Dans de nombreuses maladies héréditaires monogéniques, les bases moléculaires du mode de transmission (dominant vs récessif) et l'origine de nombreux phénotypes associés restent obscurs. C'est le cas pour les ataxies épisodiques (EA) et progressives liées au canal calcique Cav2.1. La plupart des mutations présentes dans ces ataxies génèrent une protéine mal repliée retenue et dégradée dans le réticulum endoplasmique. J'ai exploré plusieurs approches afin d'associer les phénotypes dues à la présence des mutants et ceux dues à une « pure » perte de fonction. A l'aide de vecteurs viraux codants pour des ARNs interférents de Cav2.1, j'ai montré que la réduction chez la souris adulte du canal récapitulait de nombreux symptômes de l'EA2.J'étudie également un nouveau modèle murin knock-In pour l'EA2 produisant une forme tronquée mal repliée. L'étude de ces modèles permettra une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques et l'exploration de nouvelles voies thérapeutiques. / Voltage-gated calcium channels (VGCC) regulate an array of physiological process. The P/Q-type VGCC is principally expressed in the cerebellum and at the neuromuscular junction, where it plays an essential role at the presynaptic neuronal nerve. Interestingly, mutations in a1 subunit (Cav2.1) of P/Q-type VGCC gene have been found to be linked for three autosomal dominant human disorders, familial hemiplegic migraine type 1 (FHM1), spinocerebellar ataxia 6 (SCA6) and episodic ataxia type 2 (EA2). Mutations causing EA2 lead to loss-of-function of Cav2.1 channels and are principally non-sense. The origin of dominant transmission and the heterogeneity of the symptoms are not known. Recent data from different groups have shown a dominant-negative effect of Cav2.1 mutants in cultured cell lines. Indeed, the molecular mechanism of this dominant-negative effect appears to be due to the interference of EA2 mutants with the folding of the wildtype subunit, thereby abolishing channel activity. This destructive interaction mechanism promoted by the EA2 mutants is likely to occur in the disease.The first part of my thesis was to monitor the effect of a “pure” silincing of P/Q-type channel in adult mice. Suppression of Cav2.1 channel by RNAi lentiviral based-vector approaches has produced episodic as well as permanent ataxia without signs of progressive ataxia. As a direct approach to understanding the physiologicalcontributions of misfolded truncated mutants in EA2 phenotypes, a Cav2.1 knock-inmutant, CACNA1AR1479x has been generated. This is a fundamental issue to understand the pathogenic mechanisms of EA2 and more generally to the other neuronal and neuromuscular diseases.

Le cancer de la prostate évolue progressivement vers l'androgéno-indépendance, stade incurable pour lequel la recherche biomédicale tente de déterminer de nouvelles cibles thérapeutiques. Cette évolution est marquée par une différenciation neuroendocrine des cellules prostatiques qui s'accompagne d'une surexpression de canaux calciques voltage-dépendants de type T (Cav3.2) responsable d'une altération de l'homéostasie calcique intracellulaire. L'objectif de cette thèse était donc de déterminer l'implication des Cav3.2 dans les cellules cancéreuses prostatiques humaines, et notamment dans les cellules neuroendocrines. Nos résultats montrent que, dans ces cellules non-excitables, les Cav3.2 participent à l'homéostasie calcique en permettant une entrée basale de calcium au potentiel de repos sans contribuer à une entrée capacitive de calcium provoquée par la vidange des réserves intracellulaires de calcium. De plus, ces canaux interviennent dans la sécrétion de la Phosphatase Acide Prostatique, un marqueur des cellules épithéliales prostatiques, dans les cellules neuroendocrines. Par ailleurs, nous montrons l'existence d'un couplage fonctionnel entre les Cav3.2 et les canaux de type BK qui constituent les principales conductances potassiques voltage-dépendantes des cellules prostatiques. Enfin, nos travaux mettent en évidence que ce couplage entre ces deux canaux participe à la prolifération cellulaire des cellules cancéreuses prostatiques. En conclusion, ce travail de thèse contribue à élargir les connaissances sur les canaux calciques de type T, Cav3.2 en particulier, et leur rôle au sein des cellules prostatiques cancéreuses humaines / Prostate cancer inevitably evolves towards an incurable androgen-independent stage for which biomedical research attempts to identity new therapeutic targets. This progression is characterized by a neuroendocrine differentiation of prostate cells accompanied by an overexpression of voltage-dependent T-type calcium channels (Cav3.2), responsible for an alteration of intracellular calcium homeostasis. The aim of this PhD thesis was to determine the involvement of Cav3.2 in human prostate cancer cells, mainly in neuroendocrine cells. Our results show that, in these non-excitable cells, Cav3.2 channels participate to basal calcium homeostasis by promoting calcium entry at resting membrane potential without contributing to the capacitative calcium entry triggered by calcium depletion from endoplasmic reticulum stores. ln addition, these channels are involved in the secretion of Prostatic Acid Phosphatase, a marker of prostatic epithelial cells, in neuroendocrine cells. Furthermore, we show that Cav3.2 channels are functionaly coupled to BK channels which constitute the main voltage-dependent potassium conductances in prostate cells. Finally, our work demonstrates that this coupling between both channels regulates prostate cancer cell proliferation. As a conclusion, this work contributes to the understanding of the role of Cav3.2 T-type calcium channels in human prostate cancer cells.

Les venins issus d’animaux sont des mélanges complexes de substances toxiques ou non qui sont utilisées pour se défendre contre des prédateurs et/ou pour chasser. Le venin est une solution contenant de nombreux composés avec une part prédominante pour les protéines et les peptides. Le venin d’un seul animal peut contenir plusieurs centaines de substances différentes. Les peptides dérivés du venin peuvent cibler des récepteurs membranaires et des canaux ioniques avec une grande affinité et une haute spécificité. Les animaux venimeux les plus connus sont les serpents, les scorpions et les araignées, et leurs toxines sont largement utilisés dans la recherche comme outils moléculaires et pour le développement des nouveaux traitements. Par conséquent, les venins d’animaux sont des sources naturelles extrêmement riches de découverte de molécules biologiquement actives. Dans ces études, nous avons criblé le venin du serpent égyptien Walterinnesia aegyptia pour l’identification de novo de peptides capables d’activer la motilité des spermatozoïdes in vitro des souris OF1. La Spermatin et X sont deux peptides de 57 et 63 acides aminés respectivement, isolés du venin du Walterinnesia aegyptia par la technique de séparation RP-HPLC suivie par la chromatographie échangeuse de cations. La spermatin et l’actiflagelin sont deux activateurs de la motilité spermatique des souris OF1. La spermatin a été séquencé par séquençage de novo en utilisant i) la digestion des peptides par des enzymes protéases comme la trypsine, la chymotrypsine et la protéase V8, et ii) les techniques de spectrométrie de masse TOF/TOF MS/MS et LC-ESI-QTOF MS/MS. Par contre, c’est la complémentarité entre le séquençage de novo, la dégradation d’Edman et les analyses ESI MS/MS qui a permis l’identification de la séquence de l’actiflagelin. Il semble dès lors que la spermatin et l’actiflagelin peuvent être utilisés comme outils pharmacologiques pour diminuer le taux d’infertilité. De l’autre côté, la maurocalcine (MCa) est un peptide de 33 résidus issu du venin du scorpion tunisien Scorpio maurus palmatus. La MCa est un activateur des récepteurs de ryanodine (RyR1) des muscles squelettiques. Elle stimule fortement la liaison du [³H]-ryanodine aux RyR1 et assure le relâchement du calcium intracellulaire des vésicules du réticulum sarcoplasmique (RS). Différents mutants de la MCa ont été utilisés et les résultats montrent que l’Arg24 joue un rôle critique dans la liaison de la MCa aux RyR1 ou tout au moins dans son impact fonctionnel. D’autres mutations de la MCa sont capables de modifier la liaison du [³H]-ryanodine aux RyR1 mais avec une plus faible efficacité que la séquence sauvage. De plus, la MCa est capable de franchir la membrane plasmique et elle est considérée comme un peptide de pénétration cellulaire. Ici, nous avons montré que la MCa est un substrat de la protéine kinase A in vitro suite à la phosphorylation du résidu Thr26. Nous avons aussi démontré que la MCa P-Thr26 inverse l’effet de la MCa. La MCa P-Thr26 inhibe la liaison du [³H]-ryanodine aux RyR1 des muscles squelettiques du lapin et elle est incapable de favoriser la libération du calcium des vésicules du RS. Alors, la MCa peut être utilisée pour le développement des analogues résistants à la phosphatase. Par ailleurs, nous avons étudié l’effet de l’agent réducteur dithiothreitol ou les agents oxydants le diamide et le peroxyde d’hydrogène sur la stimulation du RyR1 par la MCa ou MC E12A. La maurocalcine améliore la liaison du [³H]-ryanodine aux RyR1 des vésicules seules ou pré-incubées avec le dithiothreitol ou les agents oxydants. L’interprétation des résultats indiquent que la MCa et son mutant sont plus efficaces à activer RyR1 sous des conditions de réduction. Par ailleurs, des résultats ont montré que MCa E12A réduit significativement l’inhibition de la liaison du [³H]-ryanodine aux RyR1 induite par Mg²⁺. / Animal venoms are complex mixtures of toxic substances that are used to defend themselves against predators and / or to hunt. Venom is a solution containing many compounds, especially proteins and peptides. The venom of a single animal may contain several hundred different substances. Peptides derived from venom can target membrane receptors and ion channels with strong affinity and high specificity. The best known venomous animals are snakes, scorpions and spiders, and their toxins are widely used in research as molecular tools and for the development of new treatments. Therefore, animal venoms are an extremely rich and complex source of biologically active molecules. In these studies, we screened the venom of the Egyptian snake Walterinnesia aegyptia for the discovery of peptides able to activate sperm motility in vitro of mice OF1. Spermatin and actiflagelin are two peptides of 57 and 63 amino acids, respectively, isolated from the venom of Walterinnesia aegyptia by the RP-HPLC separation technique followed by cation exchange chromatography. Spermatin and actiflagelin are two activators of the spermatic motility of OF1 mice. Spermatin was sequenced by de novo sequencing using digestion of enzymes proteases such as trypsin, chymotrypsin and V8 protease, and further TOF / TOF MS / MS and LC-ESI-QTOF MS / MS. While the complementarity between de novo sequencing, Edman degradation and ESI MS / MS analyzes allowed the identification of the sequence of actiflagelin. Then, Spermatin and actiflagelin can be used as pharmacological tools to decrease the rate of infertility. On the other hand, maurocalcin (MCa) is a 33-residue peptide derived from the venom of the scorpion Scorpio maurus palmatus. MCa is an activator of ryanodine receptors (RyR1) of skeletal muscles. It strongly stimulates the binding of [³H]-ryanodine to RyR1 and ensures the release of intracellular calcium from the vesicles of the sarcoplasmic reticulum (SR). Different MCa mutants were used and the results showed that Arg24 plays a critical role in the binding of MCa to RyR1. Other mutations were able to alter the binding of [³H]-rhyanodine to RyR1 but with low efficiency. In addition, MCa is able to cross the plasma membrane and is considered a cell-penetrating peptide. Here, we have shown that MCa is a substrate of PKA in vitro following the phosphorylation of Thr26. We have also demonstrated that MCa P-Thr26 reverses the effect of MCa. MCa P-Thr26 inhibits the binding of [³H]-ryanodine to RyR1 from the rabbit skeletal muscle, and is unable to promote the release of calcium from the SR vesicles. Then, MCa can be used for the development of phosphatase resistant analogs.Keywords: Animal venom, Walterinnesia aegyptia, RP-HPLC, ion exchange chromatography, de novo sequencing, Spermatin, X, maurocalcine (MCa), [³H]-ryanodine, ryanodine receptors (RyR1), calcium, phosphorylation, sarcoplasmic reticulum (SR).

Dans la fibre musculaire squelettique, le calcium activateur de la contraction musculaire provient du réticulum sarcoplasmique (RS). Parallèlement, un influx calcique est connu pour se développer à travers la membrane plasmique au repos et en activité, mais son rôle physiologique est méconnu. Le travail présenté vise par des approches électrophysiologiques, cellulaires et moléculaires à caractériser les différentes voies d’influx de calcium et leurs mécanismes de régulation dans la fibre musculaire squelettique de souris adulte normale et pathologique. En combinant la technique de mesure d’extinction de fluorescence du Fura-2 par le manganèse à la technique de potentiel imposé, nos résultats démontrent dans une première partie que le calcium rentre au repos de manière passive selon son gradient électrochimique sans générer de courant détectable, tandis qu’en activité un influx activé par la déplétion du RS et un influx activé par la dépolarisation, tous deux électriquement silencieux, se développent en parallèle de l’entrée médiée par les canaux calciques voltage- dépendants de type L. La deuxième partie du travail s’intéresse à la protéine TRPC1 dont le rôle fonctionnel reste controversé dans la fibre musculaire. Contrairement aux résultats décrits dans la littérature, nos expériences de surexpression indiquent que TRPC1 s’exprime au niveau du RS longitudinal où il génère une fuite de calcium. Dans une dernière partie, il est décrit que l’amplitude des courants calciques voltage-dépendants de type L est réduite dans les fibres musculaires d’un modèle de souris présentant une myopathie centronucléaire liée à un déficit en une phosphatase lipidique, la myotubularine. / In skeletal muscle, calcium in charge of activation of the contraction is released from the sarcoplasmic reticulum (SR). In parallel, a calcium influx is known to occur through the plasma membrane at rest and during activity, but its role remains elusive. The present work aims at characterizing the different calcium influx pathways and the mechanisms that regulate their activity in normal and pathological adult mouse skeletal muscle fiber using electrophysiological, cellular and molecular approaches. By combining the technique of manganese quenching of Fura-2 fluorescence and voltage clamp, our data first demonstrate that calcium enters muscle cell in a passive manner driven by the electro-chemical gradient without generating current, while during activity, a calcium influx activated by SR depletion and an influx evoked by depolarization, both electrically silent, occur in parallel with the calcium entry supported by voltage-dependent L-type calcium channels. The second part of the work investigates the properties of the TRPC1 protein whose functional role remains controversial in skeletal muscle. In contrast to data reported in the literature, our TRPC1 over- expression experiments indicate that TRPC1 is localized in the longitudinal SR where it operates as a calcium leak channel. In the last part of the work, we describe that the amplitude of the voltage-dependent L-type calcium channels is reduced in the muscle fiber from a murine model of centronuclear myopathy induced by a deficiency in the lipid phosphatasemyotubularin.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les canaux calciques neuronaux activés par le potentiel électrique de membrane (VGCCs) représentent une des voies majeures d'entrée du calcium dans la cellule nerveuse, où ils participent activement aux processus moléculaires de la transmission synaptique. De ce fait, leur activité est finement régulée, afin de garantir une parfaite coordination entre le flux calcique et les processus cellulaires qui lui sont associés. Aussi, les récepteurs couplés aux protéines G hétérotrimériques (RCPGs) occupent un rôle central dans le rétrocontrôle négatif de l'activité des VGCCs suite à la libération de neuromédiateurs. Cette régulation, directe et spatialement délimitée, est conduite par le dimère Gβγ, dont la fixation sur différents déterminants structuraux de la sous-unité Cav2.x conduit à l'inhibition drastique du courant calcique (régulation "ON"), indépendamment de la présence d'une sous-unité β. Le décrochage du dimère Gβγ, en réponse à l'activation du canal, reverse cette inhibition, et induit un ensemble de modifications phénotypiques apparentes de l'activité du canal (régulation "OFF"). Aussi, nous avons mis en évidence que la notion de "reluctance", décrite par le shift dépolarisant de la courbe d'activation du canal, communément accepté comme un caractère de la régulation "ON", ne traduit en définitive qu'une caractéristique particulière de la régulation "OFF". En revanche, la fixation du dimère Gβγ sur la sous-unité Cav2.x, est à l'origine d'un ralentissement de la cinétique d'inactivation du canal, et représente un caractère nouveau de la régulation "ON". Enfin, nous avons caractérisé l'implication majeure de l'inactivation rapide du canal, dans le caractère "OFF" de cette régulation. L'inactivation se présente comme un catalyseur du décrochage du dimère Gβγ, et délimite une fenêtre temporelle durant laquelle le processus peut avoir lieu. Ensemble, ces résultats permettent une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires à la base de la régulation directe de l'activité synaptique par les récepteurs couplés aux protéines G hétérotrimériques.

Thèse de doctorat : Médecine : Nancy 1 : 2005. / Titre provenant de l'écran-titre.

Les canaux calciques dépendants du voltage sont impliqués dans de nombreux processus cellulaires tels que la contraction musculaire, la libération des neurotransmetteurs et la régulation de l’expression génique. Ces canaux sont constitués d’une sous-unité canalaire α1, qui permet l’entrée des ions calciques dans le milieu intracellulaire, généralement associée à différentes sous-unités auxiliaires (α2δ, γ et β) qui régulent les fonctions du canal. La sous-unité auxiliaire β (Cavβ) joue un rôle capital dans l’adressage membranaire du canal et dans la régulation de ses propriétés biophysiques. Des études récentes décrivent cette sous-unité comme une protéine multifonctionnelle capable d’accomplir des fonctions indépendantes du canal. Quatre différentes isoformes de Cavβ sont codées par 4 gènes différents et caractérisées par des similarités structurales mais une distribution tissulaire différente. L’isoforme Cavβ4 est principalement exprimée dans le cerveau et le cervelet jouant ainsi un rôle important dans la régulation des courants calciques neuronaux. L’importance des fonctions neuronales de Cavβ4 a été soulignée par le fait que la mutation R482X de Cavβ4 a été associée à une forme d’épilepsie humaine.Mon travail de thèse a porté sur l’étude du rôle de Cavβ4 dans le contrôle de la division cellulaire et son implication dans la voie de signalisation Wnt. J’ai également étudié l’influence de la mutation R482X sur cette nouvelle fonction de Cavβ4.Dans ce but, des cellules CHO exprimant de manière stable Cavβ4 ou son mutant épileptique (Cavβ1-481) ont été générées et la localisation subcellulaire des deux protéines ainsi que leur implication dans la prolifération et la progression du cycle cellulaire ont été étudiées. Dans ces cellules, Cavβ4 subit une translocation nucléaire et se retrouve préférentiellement dans les nucléoles. Néanmoins, la délétion de 38 acides aminés de l’extrémité C-terminale de Cavβ4, correspondante à la mutation R482X, empêche sa translocation nucléolaire. L’expression de Cavβ4 réduit considérablement la capacité proliférative des cellules. Cette réduction semble être dépendante de la localisation nucléaire, voir nucléolaire de Cavβ4, parce que le mutant Cavβ1-481 n’induit aucune inhibition de la prolifération. D’un autre côté, l’expression de chacune de ces protéines entraine une modification du cycle cellulaire et l’altération de l’expression de certains gènes liés au cycle.Étant donné que la voie de signalisation Wnt/β-caténine est connue comme l'une des voies les plus importantes contrôlant la prolifération cellulaire, j’ai étudié l'effet de l’expression de Cavβ4 sur cette voie. J’ai ainsi pu montrer que Cavβ4, mais pas Cavβ1-481, réduit considérablement la transcription des gènes cibles de la β-caténine et ralenti la prolifération cellulaire. Cette inhibition est due à une interaction directe entre Cavβ4 et TCF4 qui empêche l’interaction de TCF4 avec la β-caténine et prévient la transcription des gènes cibles.L’ensemble de ces résultats suggèrent que Cavβ4 peut jouer un rôle dans le contrôle de la prolifération au cours du développement, en particulier dans les cellules neuronales. / The voltage gated calcium channels are involved in many cellular processes such as muscle contraction, neurotransmitter release and regulation of gene expression. These channels consist of the pore-forming subunit α1 usually associated with different regulatory subunits: α2δ, β and γ. The auxiliary subunit β (Cavβ) plays a key role in regulating membrane trafficking of the channel and its biophysical properties. Recent studies describe this subunit as a multifunctional protein that can also perform calcium channel-independent functions such as gene regulation. Four different isoforms of Cavβ are encoded by 4 different genes and are characterized by structural similarities but different tissue distribution. Cavβ4 isoform is mainly expressed in the brain and cerebellum, thus, playing an important role in the regulation of neuronal calcium currents. The importance of Cavβ4 neuronal functions has been highlighted by its R482X mutation that was associated to a form of human epilepsy.The aim of my thesis was to study the role of Cavβ4 in the control of cell division and its involvement in the Wnt signaling pathway. I also studied the influence of the R482X mutation on this new function of Cavβ4.To this end, CHO cells stably expressing Cavβ4, or its epileptic mutant (Cavβ1-481), were generated and the subcellular localization of the two proteins and their implication in the proliferation and cell cycle progression were studied. In these cells, Cavβ4 undergoes nuclear translocation and is found preferentially in the nucleoli. However, the deletion of 38 amino acids in the C-terminus domain of Cavβ4, corresponding to the R482X mutation, prevents its nucleolar translocation. In addition, the expression of Cavβ4 significantly reduces the proliferative rate of the cells. This reduction seems to be linked to Cavβ4 nuclear localization because the epileptic mutant is unable to slow down cell proliferation. On the other hand, the expression of each of these proteins is able to deregulate cell cycle progression and to alter the expression of many genes linked to the cycle.Since the Wnt/β-catenin pathway is known as one of the most important pathways controlling cell proliferation, I studied the effect of Cavβ4 expression on this signaling pathway. Indeed, Cavβ4, but not Cavβ1-481, substantially reduces the transcription of β-catenin-dependant genes and therefore slows down cell proliferation. This inhibition is due to a direct interaction between Cavβ4 and TCF4 that prevents the interaction of TCF4 with β-catenin, and thereafter negatively regulates the transcription of targeted genes.These findings suggest that Cavβ4 can play a role in the control of proliferation during development, particularly in neuronal cells.

Nouvelles voies de modulation des canaux calciques de type T.Grâce à leur rôle dans l'excitabilité cellulaire et l'homéostasie calcique, les canaux calciques de type T participent à différentes fonctions physiologiques telles que le sommeil ou le contrôle du rythme cardiaque et de la pression artérielle. Ils sont également impliqués dans certaines pathologies comme la douleur ou l'épilepsie. La régulation de l'activité des canaux de type T est encore mal connue et c'est l'enjeu de cette thèse. Dans une première partie, nous avons caractérisé l'effet de certains lipides endogènes sur ces canaux, en particulier les métabolites de l'acide arachidonique, et identifié le 5,6-EET comme un nouveau bloqueur des canaux de type T. Nous avons ensuite évalué l'existence d'un site de liaison des lipoamino acides sur les canaux de type T à l'aide d' d'expériences de compétitions réalisées avec un inhibiteur spécifique de ces canaux, la molécule TTA-A1.Dans une deuxième partie, nous avons étudié la régulation par le calcium des canaux de type T. Nous avons montré que l'entrée de calcium par les canaux T eux-mêmes ou par activation des récepteurs P2X4 et NMDA induisait une inhibition du courant de type T. Le calcium activerait une phosphatase qui provoquerait un déplacement de la courbe d'inactivation à l'état stable vers les potentiels négatifs, réduisant ainsi la disponibilité des canaux. Ce phénomène d'inhibition du courant lié à l'entrée du calcium pourrait être un mécanisme de rétrocontrôle négatif limitant l'entrée de calcium dans la cellule afin d'éviter une toxicité provoquée par une concentration de calcium intracellulaire trop élevée. Suite à cette inhibition, lorsque l'entrée de calcium est arrêtée, le courant augmente. Cette augmentation semble être due à l'intervention de la protéine kinase Pak qui rendrait les canaux de type T disponibles.En conclusion, nous avons identifié et caractérisé deux nouveaux mécanismes endogènes de régulation des canaux de type T : une modulation par les lipides, et une modulation par les calcium et la protéine kinase Pak. / New pathways of regulation of T-type calcium channels.Thanks to their role in cellular excitability and calcium homeostasis, T-type calcium channels are involved in several physiological functions such as sleep or control of cardiac rythmicity and vascular tone. They are also involved in some diseases such as pain or epilepsy. The regulation of T-type calcium channels is still poorly understood and that is the challenge of this thesis.In a first part of the study, we caracterised the effect of some endogenous lipids on these channels, particularly the metabolites of arachidonic acid, and identified the 5,6-EET as a new blocker of T-type channels. We then evaluated the existence of a binding site of lipoamino acids on T-type channels using binding experiments made with a specific inhibitor of these channels, the TTA-A1 molecule.In a second part, we studied the regulation of T-type channels by calcium. We showed that a calcium entry through T-type channels or through P2X4 and NMDA receptors activation induced an inhibition of T-type current. Calcium would activate a phosphatase which would trigger a shift of the steady-state inactivation curve toward negative potentials, reducing the availability of channels. This phenomenon of current inhibition due to calcium entry may be a feedback mechanism limiting calcium entry in the cell to avoid toxicity due to a too high intracellular calcium concentration. After this inhibition, when calcium entry is stopped, the current increases. This increase seems to be due to the intervention of the Pak protein kinase which would make T-type channels available again.In conclusion, we studied and caracterised tow new mechanisms of T-type channels regulation: a modulation by lipids, and a modulation by calcium and the Pak protein kinase.

Le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) est une cible rationnelle pour les traitements anticancéreux des carcinomes épidermoïdes (CE). Cependant, seule une petite fraction de patients présente des avantages cliniques. Afin de comprendre l’échec de ces thérapies, j’ai étudié la voie de signalisation de l’EGFR en présence de fibroblastes associés aux carcinomes (FAC), principales cellules non malignes au sein des tumeurs. J'ai démontré que dans les CE, la voie de signalisation de l’EGFR coopère avec la rigidité de la matrice extracellulaire (MEC) induite par les FAC. Par la suite, j'ai cherché à résoudre les voies moléculaires qui sous-tendent cette coopération afin d'identifier de nouvelles cibles pharmaceutiques. Grâce à un criblage d'inhibiteurs pharmacologiques, j’ai identifié le vérapamil et le diltiazem, bloqueurs des canaux calcique CaV1, comme étant de puissants inhibiteurs de l'invasion des CE. Au niveau moléculaire, j'ai révélé que la rigidité de la MEC dérivée de la tumeur et la signalisation de l'EGFR déclenchent l'augmentation du calcium intracellulaire par le canal CaV1.1 dans les CE. Le blocage de l'activité de ces canaux inhibe l’invasion et la prolifération des cellules tumorale in vitro. Plus important encore, je démontre une forte réduction du développement des tumeurs dans deux modèles in vivo, à la fois dans un modèle de xénogreffe de cellules dérivées de patient atteint de carcinome de la tête et du cou, et dans un modèle CE cutané chez la souris. Par conséquent, je suggère une réaffectation du vérapamil et du diltiazem en tant qu’agents anticancéreux. / Epidermal growth factor receptor (EGFR) is a rational target for squamous cell carcinoma (SCC) anticancer therapies, nevertheless; only a subset of patients shows clinical benefits. I demonstrated a cooperation between EGFR signaling and extracellular matrix (ECM) stiffness that could explain this phenomenon. I sought to resolve the molecular pathway underlying this cooperation in SCC proliferation and expansion in order to identify new pharmaceutical targets. Screening of pharmacological inhibitors, in an in vitro 3-D assay, identified verapamil and diltiazem, FDA approved L-type calcium channels inhibitors, as potent blockers of SCC invasion. Mechanistically, I revealed that tumor-derived ECM stiffness and EGFR signaling trigger increased of intracellular calcium through the L-type CaV1.1 channel in SCC. Blocking L-type calcium channels activity resulted in reduced SCC cells invasion and proliferation in vitro. More importantly, I also demonstrate a strong reduction in tumor development in two in vivo models, both head and neck patient derived xenograft and skin SCC mice model. Consequently, I suggest a repurpose of verapamil and diltiazem to anti-cancer agents.