Les venins issus d’animaux sont des mélanges complexes de substances toxiques ou non qui sont utilisées pour se défendre contre des prédateurs et/ou pour chasser. Le venin est une solution contenant de nombreux composés avec une part prédominante pour les protéines et les peptides. Le venin d’un seul animal peut contenir plusieurs centaines de substances différentes. Les peptides dérivés du venin peuvent cibler des récepteurs membranaires et des canaux ioniques avec une grande affinité et une haute spécificité. Les animaux venimeux les plus connus sont les serpents, les scorpions et les araignées, et leurs toxines sont largement utilisés dans la recherche comme outils moléculaires et pour le développement des nouveaux traitements. Par conséquent, les venins d’animaux sont des sources naturelles extrêmement riches de découverte de molécules biologiquement actives. Dans ces études, nous avons criblé le venin du serpent égyptien Walterinnesia aegyptia pour l’identification de novo de peptides capables d’activer la motilité des spermatozoïdes in vitro des souris OF1. La Spermatin et X sont deux peptides de 57 et 63 acides aminés respectivement, isolés du venin du Walterinnesia aegyptia par la technique de séparation RP-HPLC suivie par la chromatographie échangeuse de cations. La spermatin et l’actiflagelin sont deux activateurs de la motilité spermatique des souris OF1. La spermatin a été séquencé par séquençage de novo en utilisant i) la digestion des peptides par des enzymes protéases comme la trypsine, la chymotrypsine et la protéase V8, et ii) les techniques de spectrométrie de masse TOF/TOF MS/MS et LC-ESI-QTOF MS/MS. Par contre, c’est la complémentarité entre le séquençage de novo, la dégradation d’Edman et les analyses ESI MS/MS qui a permis l’identification de la séquence de l’actiflagelin. Il semble dès lors que la spermatin et l’actiflagelin peuvent être utilisés comme outils pharmacologiques pour diminuer le taux d’infertilité. De l’autre côté, la maurocalcine (MCa) est un peptide de 33 résidus issu du venin du scorpion tunisien Scorpio maurus palmatus. La MCa est un activateur des récepteurs de ryanodine (RyR1) des muscles squelettiques. Elle stimule fortement la liaison du [³H]-ryanodine aux RyR1 et assure le relâchement du calcium intracellulaire des vésicules du réticulum sarcoplasmique (RS). Différents mutants de la MCa ont été utilisés et les résultats montrent que l’Arg24 joue un rôle critique dans la liaison de la MCa aux RyR1 ou tout au moins dans son impact fonctionnel. D’autres mutations de la MCa sont capables de modifier la liaison du [³H]-ryanodine aux RyR1 mais avec une plus faible efficacité que la séquence sauvage. De plus, la MCa est capable de franchir la membrane plasmique et elle est considérée comme un peptide de pénétration cellulaire. Ici, nous avons montré que la MCa est un substrat de la protéine kinase A in vitro suite à la phosphorylation du résidu Thr26. Nous avons aussi démontré que la MCa P-Thr26 inverse l’effet de la MCa. La MCa P-Thr26 inhibe la liaison du [³H]-ryanodine aux RyR1 des muscles squelettiques du lapin et elle est incapable de favoriser la libération du calcium des vésicules du RS. Alors, la MCa peut être utilisée pour le développement des analogues résistants à la phosphatase. Par ailleurs, nous avons étudié l’effet de l’agent réducteur dithiothreitol ou les agents oxydants le diamide et le peroxyde d’hydrogène sur la stimulation du RyR1 par la MCa ou MC E12A. La maurocalcine améliore la liaison du [³H]-ryanodine aux RyR1 des vésicules seules ou pré-incubées avec le dithiothreitol ou les agents oxydants. L’interprétation des résultats indiquent que la MCa et son mutant sont plus efficaces à activer RyR1 sous des conditions de réduction. Par ailleurs, des résultats ont montré que MCa E12A réduit significativement l’inhibition de la liaison du [³H]-ryanodine aux RyR1 induite par Mg²⁺. / Animal venoms are complex mixtures of toxic substances that are used to defend themselves against predators and / or to hunt. Venom is a solution containing many compounds, especially proteins and peptides. The venom of a single animal may contain several hundred different substances. Peptides derived from venom can target membrane receptors and ion channels with strong affinity and high specificity. The best known venomous animals are snakes, scorpions and spiders, and their toxins are widely used in research as molecular tools and for the development of new treatments. Therefore, animal venoms are an extremely rich and complex source of biologically active molecules. In these studies, we screened the venom of the Egyptian snake Walterinnesia aegyptia for the discovery of peptides able to activate sperm motility in vitro of mice OF1. Spermatin and actiflagelin are two peptides of 57 and 63 amino acids, respectively, isolated from the venom of Walterinnesia aegyptia by the RP-HPLC separation technique followed by cation exchange chromatography. Spermatin and actiflagelin are two activators of the spermatic motility of OF1 mice. Spermatin was sequenced by de novo sequencing using digestion of enzymes proteases such as trypsin, chymotrypsin and V8 protease, and further TOF / TOF MS / MS and LC-ESI-QTOF MS / MS. While the complementarity between de novo sequencing, Edman degradation and ESI MS / MS analyzes allowed the identification of the sequence of actiflagelin. Then, Spermatin and actiflagelin can be used as pharmacological tools to decrease the rate of infertility. On the other hand, maurocalcin (MCa) is a 33-residue peptide derived from the venom of the scorpion Scorpio maurus palmatus. MCa is an activator of ryanodine receptors (RyR1) of skeletal muscles. It strongly stimulates the binding of [³H]-ryanodine to RyR1 and ensures the release of intracellular calcium from the vesicles of the sarcoplasmic reticulum (SR). Different MCa mutants were used and the results showed that Arg24 plays a critical role in the binding of MCa to RyR1. Other mutations were able to alter the binding of [³H]-rhyanodine to RyR1 but with low efficiency. In addition, MCa is able to cross the plasma membrane and is considered a cell-penetrating peptide. Here, we have shown that MCa is a substrate of PKA in vitro following the phosphorylation of Thr26. We have also demonstrated that MCa P-Thr26 reverses the effect of MCa. MCa P-Thr26 inhibits the binding of [³H]-ryanodine to RyR1 from the rabbit skeletal muscle, and is unable to promote the release of calcium from the SR vesicles. Then, MCa can be used for the development of phosphatase resistant analogs.Keywords: Animal venom, Walterinnesia aegyptia, RP-HPLC, ion exchange chromatography, de novo sequencing, Spermatin, X, maurocalcine (MCa), [³H]-ryanodine, ryanodine receptors (RyR1), calcium, phosphorylation, sarcoplasmic reticulum (SR).

La maurocalcine (MCa) est un peptide/toxin de 33 acides aminés initialement isolé du venin d'un scorpion Tunisien Scorpio maurus palmatus. Depuis ce travail pionnier, la molécule a pu être produite par synthèse chimique sans altération structurale. Trois raisons font que ce peptide est particulièrement intéressant. D'une part, il présente une homologie de séquence avec un domaine de canal calcium dépendant du potentiel qui est impliqué dans le couplage excitation-contraction. Cette homologie est utile pour déchiffrer les bases mécanistiques de la mobilisation calcium du réticulum sarcoplasmique. D'autre part, la MCa est un activateur puissant du récepteur à la ryanodine, déclenchant de cette manière la libération de calcium des stocks intracellulaires. Finalement, ce peptide a une valeur technologique en raison de sa capacité à transporter des composés imperméables au travers de la membrane plasmique. Dans ce travail de thèse, j'ai planifié de nouveaux analogues plus efficaces de la maurocalcine, soit par des substitutions uniques d'acides aminés ou en remplaçant l'ensemble des cystéines par des acides aminés isostériques. Ces analogues possèdent des efficacités de pénétration cellulaire équivalente ou supérieure, présentent des toxicités cellulaires limitées et n'ont pas d'activités pharmacologiques sur le récepteur à la ryanodine. J'ai analysé l'interaction de ces analogues avec des lipides membranaires et des glycosaminoglycans de surface, et le rôle de ces composants dans la pénétration cellulaire de la MCa. L'entrée cellulaire de la MCa se produit par macropinocytose quand ce peptide se fixe à la streptavidine.

La Maurocalcine (MCa), excellent peptide de pénétration cellulaire (CPP, Cell Penetrating Peptide) issu du venin de scorpion, présente un grand intérêt pour des applications d'administration intracellulaire de molécules ou de nanoparticules expérimentales ou thérapeutiques. Afin de développer ces applications, le peptide a auparavant subi une série d'optimisations, dont la suppression de l'activité biologique native et l'élimination des ponts disulfures intramoléculaires. Dans le présent travail, nous avons poursuivi l'optimisation du peptide par la réduction de la taille. Ensuite, nous avons développé une des applications possibles du peptide consistant en la vectorisation d'un nanobiodétecteur du Ca2+ intracellulaire.La taille de la MCa native (33 résidus) est plus longue que celle des CPPs populaires, telles que la Tat et la pénétratine (13 et 16 résidus, respectivement). Pour réduire la taille du peptide, nous avons procédé à la troncation de la MCa linéaire antérieurement conçue. Douze nouveaux puissants CPPs de taille réduite ont été produits, dont la MCaUF1-9 qui s'est révélée la plus efficace de tous à de faibles concentrations. Le CPP MCaUF1-9 paraît donc très intéressant pour des applications utilisant de faibles concentrations. La caractérisation approfondie de la MCaUF1-9 a montré sa meilleure efficacité en pénétration cellulaire comparativement à Tat, à pénétratine, et à de petits analogues dérivés des peptides de la même famille de calcine, à l'exception de l'hadrucalcineUF1-11 (HadUF1-11) et de l'hadrucalcineUF3-11 qui se sont révélés plus performants.En guise d'application, l'analogue le plus efficace en pénétration cellulaire, l'HadUF1-11, a été efficacement utilisé comme vecteur pour la délivrance intracellulaire d'un nanobiodétecteur du Ca2+ cytoplasmique formé d'un quantum dot recouvert des molécules indicatrices de Ca2+(CaRuby).Les petits analogues de MCa (dérivés de MCa ou des autres peptides de la famille de calcine) pourraient être des CPPs de choix pour divers types d'applications de délivrance intracellulaire. Pour le confirmer (ou l'infirmer) leur caractérisation extensif est nécessaire.Mots clés: Maurocalcine, hadrucalcine, nanoparticules, quantum dots, pénétration cellulaire, nanobiodétecteur de Ca2+. / The Maurocalcine (MCa), an excellent cell penetrating peptide (CPP) from the scorpion venom, presents a real interest for the development of applications for the intracellular delivery of experimental or therapeutic molecules or particles. In order for these applications to be developed, the peptide previously underwent a series of optimization processes, such as the suppression of native biological activity and the removal of intramolecular disulfide bonds. In this research, we carried on the optimization by reducing the size of the MCa and then developed one among other possible applications of this peptide which consists of the vectorization of the intracellular Ca2+ nanobiosensor.The native size of MCa (33 residues) is much longer than the size of popular CPPs such as Tat and penetratin (13 and 16 residues, respectively). To reduce the size of the peptide, we truncated the previously designed linear MCa. Twelve new powerful small CPPs were produced, among which the MCaUF1-9 that was the best in cell penetration at low concentrations. Thus, the MCaUF1-9 appears very interesting for applications that require low concentrations. The MCaUF1-9 was further characterized and happened to be more efficient in cell penetration than the Tat, the penetratin, and other small analogous peptides derived from the peptides belonging to the same family as the MCa's, except from the hadrucalcineUF1-11 (HadUF1-11) and the hadrucalcinUF3-11 which showed best performance.As application, the most efficient analogous in cell penetration, the HadUF1-11, was efficiently utilized as a vector for the intracellular delivery of an intracellular Ca2+ nanobiosensor composed of a quantum dot coated with Ca2+ indicator (CaRuby) molecules.Small MCa analogous (derived from MCa or the other peptides of the calcine family) might be the choice CPPs for diverse intracellular delivery applications. In order to confirm this, their extensive characterization is necessary.Key words: Maurocalcine, hadrucalcine, nanoparticles, quantum dots, cell penetration, Ca2+ nanobiosensor.

La maurocalcine (MCa) est une toxine de 33 acides aminés initialement issue du venin du scorpionScorpio maurus palmatus, et est considérée comme faisant partie de la famille des CPP(Cell Penetrating Peptides) depuis de nombreuses années déjà. La MCa présente donc un intérêtthérapeutique certain dans le domaine de la délivrance intracellulaire de cargos, et lestravaux exposés ici cherchent à caractériser au mieux les propriétés de pénétration de la moléculenative ainsi que celle de certains de ses variants.Après avoir quantifié l’internalisation de plusieurs variants tronqués (linéaires), j’ai pu mettreen évidence le fait que tous ces analogues testés ont une capacité à être internalisés bien plusélevée que celle des CPP de référence (notamment Tat et la pénétratine). Parmi ces variants,l’analogue MCaUF1−9 présente l’avantage d’un temps de rétention relativement élevé au seindes cellules, ainsi que d’une accumulation légèrement accrue en environnement acide (ce quiadvient lors de la formation tumeurs solides). Ce nouveau CPP possède donc un certain potentielthérapeutique mais l’étude de la MCa native, remarquablement stable in vivo, reste plusque jamais d’actualité. / Maurocalcine (MCa) is a 33-mer toxin originally isolated from the venom of the scorpioScorpio maurus palmatus, and has been considered as a cell-penetrating peptide (CPP) for severalyears. MCa presents a therapeutic interest for the intracellular delivery of cargoes, andthis thesis aims to characterise the cell penetration properties of the native molecule as well assome of its variants’.After quantifying several truncated (linear) variants’ internalisation, I have been able tohighlight the fact that all of those analogs possess a higher internalization ability than those ofstandard CPP (especially Tat and penetratin). Among those variants, the analog MCaUF1−9 hasa relatively high rentention time within cells, as well as a slightly increased accumulation whenin an acidic environment (which occurs during solid tumours formation). This new CPP showsa certain therapeutic potential but the study of nativeMCa, remarkably stable in vivo, remainsa priority.

Les glioblastomes sont des tumeurs cérébrales qui sont extrêmement agressives, et qui, en dépit de l'arsenal thérapeutique (chirurgie, radiothérapie ou chimiothérapie), ne laissent pas plus de 16 mois d'espérance de vie aux patients. Dans le cadre de cette thèse, nous proposons d'utiliser certaines toxines en tant que vecteurs pour l'administration de médicaments anticancéreux, et notamment pour le traitement du gliome. Les travaux présentés ici se concentrent sur l’utilisation de variants de la maurocalcine (MCa) et des analogues de la chlorotoxine (CTX). La MCa est une toxine issue du venin du scorpion Scorpio maurus palmatus, qui est capable de pénétrer dans les cellules facilement et rapidement. Il a été prouvé que la MCa peut entrer dans la cellule avec une cargaison. C’est en exploitant cette capacité présente chez deux de ces variants que nous avons synthétisé avec succès deux nouveaux composés à base de cette toxine avec de la doxorubicine et un dérivé du platine. Les études de toxicité et de caractérisation de ces composés qui ont été réalisé on permit de mettre en évidence l’intérêt et le potentiel de la MCa. La seconde partie de ces travaux de thèse portée sur la CTX et des peptides semblables, également extrait de venin de scorpion. Ils ont la particularité de fixer / interagir uniquement avec les cellules cancéreuses d'origine gliale. Après une rapide caractérisation de ces analogues de la CTX, l’un d’eux la Lqh-8/6 a été utilisé avec succès pour l'administration ciblée de doxorubicine. L’ensemble des travaux menés durant cette thèse constitue une base de départ solide pour une amélioration des systèmes de vectorisation, surtout en cancérologie de molécules actives. De plus ces résultats mettent aussi en avant l’avantage de l’utilisation d’un système de couplage « universel » basé sur la chimie click. / Glioblastoma are cerebral tumors that are extremely aggressive, and that, in spite of a battery of therapeutic interventions (surgery, radiotherapy or chemotherapy), leave no more than 16 months life expectancy to the patients. As part of this thesis, we propose to use some selected toxins as vectors for the delivery of anticancer drugs, and namely for the treatment of glioma. The works presented here concentrate on the use of variants of maurocalcine (MCa) and the analogues of chlorotoxine (CTX). MCa is a toxin from of the scorpion Maurus palmatus that has cell penetrating propriety. It has been proved that MCa can enter the cell with cargoes. While exploiting this present capacity to two of these variants we synthesized successfully two new compounds with this toxin with the doxorubicine and a by-product of the platinum. Toxicity studies and characterization of these compounds that have been made were permitted to highlight the interest and potential of the MCa. The second part of the thesis work focused on the CTX and similar peptides, also extracted from scorpion venom. They have the particularity to fix/ interact only with cancer cell from neuroectodermal origin. After a fast characterization of these analogues of CTX, one of them (Lqh-8/6) was successfully used for the targeted administration of doxorubicin. All work conducted during this thesis constitutes a solid starting point for an improvement of the systems of vectorization of active molecules, especially in cancer research Moreover, these results also emphasize the advantage of the use of a system of "universal" coupling based on the click chemistry.

L'excitation nerveuse d'une cellule musculaire produit une libération massive dans le cytoplasme du Ca2+ stocké dans le réticulum sarcoplasmique (RS). L'augmentation de la concentration cytoplasmique de Ca2+ déclenche la contraction. Ce processus, appelé couplage excitation contraction (CEC), requiert des interactions physiques entre deux canaux calciques : (1) le récepteur des dihydropyridines (DHPR), un canal calcique activé par le voltage ; le DHPR est composé de plusieurs sous-unités, dont la sous-unité α1S, qui forme le canal et le détecteur de potentiel, et la sous-unité β1a, entièrement cytoplasmique; (2) le récepteur à la ryanodine (RyR1) responsable de la libération de Ca2+ hors du RS. La sous unité β1a interagit avec la sous-unité α1S et RyR1. Au cours de ma thèse, j'ai identifié de nouveaux déterminants moléculaires et structuraux de l'interaction DHPR/RyR1. J'ai ainsi démontré l'existence d'interactions intramoléculaires entre les différentes boucles cytoplasmiques de la sous-unité α1S du DHPR, centrées autour d'un domaine appelé domaine A. J'ai également localisé le site d'interaction de la cavéoline-3 sur une boucle cytoplasmique de la sous-unité α1S. L'étude de l'interaction de la sous-unité β1a avec RyR1 a montré (1) que la région C-terminale de β1a contrôle cette interaction, (2) que l'affinité apparente de β1a pour RyR1 est fortement augmentée par l'interaction de β1a avec α1S et (3) que l'interaction β1a/RyR1 régule la fermeture du RyR. L'utilisation d'une toxine, la maurocalcine (MCa) qui se comporte comme un analogue du domaine A m'a permis d'identifier un domaine minimal de RyR1 responsable de la fixation de la MCa et du domaine A. Une étude structurale par RMN de ce site a été réalisée. Enfin, j'ai étudié l'effet de la MCa sur des myotubes n'exprimant pas la sous-unité α1S. J'ai montré que la MCa est capable de restaurer, en absence de DHPR, une augmentation de la concentration de Ca2+ cytoplasmique induite par la dépolarisation de la membrane plasmique.