur localisé préférentiellement au niveau des cellules cancéreuses ou en croissance intense. La plupart des photosensibilisateurs utilisés pour la PDT sont de type porphyrine tels les Pcs. Dans cette étude, nous utilisons différentes phthalocyanines hautement solubles dans l'eau. Notre étude est basée sur l'utilisation d'anticorps monoclonaux comme vecteur des Pcs et comporte deux volets distincts. Tout d'abord l'utilisation des Pcs comme fluorochrome et finalement l'utilisation des complexes OKT3-AlPcS[indice inférieur 3]A[indice inférieur 1] dans l'amélioration de la PDT. Les Pcs sont liés de façon covalente aux Ac monoclonaux via une chaîne carboxy activée du Pc par la méthode de carbodiimide/N-hydroxysulfosuccinimide. Le complexe OKT3-AlPcS[indice inférieur 3]A[indice inférieur 1] lié à l'antigène de la surface cellulaire des cellules Jurkat CD3+ est visualisé par un trieur en cryométrie de flux (FACSCAN) et la phototoxicité in vitro est déterminée par un essai colorimétrique (test MTT). Nous avons donc produit un Ac de très bonne pureté et confirmé par cryométrie de flux la conservation de l'activité et de la spécificité de la liaison de l'Ac pour le récepteur après liaison covalente avec le Pc. Nous sommes ainsi les premiers à proposer l'utilisation des Pcs comme fluorochrome. Nous avons de plus vérifié la cytotoxicité médiée par le complexe qui s'est avérée non spécifique au clone cellulaire exprimant le récepteur CD3 reconnu par l'Ac. Nous proposons deux mécanismes de liaison du complexe OKT3-AlPcS[indice inférieur 3]A[indice inférieur 1] au niveau des cellules."--Résumé abrégé par UMI.

Pour les limnologistes étudiant les écosystèmes nordiques, les premiers indicateurs des changements climatiques apparaissent au bas de la chaine trophique : notamment dans les populations phytoplanctoniques. Une des techniques fréquemment utilisées pour caractériser cette frange du microbiome aquatique est la cytométrie en flux, une approche qui permet de caractériser individuellement la réponse optique, en fluorescence ou en diffusion, des cellules dans un échantillon. Malheureusement, ces instruments sont généralement très mal adaptés aux conditions que l'on peut retrouver en régions éloignées, notamment en raison de leur volume, leur poids et la sensibilité de leur alignement optique. De ce fait, les échantillons doivent généralement être préservés à −80°C puis être analysés au retour dans les laboratoires dans le sud. Ainsi, nous avons proposé de développer un cytomètre en flux portable optimisé pour la mesure optique de la fluorescence des pigments photosynthétiques des phytoplanctons et des cyanobactéries dans la gamme de taille de 0,2 à 2,0 µm (pico). Pour ce faire, un dispositif miniaturisé incorporant les structures microfluidiques nécessaires à la focalisation hydrodynamique des cellules ainsi que des fibres optiques permettant d'acheminer la lumière d'excitation et d'extraire la fluorescence avec un alignement robuste a été développé. Avec ce dispositif, un coefficient de variation de 9,5 % a été obtenu pour des particules de 2,0 µm de diamètre. Ensuite, un système intégrant ce dispositif dans un format portable a été développé. Ce système permet pour l'instant la mesure en laboratoire sur trois canaux, soit en diffusion à 633 nm et en fluorescence de la phycocyanine et de la chlorophylle-a, respectivement à 648±5 et 685±10 nm. Finalement, le dispositif microfluidique et le système ont été utilisés conjointement pour caractériser des échantillons de cultures de picophytoplanctons. Il a été possible de distinguer deux souches, une culture de picoeucaryotes (prasinophyceae RCC2335 ) et de picocyanobactéries CASES 2002 ) avec une efficacité de 91,3 %.

Dans les troupeaux laitiers, le succès de l'insémination artificielle dépend, en grande partie, de la qualité de la semence. D est important de disposer de techniques analytiques fiables permettant d'évaluer la qualité de la semence. Actuellement, aucun paramètre pris isolément n'est corrélé de façon satisfaisante à la fertilité. L'évaluation multiparamétrique de la semence est une option intéressante pour améliorer l'efficacité des tests de fertilité. Ce mémoire porte sur la caractérisation, via la cytometric en flux, des spermatozoïdes bovins cryopréservés. Différents paramètres ont été étudiés tels que la viabilité, l'activité mitochondriale, l'intégrité de la membrane acrosomale, le pH intracellulaire, le Ca2+ intracellulaire et celui emmagasiné dans la cellule. Ces paramètres ont été évalués postdécongélation et suite à cinq heures d'incubation en présence ou non d'héparine comme inducteur de la capacitation. Pour chacune des conditions, on a étudié les effets et les interactions de chacun des paramètres et leur relation avec la fertilité in vivo.

À ce jour, quelques biocapteurs ont été proposés pour mesurer rapidement et facilement les caractéristiques et les propriétés des microrganismes individuels membres d'une population hétérogène, mais aucune de ces approches ne s'est avérée être adéquate pour effectuer des mesures directement sur le terrain. Les biocapteurs pour les organismes microscopiques nécessitent généralement une sensibilité ou une spécificité extrême, qui sont difficiles à combiner avec un dispositif général portatif. Cette étude propose un dispositif portatif basé sur la cytométrie de flux d'impédance qui peut détecter et quantifier le diamètre de microbilles de tailles supérieure à 50 µm directement sur le terrain, tout en présentant un faible coût, une taille réduite, une basse consommation de puissance, et une simplicité de conception et d'opération qui maximise le potentiel de l'impression 3D et de la fabrication industrielle de circuits imprimés. Un exemple est offert afin de démontrer les capacités du capteurs pour de larges échantillons, avec un jeu de données contenant 2380 microbilles détectées de tailles entre 50 µm et 90 µm. / To this day, a couple of biosensors have been proposed to quickly and easily measure the features and properties of individual microorganisms member of an heterogeneous population, but none of these approaches were adequate candidates to perform measurements directly in the field. Biosensors for micron-scale organisms generally require extreme sensitivity or specificity, which are difficult to combine with a portable general device. This study proposes a portable device based on Impedance Flow-Cytometry that can detect and quantify directly in the fields the size and velocity of microbeads of size bigger than 50 µm, while boasting a low cost, low size, low power, and simplicity of design and operation utilizing the potential of 3D-printing and industrial PCB fabrication. An example is provided for a Big Data application from a sampled dataset containing 2380 successfully detected microbeads of sizes between 50 µm and 90 µm.

Le glioblastome multiforme (GBM) est l'une des tumeurs des plus létales qui soient. En dépit du traitement optimal actuellement disponible, la survie médiane des patients atteints d'un GBM n'atteint que 14,6 mois et n'a pu être améliorée de façon significative au cours des dernières décennies. La barrière hématoencéphalique endigue l'entrée de la majorité des xénobiotiques au système nerveux central et handicape sérieusement l'efficacité de la chimiothérapie. Une panoplie de stratagèmes fut développée afin de contourner cet obstacle majeur et l'emploi de liposomes comme véhicules recèle un grand potentiel. Nous avons donc entrepris l'élaboration d'une formulation liposomale dédiée à cette fin. Une formulation de base, inspirée de la littérature, a d'abord été modifiée de façon à produire plusieurs formulations dérivées. Le criblage de ces dernières a permis d'identifier une formulation candidate ainsi que des propriétés favorables à la lipofection des lignées cellulaires gliales F98 et U-118 MG. L'internalisation cellulaire des liposomes et la libération cytosolique de leur chargement hydrophile ont été évaluées quantitativement en cytométrie de flux. La formulation cationique, sensible au pH et dépourvue de polyéthylène glycol (PEG) s'est avérée la plus performante. Chez les deux lignées cellulaires, les liposomes de cette formulation vedette ont accédé au milieu intracellulaire entre 4 et 6 h, et y ont libéré leur cargaison sur plus de 24 h. Le balayage de cellules F98 et U-118 MG lipofectées en microscopie confocale a confirmé la libération intracellulaire du contenu des liposomes à 6 h, et a dévoilé un patron d'internalisation typique à l'endocytose. Enfin, cette formulation liposomale vedette s'est avérée très peu cytotoxique et aucun effet cytostatique n'a été remarqué chez ces deux lignées. La performance inférieure de la formulation de base et des autres dérivés indique qu'une réduction de la fluidité membranaire, l'inclusion de polymères PEG ainsi que l'absence combinée d'une charge cationique et de la sensibilité au pH ont des conséquences délétères sur la capacité de lipofection des liposomes. Ces résultats soulignent avec emphase l'importance d'adapter la composition lipidique des liposomes au type cellulaire ciblé et corroborent le potentiel des liposomes cationiques et sensibles au pH pour l'acheminement intracellulaire de xénobiotiques. Des études in vivo permettront d'établir le potentiel de la formulation liposomale vedette dans la thérapie des GBM.

Le contrôle de la qualité microbiologique de l’eau constitue une problématique majeure en termes sanitaire et économique. L’efficacité des traitements appliqués est actuellement vérifiée par des méthodes standards basées sur la mise en culture des microorganismes. Cependant, leur mise en œuvre ne permet d’obtenir des résultats ne présentant qu’une vision partielle de la population microbienne présente dans un échantillon et ce dans un délai qui n’est pas compatible avec le niveau de réactivité requis dans le domaine de la gestion de l’eau.Les présents travaux visaient à démontrer que l’application de la cytométrie en flux pour le suivi microbiologique au sein de filières de production d’eau potable et de circuits de tours aéroréfrigérantes représente une approche alternative aux méthodes réglementaires et classiques utilisées dans ce domaine. Une attention particulière a été portée sur le fait d’être en mesure de quantifier les cellules totales et viables et d’être capable d’identifier l’impact de différents traitements chimiques et/ou physiques (ozone, UV, biocides oxydants) au niveau de la cellule microbienne. La démarche de calibration et l’utilisation conjointe de différents marqueurs fluorescents incluant le SYBR Green II, l’iodure de propidium et le Chemchrome V6 a permis d’atteindre ce double objectif. Par ailleurs, 3 systèmes de cytométrie en flux différents ont été utilisés selon les études, comprenant le FACSCaliburTM, le FACSCantoTM et l’ACCURITM C6.Au regard des résultats obtenus, il apparait que la cytométrie en flux représenterait un atout dans le domaine du diagnostic rapide d’installations de par sa simplicité, son délai de résultat court (1 heure) et le niveau d’information apporté sur la population microbienne (impact sur la membrane, le matériel génétique ou le métabolisme). / The water microbiological quality control is a major issue in health and economic terms. The effectiveness of treatments applied is currently tested using culture-based standard methods. However, their application leads to a partial view of the microbial population present in a sample and within a period that is not compatible with the required responsiveness concerning water management.The present work aims to demonstrate that the application of flow cytometry for microbiological monitoring of drinking water treatment plants and cooling tower circuits represents an alternative approach to regulatory and conventional methods used in this field. Particular attention was paid to being able to quantify total and viable cells and be able to identify the impact of different chemical and/or physical treatment (ozone, UV, oxidizing biocides) on a microbial cell. The calibration process and the joint use of various fluorescent dyes including SYBR Green II, propidium iodide and ChemChrome V6 have achieved this double objective. Furthermore, three different flow cytometric systems have been used according to the studies comprising the FACSCaliburTM, FACSCantoTM and ACCURITM C6.Given the results, flow cytometry appears as an asset in the field of rapid diagnostic for treatment efficiency due to its ease of use, short time to result (1 hour) and the information provided related to the microbial population (impact on membrane, genetic material or metabolism).

Thèse ou mémoire avec insertion d'articles. / Le polyéthylène glycol (PEG) est un polymère reconnu comme généralement sécuritaire (GRAS) et son utilisation est très répandue dans plusieurs domaines, dont celui de la pharmaceutique. Ce polymère peut être conjugué à des protéines ou des vecteurs pharmaceutiques transportant des médicaments afin de prolonger le temps de circulation dans l'organisme. Bien que le PEG ait été considéré comme non immunogène, des études récentes montrent qu'environ 20 à 70 % de la population possèdent des anticorps capables de reconnaitre le polymère. Par un effet neutralisant, ces anticorps anti-PEG pourraient réduire l'efficacité et le temps de circulation de certains médicaments PEGylées. Ces travaux s'intéressent à comprendre les mécanismes derrière la réponse immunitaire anti-PEG des vecteurs pharmaceutiques et plus particulièrement des nanoparticules de polymère composé de PLGA-PEG. Notre hypothèse est que ces nanoparticules de polymère causent la production d'anticorps anti-PEG initier à l'aide de la cascade du complément. Lors de ces travaux, des anticorps anti-PEG étaient mesurés après sept jours, peu importe la voie d'administration des nanoparticules. L'isotype des anticorps dirigés contre le PEG mesuré est majoritairement des IgM. Les anticorps anti-PEG en circulation réduisent le temps de circulation de différentes architectures PEGylées, dont les nanoparticules et les liposomes. La présence des anticorps IgM anti-PEG altère les protéines retrouvées à la surface des nanoparticules. Des souris splénectomisées ont été utilisées dans plusieurs expériences afin d'investiguer le rôle de la rate dans la production des anticorps anti-PEG après l'administration de nanoparticules. Chez les souris qui ne possédaient pas de rate, la production des anticorps anti-PEG était abrogée lorsque les nanoparticules étaient administrées par voie intraveineuse. Par voie d'injection sous-cutanée, une petite quantité d'anticorps anti-PEG était mesurée après sept jours dans le plasma des souris splénectomisées. Ensuite, deux modèles de souris avec une cascade du complément abrogé (CVF) ou absence (C3[exposant -/-]) ont été utilisés pour investiguer le rôle de la cascade du complément sur la production des anticorps anti-PEG. La cascade du complément semble impliquée dans la production des anticorps anti-PEG lorsque les nanoparticules sont administrées par voie intraveineuse. Lors d'une injection sous-cutanée des nanoparticules, la concentration IgM anti-PEG mesurée après 7 jours est similaire entre le groupe témoin et le groupe ne possédant pas de cascade du complément active. Finalement, des études en cytométrie en Flux avec des nanoparticules fluorescente administrée à des souris avec et sans complément nous ont permis d'identifier l'importance des protéines du complément sur l'interaction entre les cellules immunitaires et les nanoparticules. Les protéines du complément à la surface des nanoparticules semblent favoriser leur interaction avec les lymphocytes B splénique. Les protéines du complément ne semblent pas changer l'interaction des nanoparticules avec les cellules B des ganglions lymphatiques après une administration sous-cutanée. Ces résultats suggèrent que le différent mécanisme est impliqué lors de la production des anticorps anti-PEG, selon la route d'administration des nanoparticules. Des études supplémentaires sont requises pour comprendre les effets de ces anticorps anti-PEG en clinique. / Polyethylene glycol (PEG) is a polymer recognized as generally safe (GRAS) and its use is widespread in several fields. This polymer can be conjugated to proteins or pharmaceutical carriers carrying drugs to prolong circulation time in the body. Although PEG has been considered as non-immunogenic, recent studies show that approximately 20-70% of the population have antibodies that can recognize the polymer. Through a neutralizing effect, these anti-PEG antibodies could reduce the effectiveness and circulation time of certain PEGylated drugs. This work focuses on understanding the mechanisms behind the anti-PEG immune response of pharmaceutical vectors and more particularly of polymer nanoparticles composed of PLGA-PEG. Our hypothesis is that these polymer nanoparticles cause the production of anti-PEG antibodies to initiate with the help of the complement cascade. During this work, anti-PEG antibodies were measured after 7 days, regardless of the route of administration of the nanoparticles. The isotype of the antibodies directed against the PEG was IgM. Anti-PEG antibodies in circulation reduce the circulation time of different PEGylated architectures including nanoparticles and liposomes. The presence of anti-PEG IgM antibodies alters the proteins found on the surface of the nanoparticles. In addition, anti-PEG antibodies promote the activation of the complement cascade which helps eliminate subsequent doses of nanoparticles. Splenectomized mice have been used in several experiments to investigate the role of the spleen in the production of anti-PEG antibodies after the administration of nanoparticles. In mice without a spleen, the production of anti-PEG antibodies was abrogated when the nanoparticles were administered intravenously. By subcutaneous injection, a small quantity of anti-PEG antibodies were measured after seven days in the plasma of splenectomized mice. Two mouse models with an abrogated complement cascade (CVF) or absence (C3[superscript -/-]) were used to investigate the role of the complement cascade on the production of anti-PEG antibodies. The complement cascade seems to be involved in the production of anti-PEG antibodies when the nanoparticles are administered intravenously. During a subcutaneous injection of the nanoparticles, the anti-PEG IgM concentration measured after 7 days is similar between the control group and the group without an active complement cascade. Finally, Flow cytometry studies with fluorescent nanoparticles administered to mice with and without complement allowed us to identify the importance of complement proteins on the interaction between immune cells and nanoparticles. Complement proteins on the surface of the nanoparticles appear to promote their interaction with splenic B lymphocytes. The complement deposited on the nanoparticles does not appear to direct their interaction with the B cells of the lymph nodes after subcutaneous administration. These results suggest that different mechanisms are involved in the production of anti-PEG antibodies, depending on the route of administration of the nanoparticles. Further studies are required to understand the effects of these anti-PEG antibodies in the clinic.

Les effluents industriels, agricoles et urbains, chargés en polluants divers, soumettent les écosystèmes marins côtiers à un risque écotoxicologique chronique. Depuis une vingtaine d'années, les effets toxiques des polluants sur le système immunitaire ont été étudiés chez tous les groupes écologiques, notamment chez les bivalves pour caractériser ce risque dans les écosystèmes aquatiques. Pour définir un cadre opérationnel de ces outils immunotoxicologiques, il a fallu d'abord étudier plusieurs questions méthodologiques. Ensuite, il convenait d'étudier l'impact des facteurs endogènes et environnementaux naturels sur le signal immunotoxique généré par un polluant. Dans le cadre d'une collaboration franco-québécoise, un suivi bisannuel, en France (Rade de Brest), chez la moule bleue, Mytilus edulis, et chez l'huître creuse, Crassostrea gigas, a permis de mettre en évidence le rôle critique du sexe et du cycle reproducteur sur les variations saisonnières des paramètres immunitaires, au détriment des paramètres naturels de la colonne d'eau. En parallèle, des séries d'expositions « in tubo » de moules bleues, au Québec, à deux saisons différentes a également mis en évidence le rôle critique du sexe et du cycle reproducteur dans la mesure du signal immunotoxique des xénobiotiques, mais surtout dans la sensibilité immunotoxique. En conclusion, cette recherche a permis de créer un cadre opérationnel d'utilisation des biomarqueurs immunotoxicologiques, pour l'évaluation du risque chimique dans les milieux marins côtiers. Mais ils ont également démontré l'importance capitale des facteurs confondants étudiés pour évaluer, au plus juste, le danger des substances chimiques.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

La famille des facteurs de transcription lkaros, est composée des protéines lkaros, Helios, Aiolos et Eos. Elles sont exprimées pendant le développement et régulent la différenciation des lymphocytes B et T. Ces protéines présentent une forte homologie de leurs séquences nucléiques et protéiques et sont toutes impliquées dans l'apparition de leucémies lymphoblastiques T ou B. Ces facteurs présentent toutefois de très fortes divergences dans leurs profils d'expression, leurs fonctions et leurs gènes cibles. Ce travail à partir d'une lignée cellulaire T immature déficiente pour lkaros à permis d'étudier les différences fonctionnelles et moléculaires des membres de la famille. La réexpression d'lkaros, d'Aiolos et d'Helios permet la différenciation et la diminution de la prolifération de ces cellules. Cette expérience a montré que les différents membres de la famille avaient des capacités distinctes pour activer ou réprimer certains gènes cibles. Un échange des séquences des domaines de liaison à l'ADN de Aiolos et d'lkaros, a permis de montrer que la spécificité fonctionnelle est en partie déterminée par le domaine de liaison à l'ADN, mais aussi par les autres régions d'lkaros et d'Aiolos. / The lkaros transcription factor family is made of the proteins lkaros, Helios, Aiolos and Eos. They are expressed during the development and regulate the differentiation of lymphocytes B and T. These proteins present a strong homology between their nucleic and protein sequences and are involved the appearance of T or B lymphoblastic leukaemia. However these factors present strong differences in their profiles of expression, their functions and their target genes. An immature T cell line, deficient for lkaros, allows us to study the functional and molecular differences of members of the family. There-expression of lkaros, Aiolos and Helios allows the differentiation and the decrease of the proliferation of these cells. I also showed that the various members of the family had different capacities to activate or repress certain target genes. An exchange of the protein sequences coding for the DNA binding domain (DBD), shows that the functional specificity is partially determined by the DBD domain, but also by the other regions of lkaros and Aiolos.