Résumé : Cette thèse porte sur l’élaboration d’un outil de capture d’ADN permettant d’identifier une mutation génétique (SNP) grâce à la formation de sandwichs avec des particules de carboxylatex biofonctionnalisées avec des oligonucléotides couplée à une détection de la fluorescence. Le modèle biologique choisi pour ce projet est le génotypage plaquettaire et plus particulièrement la recherche du gène biallélique HPA-1. Le principal objectif de ce travail a été d’optimiser un outil de capture préalablement développé dans l’équipe (Trévisan, 2011) afin de réduire le nombre d’étapes et de simplifier la mise en œuvre globale du test en modifiant les interactions moléculaires utilisée pour capturer l’ADN cible et en utilisant des particules fluorescentes comme élément de détection. En présence d’ADN cible, des sandwichs sont formés entre les particules fluorescentes et les particules magnétiques biofonctionnalisées. Ces sandwichs sont purifiés par séparation magnétique et la fluorescence est détectée par trois méthodes : la cytométrie en flux, l’imagerie de fluorescence et l’Evareader (détection par ondes évanescentes). Dans un premier temps, les paramètres de fonctionnalisation chimique et biologique des différentes particules (magnétiques et fluorescentes) ont été déterminés et optimisés ainsi que les conditions d’hybridation pour la capture de l’ADN cible. Ensuite, la formation des sandwichs et leur détection ont été suivies par des mesures de fluorescence en utilisant trois méthodes différentes : la cytométrie en flux, l’imagerie de fluorescence et l’Evareader (capteur à ondes évanescentes). Les résultats obtenus avec les différentes méthodes de détection sont concordants et montrent que l’outil de capture d’ADN développé permet de capturer la cible synthétique (oligonucléotide) HPA-1 en réduisant le temps d’analyse de 45 min. Dans nos conditions, le test permet de discriminer l’allèle a de l’allèle b du gène HPA-1 qui ne diffère que d’un nucléotide. Le rapport des signaux de fluorescence issus du sandwich spécifique et du sandwich non spécifique est d’environ 2,5 à 3. Ce rapport devra être amélioré par la suite, en optimisant les conditions de formation des sandwichs. La prochaine étape consistera à optimiser le système de capture d’ADN développé pour gagner en spécificité et déterminer la limite de détection du test. Ce test devra également être validé avec des échantillons biologiques. A plus long terme, la fluorescence pourra être détectée par un photodétecteur miniaturisé actuellement développé à l’Université de Sherbrooke. Des études préliminaires présentées dans ce manuscrit montrent les potentialités de ce nouveau transducteur. // Abstract : This thesis is about the development of a new assay to capture DNA. This assay is based on the formation of sandwiches between biofunctionnalized with oligonucleotides carboxylatex microparticles combined with fluorescence detection. It should be able to discriminate single nucleotide polymorphism (SNP). This assay is designed to be applied to platelet genotyping for the research of the gene HPA-1. The main goal of this work was to improve an assay previously developed (Trévisan, 2011) by INL and EFS Rhône-Alpes. The objectives are to reduce the number of steps and to simplify the test. To do so, the molecular interactions used in order to capture target DNA are modified and fluorescent microparticles are used for the detection. In the presence of target DNA, sandwiches are formed between both biofunctionnalized fluorescent and magnetic particles. Those sandwiches are purified through magnetic separation. Then, fluorescence is detected by three methods: flow cytometry, fluorescence imaging and Evareader (detection with an evanescent wave). First, chemical and biological parameters for the functionalization of the different particles (magnetic and fluorescent) are determined. The conditions for the capture of target DNA were optimized. Then, the formation and the detection of the sandwiches were estimated by measuring the fluorescence using three different methods: flow cytometry, fluorescence imaging and Evareader. The results obtained with the three methods are consistent. They show that the new system enables to capture synthetic target (oligonucleotide) HPA-1 with a reduction of total time analysis of 45 min. In our conditions, SNP can be discriminated for HPA-1 gene. For this discrimination, the fluorescence signal ratio about 2.5 to 3. This ratio should be improved by optimizing the conditions of sandwiches formation. Next step will consist in the optimization of the system developed to capture DNA in order to gain specificity and to determine the limit of detection. This test should also be validated with biological samples. In the long term, fluorescence could be detected by a miniaturized photodetector developed in the University of Sherbrook. Preliminary studies presented in this manuscript show the potentialities of this new transducer.

L’infertilité affecte environ 15% des couples en âge de se reproduire. Dans près de la moitié des cas, des facteurs masculins sont à la base de l’infertilité, quoique les causes exactes demeurent souvent inconnues. Les spermatozoïdes de mammifères subissent une série d’étapes de maturation avant d’acquérir la capacité de féconder un ovocyte. Les premiers changements ont lieu à l’intérieur de l’épididyme, où les spermatozoïdes gagnent la capacité de se mouvoir ainsi que de reconnaître et d’interagir avec l’ovocyte. Suite à l’éjaculation, ils doivent subir une seconde série de modifications à l’intérieur du tractus génital femelle, nommée capacitation. Nous avons préalablement démontré que chez le bovin, la famille de protéines BSP (Binder of SPerm) est essentielle à la capacitation. Des homologues des BSP ont aussi été isolés du fluide séminal de porc, de bouc, de bélier, de bison et d’étalon. Malgré la détection d’antigènes apparentés aux BSP dans le fluide séminal de souris et d’humain, les homologues des BSP n’ont jamais été caractérisés chez ces espèces. Nous avons émis l’hypothèse que des homologues des BSP seraient exprimés chez la souris et l’humain et joueraient un rôle dans la maturation des spermatozoïdes. Nous avons démontré que des séquences homologues aux BSP sont présentes dans les génomes murin et humain. Le génome murin contient trois séquences; Bsph1, Bsph2a et Bsph2b, tandis qu’une seule séquence (BSPH1) a été identifée chez l’humain. Les séquences d’ADNc de Bsph1, Bsph2a et BSPH1 ont été clonées, tandis que Bsph2b serait probablement un pseudogène. Les trois gènes sont exprimés uniquement dans l’épididyme et font partie d’une sous-famille distincte à l’intérieur de la famille des BSP. Chez les ongulés, les BSP sont exprimées par les vésicules séminales, sont ajoutées aux spermatozoïdes lors de l’éjaculation et représentent une proportion significative des protéines du plasma séminal. Au contraire, les BSP épididymaires ne sont retrouvées qu’en faibles quantités dans le fluide séminal. L’étude de leur rôle dans les fonctions spermatiques était donc plus difficile que chez les ongulés, où l’isolement des protéines natives du plasma séminal à l’aide de techniques de chromatographie était possible. Afin d’étudier sa fonction, nous avons exprimé BSPH1 recombinante dans E. coli. Les ponts disulfure des domaines de type-II caractéristiques de ces protéines ont fait en sorte que l’expression de BSPH1 fusionnée à une étiquette hexahistidine ou glutathion-S-transférase a donné lieu à des protéines insolubles dans les corps d’inclusion. La production de BSPH1 soluble a été possible grâce à l’ajout d’une étiquette thiorédoxine et l’expression dans une souche au cytoplasme oxidatif. BSPH1 a été purifiée par affinité et sa liaison aux partenaires connus des BSP, la phosphatidylcholine, les lipoprotéines de faible densité et la membrane des spermatozoïdes, suggérait que la protéine recombinante possédait sa conformation native et pouvait être utilisée pour des essais fonctionnels. La forme native de BSPH1 a été détectée dans le plasma séminal humain suite au fractionnement par gel filtration. La liaison de BSPH1 native à une colonne d’affinité à l’héparine a indiqué qu’elle partage aussi cette propriété de liaison avec la famille des BSP, et pourrait lier les GAGs semblables à l’héparine du tractus génital féminin. Une colonne d’immunoaffinité anti-BSPH1 a été préparée à l’aide d’anticorps générés contre des protéines recombinantes, et a permis d’isoler BSPH1 native à partir d’extraits de spermatozoïdes humains. Nos résultats montrent que BSPH1 native serait localisée dans les microdomaines « rafts » de la membrane. Sa masse moléculaire apparente était de 32 kDa, ce qui est supérieur à la masse prédite selon sa séquence en acides aminés, indiquant la présence probable de modifications post-traductionnelles, ou d’une migration anormale. L’effet de BSPH1 recombinante et des anticorps anti-BSPH1 sur la motilité, la viabilité et la capacitation a aussi été étudié. Les deux dernières variables ont été mesurées par un essai de cytométrie en flux, optimisé dans cette étude. Aucun effet des protéines recombinantes ou des anticorps sur la motilité et la viabilité des spermatozoïdes n’a été noté. Quoiqu’une stimulation modeste, quoique significative, de la capacitation ait été observée à la plus faible concentration de BSPH1, les concentrations plus élevées n’ont pas montré d’effet. De la même manière, les anticorps anti-BSPH1 n’ont pas eu d’effet significatif sur la capacitation. Ces résultats suggèrent que BSPH1 produite dans E. coli n’affecte pas la capacitation de façon marquée. Cependant, puisque BSPH1 native possède probablement des modifications post-traductionnelles, une protéine recombinante produite dans des cellules de mammifères pourrait affecter les fonctions spermatiques. De manière alternative, les BSP épididymaires remplissent peut-être un rôle différent dans les fonctions spermatiques que celles sécrétées par les vésicules séminales des ongulés. Les résultats décrits dans cette thèse pourraient contribuer à améliorer le diagnostic de l’infertilité masculine, ainsi que les techniques de reproduction assistée et éventuellement, pourraient mener au développement de contraceptifs masculins. / Infertility affects approximately 15% of couples of reproductive age. In nearly half the cases, male factors are responsible, although causes underlying male infertility often remain unknown. Mammalian sperm undergo a series of maturational steps before acquiring the capacity to fertilize an oocyte. The first changes take place inside the epididymis, where sperm gain motility and the ability to recognize and interact with the oocyte. After ejaculation, sperm go through a second maturation event named capacitation, taking place inside the female reproductive tract. We previously showed that in the bovine species, proteins of the BSP (Binder of SPerm) family are essential for capacitation. Homologs of these proteins have also been isolated from boar, ram, goat, bison and stallion seminal fluid. Although BSP-related antigens have been detected in mouse and human seminal fluid, BSP homologs have never been characterized in these species. We hypothesized that BSPs would indeed be expressed in mice and humans and could be involved in sperm maturation. Our studies demonstrated that BSP-homologous sequences are present in the mouse and human genomes. The mouse genome contains three BSP-like sequences, Bsph1, Bsph2a and Bsph2b, whereas only one sequence (BSPH1) was identified in the human genome. The complete cDNA sequences of Bsph1, Bsph2a and BSPH1 were cloned, whereas Bsph2b is probably a pseudogene. The two murine and sole human genes are expressed uniquely in the epididymis, and are part of a distinct sub-family within the BSP superfamily. The BSPs of ungulates are expressed in the seminal vesicles, are added to sperm upon ejaculation and represent a significant proportion of seminal plasma proteins. In contrast, BSP proteins expressed in the mouse and human epididymides are found in very small quantities in seminal fluid. The study of their role in sperm functions was therefore less straightforward than for ungulate species, where direct isolation of the native proteins from seminal plasma was feasible using various chromatography techniques. In order to investigate the role of the human BSP protein, BSPH1, we expressed the recombinant protein in E. coli. Probably due to the multiple disulfide bonds within the fibronectin type-II domains characteristic of these proteins, expression of BSPH1 with a hexahistidine or glutathione-S-tranferase tag gave rise to insoluble protein trapped inside bacterial inclusion bodies. Successful expression of soluble BSPH1 was achieved when the protein was fused to a thioredoxin tag and expressed in a bacterial strain that possesses an oxidizing cytoplasm. This protein was purified using affinity chromatography techniques and tested for binding to known ligands of BSP proteins: phosphatidylcholine, low-density lipoproteins and the human sperm membrane. Since recombinant BSPH1 displayed all three binding properties, we concluded that it had assumed its native conformation and could be used in subsequent functional assays to determine its role in sperm functions. The native form of BSPH1 was detected in human seminal plasma after fractionation on a gel filtration column. Native BSPH1 also bound to a heparin-affinity column, indicating that it shares this binding property with the BSP family and may also bind heparin-like GAGs of the female reproductive tract. An anti-BSPH1 immunoaffinity column was prepared using antibodies generated with bacterially expressed recombinant proteins and was used to isolate native BSPH1 from human sperm extracts. In addition, our results show that BSPH1 probably localizes to detergent-resistant microdomains of the human sperm membrane. Its apparent molecular weight was 32 kDa, which is superior to that predicted by its amino acid sequence. Therefore, BSPH1 probably undergoes post-translational modifications or migrates abnormally during electrophoresis. The effect of recombinant BSPH1 protein and anti-BSPH1 antibodies on human sperm motility, viability and capacitation were also investigated. The latter two sperm functions were assayed using a flow cytometry technique optimized in this study. No effect of recombinant BSPH1 or antibodies on sperm motility or viability was noted. Although a modest yet significant stimulation of capacitation was observed at lower BSPH1 protein concentrations, higher concentrations showed no effect. In the same fashion, anti-BSPH1 antibodies showed no significant effect on capacitation. These results suggest that recombinant BSPH1 produced in E. coli does not appreciably affect capacitation. However, since native BSPH1 may be subject to post-translational modifications, it is possible that BSPH1 expressed in a mammalian system would affect sperm capacitation. Alternatively, epididymally expressed BSPs may play a somewhat different role in sperm functions than those secreted by the seminal vesicles of ungulates. The results described in this thesis could aid in better diagnosing male infertility, improving assisted reproduction and eventually, developing male contraceptives.

Les canaux Ca2+ activés par le voltage (CaV) sont des protéines membranaires qui génèrent des courants Ca2+ dans les cellules excitables suite à une dépolarisation membranaire. Ces complexes oligomériques sont classifiés selon les propriétés structurelles de la sous-unité principale qui forme le pore du canal, soit la sous-unité CaVα1. La sous-unité auxiliaire CaVβ module l’expression membranaire et la dépendance au voltage du « gating » de la sous-unité CaVα1 des canaux HVA (« high-voltage-activated ») CaV1 et CaV2. La sous-unité CaVβ est formée par un domaine SH3 (« Src homology-3 ») connecté à un domaine GK (« guanylate kinase-like ») par le biais d’un domaine variable HOOK. Dans le but d’identifier les résidus dans la CaVβ3 qui sont responsables de la densité membranaire du CaV2.3, nous avons produit des mutants de la sous-unité auxiliaire le long de ses domaines fonctionnels. Cela dit, la délétion complète du domaine SH3 ainsi que la délétion du domaine HOOK n’ont pas modifié la densité membranaire de CaV2.3 ni ses propriétés d’activation. Cependant, la délétion de cinq résidus dans le domaine GK interrompt l’expression membranaire et l’expression fonctionnelle de CaV2.3. La mutation de résidus identifiés précédemment comme soutenant une affinité de liaison de l’ordre du nanomolaire dans le domaine GK de CaVβ n’a pas modifié de manière significative l’adressage membranaire de CaV2.3. Toutefois, les mutations de quatre résidus leucine dans les régions α3, α6, β10 et α9 du domaine GK ont grandement réduit l’adressage membranaire du canal CaV2.3. Nos résultats confirment que le domaine GK contient les déterminants moléculaires responsables de la fonction chaperone de CaVβ. Cela dit, l’adressage membranaire induit par CaVβ semble être déterminé par des éléments structuraux qui ne sont pas strictement dépendants d’une liaison à haute affinité de CaVβ sur CaVα1. / Voltage-activated Ca2+ channels (CaV) are membrane proteins that play a key role in promoting Ca2+ influx in response to membrane depolarization in excitable cells. They form oligomeric complexes that are classified according to the structural properties of the pore-forming CaVα1 subunit. Auxiliary CaVβ subunits modulate cell-surface expression and voltage-dependent gating of high-voltage-activated (HVA) CaV1 and CaV2 α1 subunits. CaVβ subunits are formed by a Src homology-3 (SH3) domain and a guanylate kinase-like (GK) domain connected through a variable HOOK-domain. In order to identify the residues responsible for the CaVβ3-induced membrane density of CaV2.3, we produced mutants along CaVβ3’s fonctionnal domains. Complete deletion of the SH3 domain as well as deletion of the HOOK domain did not alter plasma membrane targeting of CaV2.3 nor its typical activation gating. In contrast, 5-residue deletions in the GK domain disrupted cell surface trafficking and functional expression of CaV2.3. Mutations of residues known to carry nanomolar affinity binding in the GK domain of CaVβ did not significantly alter cell surface density. Mutations of a quartet of leucine residues in the α3, α6, β10, and α9 regions of the GK domain, each expected to curtail protein-protein interaction, were found to significantly impair cell surface targeting of CaV2.3 channels. Altogether, our results confirm that the GK domain includes the molecular determinants carrying the chaperone function of CaVβ. However, CaVβ-induced cell surface targeting appears to be determined by structural elements that are not strictly dominated by high-affinity binding of CaVβ onto CaVα1.

La conservation au niveau population est extrêmement nécessaire pour limiter la perte de biodiversité au sein d'une espèce ou d'un complexe d'espèces. Ainsi, l'évaluation de la variabilité inter-populationnelle dans le complexe est reconnue comme première étape importante pour bien définir les plans de conservation des espèces menacées. Arenaria grandiflora form un complexe d'espèces herbacées pérennes à courte durée de vie (4 ans en moyenne) menacé dans certains sites de ses zones de distribution en Europe. A ce jour, sa taxonomie n'est pas bien résolue, ce qui entraîne des problèmes potentiels pour mettre en oeuvre une conservation efficace de ce taxon. Une variation inter-populationnelle du complexe d'espèces A. grandiflora est présentée dans cette étude aux niveaux génétiques, cytogénétiques et morphométriques. Quatre méthodes ont été utilisées : des marqueurs microsatellites nucléaires, une approche cytogénétique, la cytométrie en flux, et enfin la morphométrie sur les feuilles. De plus, les études phénotypiques de variation de taux de germination entre stocks de graines ont été développées. Une différenciation significative entre les profils de variations moléculaires, cytogénétiques et phénotypiques a été détectée dans le complexe d'espèces. Deux cytotypes (diploïdes 2n=2x=22 et tétraploïdes 2n = 4x = 44) ont été mis en évidence en utilisant à la fois des méthodes classiques et des méthodes plus récentes (marqueurs microsatellites, nombres chromosomiques et cytométrie de flux). Le complexe d'espèces d'A; grandiflora présente une forte variation de la valeur de l'ADN 2C, la taille du génome varie de 2.11 ± 0.74 pg à 2.70 ± 0.11 pg pour les populations diploïdes et de 4.30 ± 1.51 pg à 5.27 ± 0.14 pg pour les populations de tétraploïdes. En outre, les grains de tétraploïdes germent significativement mieux que les graines des diploïdes. Les feuilles diffèrent considérablement entre les diploïdes (aciculaires et linéaires) et les tétraploïdes (lancéolées). Cette étude peut être considérée comme préliminaire pour une révision taxonomique de ce complexe d'espèces. D'autre part, grâce à l'ensemble des résultats obtenus, il est également possible de revisiter le concept d'unités évolutives significatives (ESUs) dans le complexe d'espèces A. grandiflora et donc de définir les groupes de populations devant faire l'objet de mesures distinctes. Ainsi, il est possible d'évaluer la pertinence de plans déjà entrepris et de proposer de nouveaux plans de restauration efficaces pour l'avenir de ce complexe d'espèces. / Population-level conservation is being extremely required to restrain the biodiversity loss within a species. So, the assessment of the variability within the species complex is being renowned as an important first step to well implement the future conservation settings for threatened species. The species complex of Arenaria grandiflora is a short-lived perennial herbaceous and a threatened taxon in certain of sites of its distribution areas in Europe, with unresolved gentics and taxonomy, which lead to potential problems in the conservation and utilization of the resource. A differenciation among populations of the species complex of A. grandiflora is presented in this study based on the genetic, cytogenetic and phenotypic patterns. Intraspecific ploidy level varaition is an important aspect of numerous species, so, the present study explores this phenomenon within the A. grandiflora species complex in some type of populations (27 natural populations). To infer the intraspecific genetic and cytogenetic patterns of variability among the studied natural populations of the investigated species complex (A. grandiflora), three methods were used : nuclear microsatellite markers, cytogenetic and flow cytometry approaches. Moreover, the phenotypic patterns of variation among both the stock of seeds and the herbarium materials of A. grandiflora were defined. These patterns were detected using three methods of seed germination (in vitro culture, filter papers and potting soil) and morphometric approaches. A significant differentiation among populations' patterns of molecular, cytogenetic and phenotypic variation was detected within the A. grandiflora species complex. Presence of two closely related cytotypes (diploids 2n=2x=22 and tetraploids 2n=4x=44) was detected using both classical and more recent methods (chromosome number count and flow cytometry respectively). The species complex of A. grandiflora exhibits high variation in 2C-DNA value, the genome size ranges from 2.11 ± 0.74 pg to 2.70 ± 0.11 pg for the diploid populations and from 4.30 ± 1.51 pg to 5.27 ± 0.14 pg for the tetraploid populations. Moreover, the seeds of tetraploids germinate well and in high proportion than the seeds of the diploid ones. In addition, both acicular and linear leaves from the diploid populations differ significantly within the diploids and with the lanceolate leaves of the tetraploid ones. New protocol of seed germination for the tetraploids by in vitro culture after scarifying was described for th first time. The affected factors on seed germination percentages were determinated by an explanatory model of six predictors (altitude, longitude, latitude, ploidy levls, both period and condition of seed storage). Consequently, all these findings are fundamental for the determination of the evolutionarily significant units (ESUs) within A. grandiflora species complex and thus the definition of efficient restoration plans in the future. This study would consider as the preliminary signal for necessary revision for the intraspecific taxonomic keys problematic for this species complex.

Les cellules souches neurales quiescentes (CSN) sont le réservoir de la neurogenèse adulte, permettant de produire des nouveaux neurones tout au long de la vie. Cependant, la neurogenèse décroit au cours du vieillissement, provoquant des déclins cognitifs incurables. Afin de mieux comprendre les mécanismes qui contrôlent la prolifération des CSN, nous avons mis en place une méthode de tri par cytométrie en flux qui permet pour la première fois d’isoler les CSN quiescentes et leurs cellules filles dans la ZSV adulte murine. Cette technique nous a permis de prouver que le blocage de la voie GABAAR in vivo provoque l’entrée en cycle des CSN quiescentes. Ainsi, les signaux GABA produits par les neuroblastes dans la ZSV permettent de maintenir les CSN dans leur état de quiescence. Au cours du vieillissement, nous montrons que la production progressive de TGFβ1 par les cellules endothéliales de la niche allonge la phase G1 des CSN activées, diminuant sensiblement la production de nouveaux neurones, sans toutefois diminuer le stock de CSN. Nous mettons ainsi en évidence deux voies majeures contrôlant la prolifération des CSN in vivo, la voie du GABAAR et la voie TGF-β/Smad-3. En vue d’une application thérapeutique, nous prouvons que leur blocage pharmacologique permet de stimuler efficacement la neurogenèse in vivo. / Quiescent neural stem cells (NSCs) are considered the reservoir for adult neurogenesis, generating new neurons throughout life. However, neurogenesis decreases during aging, causing a progressive decline that is currently untreatable. To study the regulatory mechanisms of NSCs proliferation, we set up a new technique allowing the isolation of quiescent NSCs and their progeny. We show that GABAAR directly regulates NSCs quiescence in vivo as the depletion of GABA-producing neuroblasts or GABAAR pathway pharmacological blockade provoked NSCs cell cycle entry in the SVZ. During aging, the stock of NSCs is not perturbed, but we show that an over-production of TGFβ1 by brain endothelial cells directly lengthens activated NSCs G1 phase, strongly decreasing the production of new neurons. These findings highlight GABAAR and TGF-β/Smad-3 as two major pathways controlling NSCs proliferation. In line with a future therapeutic application, we also prove that their blocking stimulates endogenous neurogenesis in vivo.

Les microARN constituent une classe de petits ARN non codants d’une vingtaine de nucléotides, issus de transcrits cellulaires, qui inhibent l’expression de gènes cibles au niveau post-transcriptionnel. Chez les mammifères, bien qu’ils puissent agir sur une cible parfaitement complémentaire (mode parfait), les microARN ont presqu’exclusivement des cibles partiellement complémentaires (mode imparfait). Puisqu’en mode imparfait une coupure endonucléolytique de la cible est impossible, il est généralement proposé que le mode imparfait soit moins efficace que le mode parfait : conduisant à un silencing moins efficace, nécessitant plus de complexes effecteurs (miRISC) et facilement saturable par une augmentation du nombre de cible. Dans ce travail j’ai développé une approche expérimentale reposant sur l’expression de protéines fluorescentes pour mesurer précisément le silencing au niveau de chaque cellule. J’ai fait trois observations inattendues sur l’efficacité de la régulation par les microARN : i) le silencing en mode parfait et imparfait nécessite des quantités similaires de petit ARN, ii) une augmentation, même très importante, de l’expression du gène cible ne lui permet pas d’échapper à la régulation, iii) le silencing n’est pas intrinsèquement plus faible en mode imparfait (qu’en mode parfait) mais n’est pas actif dans toutes les cellules. Si les deux premiers points sont facilement explicables dans le cadre de l’induction de la dégradation de l’ARNm cible sur un mode catalytique via la déadénylation de l’ARNm, le troisième indique l’existence d’une régulation forte du silencing qui est spécifique du mode imparfait. De plus, comme dans les deux modes le silencing dépend principalement du même partenaire, Ago2, cette régulation intervient après l’assemblage du complexe minimal (Ago2/petit ARN). Ainsi, les différences entre les modes parfait et imparfait ne se situent pas au niveau proposé puisque lorsque la cellule est compétente, leurs efficacités sont comparables. Par contre, mes travaux mettent en évidence l’existence d’un contrôle de la régulation en mode imparfait dont la nature reste à préciser. / MicroRNAs are endogenous small non-coding RNAs about 21 nucleotides in length that inhibit the expression of target genes primarily at the post-transcriptional level. The target recognition of microARN is sequence-specific and requires a partial complementarity between the microRNA and target sequences that are present on the mRNA molecules. microRNAs are part of an effector complex, miRISC, containing multiple proteins which can participate to a repression of translation and/or promotes destabilization of the target mRNA. The mechanism of microRNA silencing is not completely understood to date, but it is assumed that it is globally less potent than that of siRNA acting on perfect targets. By using fluorescent proteins expressing reporter plasmids and flow cytometry, we observed an efficient silencing by microRNA which does not require more active complexes than the perfect target silencing and cannot be easily saturated. This suggests that in cells in culture, microRNA silencing works in a catalytic manner leading to mRNA degradation. In addition, our data also indicates that the efficiency of microRNA silencing is variable among cells and can be almost completely abrogated under some conditions contrary to the siRNA silencing which is active in all cells. As we observed that the protein Ago2 is the only member of Ago family that is implicated in the microRNA silencing, it follows that the regulation of microRNA silencing acts after the formation of the core complex (Ago2/small RNA). So the difference between the silencing in the perfect and imperfect mode are not what is usually proposed, but pertain to a level of cellular control, which remains to be deciphered.

Les Inhibiteurs de l'activité Tyrosine Kinase (ITK) de BCR-ABL (Imatinib (IMA), Nilotinib (NIL) et Dasatinib (DAS)) ont révolutionné le traitement de la Leucémie Myéloïde Chronique (LMC), mais la cinétique et l'intensité des réponses thérapeutiques restent variables. Par ailleurs, plusieurs travaux démontrent qu'il persiste chez la majorité des patients des cellules souches leucémiques (CSL) CD34+ résistantes aux ITK et capables de reconstituer la maladie. Partant du principe que la thérapie ciblée (les ITK) devait atteindre le compartiment cellulaire et du constat qu'aucune méthode ne permettait d'évaluer la quantité d'ITK dans les cellules malignes vivantes, nous avons développé un procédé en cytométrie en flux pour quantifier ces molécules dans les cellules de la LMC. Nous avons ainsi démontré que la mort cellulaire des lignées K562 et KCL22 à 24h est étroitement corrélée à la quantité d'IMA accumulée dès la 1ère heure. L'application du procédé aux cellules primaires a montré un taux intracellulaire d'ITK dépendant des caractéristiques des cellules et variable d'un sujet à l'autre (Article 1). Pour l'instant, en raison de l'hétérogénéité de notre cohorte, nous n'avons pas pu mettre en évidence de corrélation entre l'accumulation des ITK et la réponse thérapeutique de la LMC. Notre procédé nous a permis de suivre l'accumulation in vivo du DAS dans les blastes circulants d'un patient LMC en phase d'acutisation, en parallèle de la réactivation de pSyk348 - que nous avons identifié comme marqueur de progression - au moment de l'échappement au DAS (Article 2). Un avantage majeur du procédé est la possibilité d'analyser les différentes sous-populations, dont les cellules CD34+ de LMC. Ces dernières ont un taux d'ITK intracellulaire plus faible que les cellules matures, voire absent chez certains patients. Pour l'instant une corrélation significative avec les tests clonogéniques effectués en parallèle est retrouvée seulement avec le DAS. Enfin, nos résultats préliminaires suggèrent des différences entre les cellules CD34+ du sang et de la moelle. En conclusion, ce procédé permet d'évaluer la quantité d'ITK dans des sous-populations cellulaires précises et viables. Nous envisageons de poursuivre ce projet par l'évaluation de l'intérêt d'un dosage précoce du taux d'ITC intracellulaire in vivo (après la 4ème prise) d'une part et d'autre part par l'étude de l'influence du microenvironnement sur la résistance des CSL de LMC aux ITK et sur certaines dérégulations propres à ce compartiment cellulaire. / The Tyrosine Kinase Inhibitors (TKI) of BCR-ABL (Imatinib (IMA), Nilotinib (NIL) and dasatinib (DAS)) have revolutionized the treatment of Chronic Myeloid Leukemia (CML). However therapeutic responses remain variable. Moreover, several studies showed that most patients have persistent CD34+ leukemic stem cells (LSCs) resistant to TKI and the origin of disease relapse. Given that the targeted therapy (TKI) should reach malignant cells and that no method was able to assess the amount of TKI in viable target cells, we have developed a process by flow cytometry for TKI quantification in target cells. By using K562 and KCL22 cell lines we showed that cell death at 24hrs was closely related to IMA uptake after one hour of incubation. We then applied our method to primary cells and showed an intracellular level of IMA, NIL and DAS dependent on cell characteristics and heterogeneous from one subject to another (Article 1). Probably because of the heterogeneity of our series, we did not find any correlation between the accumulation of TKI and therapeutic response of CML. Moreover, we used our process to observe a decrease in DAS accumulation in vivo in circulating blasts of a CML patient with acute transformation, in spite of significant DAS uptake, we observed a recurrence of Syk phosphorylation in Y348 that we identified as a potential marker of acutisation, at the same time of disease resistance (Article 2). A major advantage of our process is the possibility to analyze the different cell subsets, including CD34+ CML cells. These cells had a lower (even absent in cells from some patients) level of intracellular TKI compared to mature cells. The clonogenic assays performed in parallel showed a significant correlation with DAS only. Finally, our preliminary results suggest differences between CD34+ cells from blood and those from bone marrow. In conclusion, our process allows evaluating the amount of TKI in viable cell subpopulations. This project will be continued with i) the study of the potential interest of the early evaluation of in vivo intracellular level of TKI (after the fourth dose) and ii) the influence of the microenvironment on CSL resistance to TKI and epigenetics deregulations.

La symbiose constitue une force évolutive majeure permettant de nombreuses adaptations des partenaires, en particulier dans la réponse des hôtes aux agents pathogènes. La bactérie endosymbiotique Wolbachia ( -protéobactérie) confère ainsi à certains insectes une résistance aux agents pathogènes humains dont ils sont les vecteurs. Chez le crustacé isopode Armadillidium vulgare, la présence de Wolbachia altère l'immunocompétence de son hôte en diminuant le taux d'hémocytes circulants (THC) et en augmentant la septicémie naturelle. La présence de Wolbachia dans les hémocytes et les organes hématopoïétiques a soulevé de nombreuses questions quant aux conséquences que cela entraîne sur le fonctionnement du système immunitaire et sur l'immunocompétence d'A. vulgare. Nous avons donc étudié l'impact de cette symbiose sur les hémocytes, l'immunocompétence et l'expression de gènes de l'immunité. Ainsi Wolbachia est présente dans plus d'un tiers des hémocytes (hybridation in situ fluorescente) et sa présence diminue la proportion d'hémocytes granulaires circulants (cytométrie en flux) chez les animaux âgés d'un an, sans affecter le THC à cet âge. L'activité phénoloxydase diminue avec l'âge et le statut symbiotique. En revanche, la présence de Wolbachia semble protéger les hémocytes de l'apoptose et augmenter l'immunocompétence d'A. vulgare lors d'une infection par Listeria ivanovii. Enfin, la quantification de l'expression des gènes de l'immunité, identifié après l'établissement du premier transcriptome de référence d'isopode (projet ANR EndoSymbArt), a révélé une tendance à la sous-expression au niveau de l'animal entier et des ovaires mais à la sur-expression dans les tissus immunitaires. La présence deWolbachia modifie donc les caractéristiques du système immunitaire aux niveaux cellulaire et humoral ainsi que l'immunocompétence d'A. vulgare. L'étude de nouveaux paramètres permettra d'établir si la présence de Wolbachia constitue réellement un avantage pour son hôte ou si au contraire la bactérie présente un coût parasitaire important.

Le foisonnement filamenteux est un problème récurant dans de nombreuses stations d'épuration à boues activées. L'objectif de ces travaux est d'améliorer la compréhension des mécanismes physiologiques et moléculaires impliqués dans la filamentation des microorganismes, afin de pouvoir orienter de futures stratégies de lutte contre le phénomène de bulking. Sphaerotilus natans, qui peut croître réversiblement sous forme monocellulaire ou filamenteuse, a été utilisée comme bactérie modèle pour cette étude. Différents types de cultures, ainsi que des suivis par cytométrie en flux et marquage au cFDA/SE, ont montré que les diverses souches de S. natans adoptent des morphologies différentes et que les filaments croissent par divisions cellulaires successives et non par un chaînage des bactéries. Une analyse par RT-QPCR a mis en évidence que l'expression du gène sthA augmente fortement après induction de la filamentation et reste ensuite à un niveau élevé. Une comparaison de l'expression protéique des formes monocellulaire et filamenteuse, par LC-MS-MS, a permis d'identifier des protéines impliquées dans la filamentation, et notamment dans la synthèse de la gaine. La concentration intracellulaire en ARNr, mesurée par RT-QPCR, varie durant la croissance de S. natans et d'autres microorganismes, entraînant une diminution importante de l'intensité du marquage FISH, mesurée par cytométrie en flux. L'utilisation de la technique FISH pour quantifier des microorganismes est donc remise en question, d'autant plus dans des matrices aussi complexes que les boues activées. Ces observations mettent également en doute l'hypothèse, émise en utilisant ce mode de quantification, d'une déstructuration des filaments consécutive à un retour à des conditions de culture plus favorables.

L'immuno-marquage multiple des lymphocytes T par cytométrie en flux permet d'observer plus de phénotypes que les deux isotypes conventionnels T CD4+ et T CD8+. Ces observations sont basées sur la combinaison de marqueurs habituellement utilisés mais rarement tous associés ainsi que sur le niveau d'expression membranaire. Ces données ne peuvent être reproductibles qu'au prix d'une standardisation rigoureuse de la préparation et des réglages du cytomètre et l'élimination de possibles artefacts. Nous décrivons les lymphocytes T CD4+CD8dim, T CD4dimCD8+, T CD3fort (Tgamma/alpha), T CD8alpha/alpha, T CD8dim et T CD8+CD56+. Les trois derniers sont encore peu détaillés. Seules quelques observations ont déjà été rapportées dans la littérature. Certaines combinaisons (doubles positifs CD4+/CD8+) sont observées sur le thymocyte immature mais, classiquement, pas dans le sang périphérique. Il était donc nécessaire de distinguer les isotypes doubles positifs dans le sang périphérique de formes immatures qui auraient pu s'échapper du thymus. L'expression réduite d'un marqueur (" dim ") peut être induite par l'activation du lymphocyte. Il était donc nécessaire d'éliminer une activation récente. Bien que le travail en l'état se limite à des descriptions phénotypiques, nous avons cherché à connaître la pertinence physiologique possible de ces expressions aberrantes en faisant une courte revue de la littérature sur les étapes de la lymphopoïèse, les mécanismes d'orientation vers une lignée particulière et les processus d'activation lymphocytaire spécifique. L'expression d'un marqueur membranaire étant dépendant de son utilité, nous émettons l'hypothèse que ces isotypes non conventionnels ont une activité immunitaire particulière, soit habituellement minoritaire ou restreinte à certains sites soit induite. Des études fonctionnelles devraient éclaircir ce point. Nos résultats ne permettent pas de préciser si leur émergence est un processus actif (éventuellement chronique) ou est séquellaire d'une sollicitation passée. Certaines populations ont une diversité très restreinte. Nous les avons qualifiées d'oligoclonales à défaut de pouvoir confirmer leur monoclonalité. Compte tenu de la grande diversité du système immunitaire T, il est peu probable que cette restriction soit fortuite. Elle peut être réactionnelle mais doit être distinguée des authentiques syndromes lymphoprolifératifs aux phénotypes parfois proches. Nous situant alors dans la situation frontière entre physiologie et pathologie, nous avons proposé de qualifier ces populations de " dysclonotypie oligoclonale de signification indéterminée " par analogie avec le concept de " dysglobulinémie monoclonale de signification indéterminée ". Des études complémentaires devraient permettre de clarifier cette hypothèse et éventuellement de définir des critères pronostiques.