Summary : Macropinocytosis refers to the formation of large primary endocytic vesicles of irregular size and shape, generated by actin-driven evaginations of the plasma membrane, whereby cells avidly incorporate extracellular solutes. Macropinosomes resemble "empty" phagosomes and show no difference with the "spacious phagosomes" triggered by the enteropathogenic bacteria Salmonella and Shigella. Macropinosomes are formed at the leading edge and appear tightly regulated. They may fuse with lysosomes or regurgitate their content back to the extracellular space. Transformation of fibroblasts by Src or Ras results into the constitutive formation of macropinosomes at "ruffling" zones. My thesis adresses the dynamic of the constitutive macropinocytosis and its potential regulators. The first part of the thesis deals with the fate of macropinosomes. We found that, in v-Src transformed fibroblasts, macropinosomes do not fuse with transferrin-containing endosomes and investigated the effects of cyclic AMP as a regulator of macropinocytosis in this cell system. The permeant analogs dibutyryl cyclic AMP and 8-bromo-cyclic AMP, as well as the pharmacological activator of adenylate cyclase, forskolin, similarly decreased by about 35% the net endocytic accumulation of the fluid-phase tracer, horseradish peroxidase, in v-Src-transformed cells but not in the non-transformed parental Rat-1 cell line. However, and in contrast to the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) inhibitors and phosphatidylinositol-specific phospholipase C (PI-PLC), dibutyryl cyclic AMP neither returned the peroxidase accumulation rate of v-Src-transformed cells to that of parental Rat-1/control cells, nor prevented macropinosome formation, as shown by confocal microscopy. Detailed analysis of the kinetics of peroxidase entry and efflux in transformed cells revealed that dibutyryl cyclic AMP inhibited its accumulation only after intervals >5 minutes, due to accelerated regurgitation, but did not alter the rate of transferrin recycling. Taken together, these data indicate that, in v-Src-transformed fibroblasts, macropinocytosis and micropinocytosis serve different pathways and that cyclic AMP affects neither micropinocytosis nor the formation of macropinosomes, but selectively promotes regurgitation therefrom. The second part of my thesis deals with the regulation of macropinocytosis. Both transformation of Rat-1 fibroblasts by v-Src or K-Ras and stable transfection with an expression vector for wild-type PI3K regulatory subunit p85a, acting as dominant-positive PI3K, constitutively lead to stress fibers disruption, cortical actin recruitment, extensive ruffling and macropinosome formation, as measured by a selective acceleration of fluid-phase endocytosis. These alterations closely correlated with activation of PI3K and PI-PLC, as assayed by 3-phosphoinositides synthesis in situ and in vitro and IP3 steady state levels, respectively, and were abolished by stable transfection of Src-transformed cells with an expression vector for truncated p85a, acting as dominant-negative PI3K, as well as by pharmacological inhibitors of PI3K and PI-PLC, indicating requirement for both enzymes. These inhibitors strongly decreased the population of cells showing active membrane ruffling and did not detectably affect receptor-mediated endocytosis of transferrin. Interestingly, the effect of Src and dominant-positive p85a transfection on the actin cytoskeleton could be reversed within 30-60 min by the pharmacological inhibitor of PI3K, wortmannin. Whereas PI3K activation resisted PI-PLC inhibition by NCDC, PI-PLC activation was abolished by the PI3K inhibitor wortmannin and upon dominant-negative PI3K transfection, thus placing PI-PLC downstream of PI3K. Taken together, these data suggest that permanent sequential activation of both PI3K and PI-PLC is necessary for the dramatic reorganization of actin cytoskeleton in oncogene-transformed fibroblasts resulting into constitutive ruffling and macropinocytosis.Résumé : La macropinocytose désigne la formation de grandes vésicules endocytaires primaires de taille et de forme irrégulière, produites par évagination de la membrane péricellulaire, qui permet l'accumulation accélérée de solutés extracellulaires. Il existe une forte similitude entre les macropinosomes et les "phagosomes spacieux" induits par des bactéries entéropathogènes telles que Salmonella et Shigella. Les macropinosomes de forment préférentiellement au front de migration et peuvent fusionner avec les lysosomes ou recycler leur contenu vers le milieu extracellulaire (régurgitation). La transformation de fibroblastes Rat-1 par les oncogènes v-Src ou K-Ras induit la formation constitutive de macropinosomes au niveau des zones du "ruffling". Notre travail s'est intéressé à la dynamique de cette macropinocytose constitutive et à ses régulateurs potentiels. La première partie de ma thèse concerne le sort des macropinosomes dans les fibroblastes transformés par v-Src. Ceux-ci ne fusionnent pas avec les endosomes contenant la transferrine. Pour tester l'effet de l'AMP-cyclique sur cette macropinocytose, nous avons utilisé deux analogues perméants de l'AMPc, le dibutyryl AMP-cylique et le 8-bromo-AMP-cyclique, ainsi qu'un activateur de l'adénylate cyclase, la forskoline. Ces trois agents ralentissent d'environ 35% la vitesse de l'accumulation nette d'un traceur de l'endocytose fluide, la peroxydase de raifort, dans les cellules transformées par v-Src, mais n'ont pas d'effet dans la lignée parentale. Cependant, au contraire d'inhibiteurs de la phospho-inositide 3-kinase (PI3K) ou d'inhibiteurs de la phospholipase C spécifique du phosphatidylinositol (PI-PLC), le dibutyryl AMP-cyclique ne ramène pas le taux d'accumulation de la peroxydase des fibroblastes transformés par v-Src au niveau des fibroblastes parentaux et n'empêche pas la formation de macropinosomes, visualisée en microscopie confocale. L'analyse détaillée de la cinétique d'accumulation de la peroxydase dans les cellules transformées a révélé que le dibutyryl AMP-cyclique ralentit l'accumulation de la peroxydase seulement après un temps supérieur à 5 minutes, en accélérant sa régurgitation, sans affecter le recyclage de la transferrine. Ces résultats montrent clairement que, dans les fibroblastes transformés par v-Src, la macropinocytose et la micropinocytose sont deux voies distinctes et que l'AMP-cyclique n'affecte ni la micropinocytose, ni la formation de macropinosomes, mais active sélectivement la régurgitation à partir de ceux-ci. La seconde partie de ma thèse s'intéresse à la régulation de la formation des macropinosomes. La transformation des fibroblastes Rat-1 par les oncogènes v-Src ou K-Ras ainsi que la transfection stable par un vecteur d'expression de la sous-unité régulatrice sauvage p85a, créant un ²dominant-positif² de la PI3K, provoquent la destruction des câbles de tension, le recrutement de l'actine corticale et la formation du ²ruffling² qui génère les macropinosomes, ce qui est reflété par l'accélération sélective de l'endocytose en phase fluide. Ces altérations corrèlent étroitement avec l'activation de la PI3K et de la PI-PLC, mesurées par la production des phospho-inositides D3 in situ et in vitro et par le niveau de l'IP3 respectivement, et sont abolies après transfection stable par un vecteur d'expression pour la sous-unité p85a tronquée, agissant comme ²dominant-négatif² de la PI3K, ou après traitement des cellules avec les inhibiteurs pharmacologiques de la PI3K et de la PI-PLC. Ceci démontre que ces deux enzymes sont nécessaires dans la signalisation de la macropinocytose constitutive. Ces inhibiteurs diminuent fortement le pourcentage des cellules montrant un ²ruffling² membranaire mais n'affectent pas l'endocytose de la transferrine. La réorganisation du cytosquelette d'actine dans les cellules transformées par v-Src ou dans le ²dominant-positif² de la PI3K est reversée après 30 à 60 minutes de traitement par un inhibiteur de la PI3K, la wortmannine. L'activité de la PI3K n'est pas modifiée par le traitement des cellules avec un inhibiteur de la PI-PLC. En revanche, l'activité de cette dernière est abolie par les inhibiteurs de la PI3K et chez le ²dominant-négatif² de la PI3K. Ceci permet de placer la PI-PLC en aval de PI3K dans la même voie de signalisation de la macropinocytose. En conclusion, une activation permanente et séquentielle de la PI3K et de la PI-PLC est nécessaire au remodelage du cytosquelette d'actine qui produit le ²ruffling² membranaire et la macropinocytose constitutive dans les fibroblastes transformés.

Summary : Macropinocytosis refers to the formation of large primary endocytic vesicles of irregular size and shape, generated by actin-driven evaginations of the plasma membrane, whereby cells avidly incorporate extracellular solutes. Macropinosomes resemble "empty" phagosomes and show no difference with the "spacious phagosomes" triggered by the enteropathogenic bacteria Salmonella and Shigella. Macropinosomes are formed at the leading edge and appear tightly regulated. They may fuse with lysosomes or regurgitate their content back to the extracellular space. Transformation of fibroblasts by Src or Ras results into the constitutive formation of macropinosomes at "ruffling" zones. My thesis adresses the dynamic of the constitutive macropinocytosis and its potential regulators. The first part of the thesis deals with the fate of macropinosomes. We found that, in v-Src transformed fibroblasts, macropinosomes do not fuse with transferrin-containing endosomes and investigated the effects of cyclic AMP as a regulator of macropinocytosis in this cell system. The permeant analogs dibutyryl cyclic AMP and 8-bromo-cyclic AMP, as well as the pharmacological activator of adenylate cyclase, forskolin, similarly decreased by about 35% the net endocytic accumulation of the fluid-phase tracer, horseradish peroxidase, in v-Src-transformed cells but not in the non-transformed parental Rat-1 cell line. However, and in contrast to the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) inhibitors and phosphatidylinositol-specific phospholipase C (PI-PLC), dibutyryl cyclic AMP neither returned the peroxidase accumulation rate of v-Src-transformed cells to that of parental Rat-1/control cells, nor prevented macropinosome formation, as shown by confocal microscopy. Detailed analysis of the kinetics of peroxidase entry and efflux in transformed cells revealed that dibutyryl cyclic AMP inhibited its accumulation only after intervals >5 minutes, due to accelerated regurgitation, but did not alter the rate of transferrin recycling. Taken together, these data indicate that, in v-Src-transformed fibroblasts, macropinocytosis and micropinocytosis serve different pathways and that cyclic AMP affects neither micropinocytosis nor the formation of macropinosomes, but selectively promotes regurgitation therefrom. The second part of my thesis deals with the regulation of macropinocytosis. Both transformation of Rat-1 fibroblasts by v-Src or K-Ras and stable transfection with an expression vector for wild-type PI3K regulatory subunit p85a, acting as dominant-positive PI3K, constitutively lead to stress fibers disruption, cortical actin recruitment, extensive ruffling and macropinosome formation, as measured by a selective acceleration of fluid-phase endocytosis. These alterations closely correlated with activation of PI3K and PI-PLC, as assayed by 3-phosphoinositides synthesis in situ and in vitro and IP3 steady state levels, respectively, and were abolished by stable transfection of Src-transformed cells with an expression vector for truncated p85a, acting as dominant-negative PI3K, as well as by pharmacological inhibitors of PI3K and PI-PLC, indicating requirement for both enzymes. These inhibitors strongly decreased the population of cells showing active membrane ruffling and did not detectably affect receptor-mediated endocytosis of transferrin. Interestingly, the effect of Src and dominant-positive p85a transfection on the actin cytoskeleton could be reversed within 30-60 min by the pharmacological inhibitor of PI3K, wortmannin. Whereas PI3K activation resisted PI-PLC inhibition by NCDC, PI-PLC activation was abolished by the PI3K inhibitor wortmannin and upon dominant-negative PI3K transfection, thus placing PI-PLC downstream of PI3K. Taken together, these data suggest that permanent sequential activation of both PI3K and PI-PLC is necessary for the dramatic reorganization of actin cytoskeleton in oncogene-transformed fibroblasts resulting into constitutive ruffling and macropinocytosis.Résumé : La macropinocytose désigne la formation de grandes vésicules endocytaires primaires de taille et de forme irrégulière, produites par évagination de la membrane péricellulaire, qui permet l'accumulation accélérée de solutés extracellulaires. Il existe une forte similitude entre les macropinosomes et les "phagosomes spacieux" induits par des bactéries entéropathogènes telles que Salmonella et Shigella. Les macropinosomes de forment préférentiellement au front de migration et peuvent fusionner avec les lysosomes ou recycler leur contenu vers le milieu extracellulaire (régurgitation). La transformation de fibroblastes Rat-1 par les oncogènes v-Src ou K-Ras induit la formation constitutive de macropinosomes au niveau des zones du "ruffling". Notre travail s'est intéressé à la dynamique de cette macropinocytose constitutive et à ses régulateurs potentiels. La première partie de ma thèse concerne le sort des macropinosomes dans les fibroblastes transformés par v-Src. Ceux-ci ne fusionnent pas avec les endosomes contenant la transferrine. Pour tester l'effet de l'AMP-cyclique sur cette macropinocytose, nous avons utilisé deux analogues perméants de l'AMPc, le dibutyryl AMP-cylique et le 8-bromo-AMP-cyclique, ainsi qu'un activateur de l'adénylate cyclase, la forskoline. Ces trois agents ralentissent d'environ 35% la vitesse de l'accumulation nette d'un traceur de l'endocytose fluide, la peroxydase de raifort, dans les cellules transformées par v-Src, mais n'ont pas d'effet dans la lignée parentale. Cependant, au contraire d'inhibiteurs de la phospho-inositide 3-kinase (PI3K) ou d'inhibiteurs de la phospholipase C spécifique du phosphatidylinositol (PI-PLC), le dibutyryl AMP-cyclique ne ramène pas le taux d'accumulation de la peroxydase des fibroblastes transformés par v-Src au niveau des fibroblastes parentaux et n'empêche pas la formation de macropinosomes, visualisée en microscopie confocale. L'analyse détaillée de la cinétique d'accumulation de la peroxydase dans les cellules transformées a révélé que le dibutyryl AMP-cyclique ralentit l'accumulation de la peroxydase seulement après un temps supérieur à 5 minutes, en accélérant sa régurgitation, sans affecter le recyclage de la transferrine. Ces résultats montrent clairement que, dans les fibroblastes transformés par v-Src, la macropinocytose et la micropinocytose sont deux voies distinctes et que l'AMP-cyclique n'affecte ni la micropinocytose, ni la formation de macropinosomes, mais active sélectivement la régurgitation à partir de ceux-ci. La seconde partie de ma thèse s'intéresse à la régulation de la formation des macropinosomes. La transformation des fibroblastes Rat-1 par les oncogènes v-Src ou K-Ras ainsi que la transfection stable par un vecteur d'expression de la sous-unité régulatrice sauvage p85a, créant un ²dominant-positif² de la PI3K, provoquent la destruction des câbles de tension, le recrutement de l'actine corticale et la formation du ²ruffling² qui génère les macropinosomes, ce qui est reflété par l'accélération sélective de l'endocytose en phase fluide. Ces altérations corrèlent étroitement avec l'activation de la PI3K et de la PI-PLC, mesurées par la production des phospho-inositides D3 in situ et in vitro et par le niveau de l'IP3 respectivement, et sont abolies après transfection stable par un vecteur d'expression pour la sous-unité p85a tronquée, agissant comme ²dominant-négatif² de la PI3K, ou après traitement des cellules avec les inhibiteurs pharmacologiques de la PI3K et de la PI-PLC. Ceci démontre que ces deux enzymes sont nécessaires dans la signalisation de la macropinocytose constitutive. Ces inhibiteurs diminuent fortement le pourcentage des cellules montrant un ²ruffling² membranaire mais n'affectent pas l'endocytose de la transferrine. La réorganisation du cytosquelette d'actine dans les cellules transformées par v-Src ou dans le ²dominant-positif² de la PI3K est reversée après 30 à 60 minutes de traitement par un inhibiteur de la PI3K, la wortmannine. L'activité de la PI3K n'est pas modifiée par le traitement des cellules avec un inhibiteur de la PI-PLC. En revanche, l'activité de cette dernière est abolie par les inhibiteurs de la PI3K et chez le ²dominant-négatif² de la PI3K. Ceci permet de placer la PI-PLC en aval de PI3K dans la même voie de signalisation de la macropinocytose. En conclusion, une activation permanente et séquentielle de la PI3K et de la PI-PLC est nécessaire au remodelage du cytosquelette d'actine qui produit le ²ruffling² membranaire et la macropinocytose constitutive dans les fibroblastes transformés.

La maurocalcine (MCa) est un peptide/toxin de 33 acides aminés initialement isolé du venin d'un scorpion Tunisien Scorpio maurus palmatus. Depuis ce travail pionnier, la molécule a pu être produite par synthèse chimique sans altération structurale. Trois raisons font que ce peptide est particulièrement intéressant. D'une part, il présente une homologie de séquence avec un domaine de canal calcium dépendant du potentiel qui est impliqué dans le couplage excitation-contraction. Cette homologie est utile pour déchiffrer les bases mécanistiques de la mobilisation calcium du réticulum sarcoplasmique. D'autre part, la MCa est un activateur puissant du récepteur à la ryanodine, déclenchant de cette manière la libération de calcium des stocks intracellulaires. Finalement, ce peptide a une valeur technologique en raison de sa capacité à transporter des composés imperméables au travers de la membrane plasmique. Dans ce travail de thèse, j'ai planifié de nouveaux analogues plus efficaces de la maurocalcine, soit par des substitutions uniques d'acides aminés ou en remplaçant l'ensemble des cystéines par des acides aminés isostériques. Ces analogues possèdent des efficacités de pénétration cellulaire équivalente ou supérieure, présentent des toxicités cellulaires limitées et n'ont pas d'activités pharmacologiques sur le récepteur à la ryanodine. J'ai analysé l'interaction de ces analogues avec des lipides membranaires et des glycosaminoglycans de surface, et le rôle de ces composants dans la pénétration cellulaire de la MCa. L'entrée cellulaire de la MCa se produit par macropinocytose quand ce peptide se fixe à la streptavidine.

Les virus Nipah et Hendra sont deux Paramyxovirus émergents zoonotique apparu ces 15 dernières années en Asie du Sud-Est et en Australie. Ils sont responsables chez l'homme d'encéphalites dont le taux de mortalité peut dépasser les 90%. Il n'existe ni traitements, ni vaccins commercialisés. Ces virus sont donc classé P4. En étudiant la régulation négative de leur récepteur éphrineB2, j'ai pu mettre en évidence un mécanisme d'entrée endocytique pour le virus Nipah : la macropinocytose. Les Henipavirus sont les seuls Paramyxovirus connus dont on a pu démontré un tel mode d'entrée. En mimant le ligand naturel d'éphrineB2 (EphB4), les glycoprotéines virales G provoquent la rétractation des filopodes qui forment autour du virus des macropinosomes. De plus, l'entrée de ces virus peut-être bloquée in vitro par des inhibiteur de macropinocytose. Certain de ces inhibiteurs sont déjà utilisé en médecine humaine, ce qui ouvre la voie à un traitement peu onéreux contre ces dangereux pathogènes.

RÉSUMÉ en françaisLes systèmes de délivrance de médicaments sont fortement investigués dans le but d’obtenir la meilleure efficacité thérapeutique et la plus faible toxicité possible. De nombreux systèmes existent à l’heure actuelle qu’ils soient mécaniques ou chimiques. Dans ce travail, nous nous sommes tout d’abord intéressés à une nouvelle approche basée sur la macropinocytose pour augmenter l’internalisation d’agents thérapeutiques aussi bien dans des cellules cibles de médicaments que dans des cellules souches mésenchymateuses d’origine musculaire (mdMSCs) actuellement de plus en plus étudiées comme nouveaux systèmes de délivrance. La macropinocytose est en effet une voie d’endocytose clathrine-indépendante permettant l’internalisation non sélective de fluide extracellulaire. Ce processus semble contribuer à l’agressivité des cancers en favorisant leur apport en nutriments, le recyclage de la membrane plasmatique et de ses récepteurs ainsi que l’internalisation d’exosomes. La macropinocytose est déclenchée notamment par l’activation des récepteurs epidermal growth factor receptor (EGFR) et platelet-derived growth factor receptor (PDGFR) qui sont des marqueurs connus d’agressivité des gliomes. Au cours de ce travail, nous nous sommes demandé si la macropinocytose ne pourrait pas être utilisée pour améliorer l’internalisation d’agents chimiothérapeutiques dans les cellules de glioblastomes. Nous avons tout d’abord montré que l’expression des acteurs clés de la macropinocytose au niveau de leur ARNm est fortement altérée en fonction du grade de la tumeur en utilisant des bases de données publiques d’échantillons de tumeurs gliales humaines. Une « signature » basée sur l’expression de 38 gènes liés à la macropinocytose permet la discrimination des échantillons de glioblastomes, c’est-à-dire des tumeurs les plus agressives. Nous avons ensuite comparé les effets induits par le MOMIPP et le Vacquinol-1, deux inducteurs connus de macropinocytose, à ceux de l’Honokiol qui induit également une vacuolisation sévère au sein de cellules de gliomes. Malgré de fortes similarités morphologiques, l’Honokiol se distingue par l’induction de vacuoles provenant à la fois d’endocytose mais aussi du réticulum endoplasmique. Chacun des trois composés induit néanmoins une nette augmentation de l’internalisation de dextrans de 10 kDa. Le marquage à l’acridine orange suggère pourtant des différences dans le devenir des vacuoles induites par ces trois molécules. Il a récemment été démontré que le MOMIPP agit en empêchant la maturation des macropinosomes ce qui concorde avec notre observation d’une fusion avec les lysosomes qui serait très limitée. Si les trois molécules permettent bien d’augmenter également la concentration de témozolomide (traitement de référence) au sein des cellules de gliomes, leur impact sur l’internalisation de la doxorubicine est plus faible. L’augmentation de l’internalisation des médicaments par l’induction de macropinocytose ne semble donc pas toujours efficace et pourrait dépendre de leurs propriétés physico-chimiques ainsi que de leur voie d’internalisation basale. Étant donné que l’induction soutenue de macropinocytose peut également déclencher la mort cellulaire tant de cellules de glioblastome chimio-sensibles que chimio-résistantes, nous proposons d’envisager la macropinocytose dans des approches combinées pour bénéficier d’une augmentation de l’internalisation de médicaments et d’effets additifs/ synergiques. Comme les cellules souches mésenchymateuses sont intensément étudiées pour leur utilisation en tant que transporteur de médicaments en plus de leur potentiel intrinsèque pour la médecine régénérative, les effets de ces inducteurs de vacuolisation ont également été étudiés sur des mdMSCs. Ces dernières sont caractérisées par un niveau basal de macropinocytose plus élevé que les modèles de gliomes utilisés et elles semblent mieux répondre au Vacquinol-1 qui permet d’ailleurs d’augmenter plus efficacement la concentration intracellulaire en doxorubicine que le MOMIPP, avec une internalisation environ 2 fois plus importante qu’en absence de stimulation. Ces cellules pouvant être utilisées comme véhicule pour le transport de molécules ayant une faible biodisponibilité afin d’améliorer leur usage en clinique, nous avons ensuite évalué l’impact du chargement de mdMSCs avec de la curcumine, un polyphénol naturel bien connu pour ses propriétés antioxydantes et anti-inflammatoires dont le potentiel clinique reste limité notamment par sa faible solubilité. Pour cette raison, l’utilisation du NDS27, un complexe de lysinate de curcumine et d’hydroxy-propyl-bêta-cyclodextrine qui présente une bien meilleure solubilité dans l’eau, a été préférée. Nous avons observé que l’internalisation de la curcumine, provenant du NDS27, dans les mdMSCs est concentration-dépendante et non temps-dépendante. De plus, elle ne peut pas être augmentée par l’utilisation d’inducteurs de macropinocytose. De plus amples investigations des effets de l’internalisation de la curcumine à partir du NDS27 en fonction de la concentration sur leur viabilité, prolifération, propriétés mésenchymateuses et leur fonction mitochondriale nous ont permis de montrer qu’un chargement de 2 h avec 7 µM de NDS27 était acceptable en vue de préserver la possibilité de bénéficier des mdMSCs en tant qu’agent de thérapie cellulaire régénérative en sus de leur aspect de délivrance. L’investigation du potentiel thérapeutique de telles mdMSCs chargées en curcumine pour traiter l’arthrose chez le cheval est toujours en cours. / SUMMARYDrug delivery systems are highly investigated with the aim to promote the best therapeutic efficacy and the lowest possible toxicity. Nowadays, several systems either mechanical or chemical exist. In this work, we were first interested in studying a new approach based on macropinocytosis to increase the internalisation of therapeutic agents in both target cells of drugs and skeletal muscle-derived mesenchymal stem cells (mdMSCs) currently more and more studied as new deliverance systems. Macropinocytosis is indeed a clathrin-independent endocytosis pathway allowing the nonselective internalisation of extracellular fluid. This process seems to contribute to cancer aggressiveness by favouriting nutrient supply, recycling of plasma membrane and its receptors, and exosome internalisation. Macropinocytosis may notably be triggered by epidermal growth factor receptor (EGFR) and platelet-derived growth factor receptor (PDGFR), two well-known markers of glioma aggressiveness. During this work, we wondered whether macropinocytosis could be used to improve the internalisation of chemotherapeutic agents into glioblastoma cells. We first showed that the mRNA expression levels of key actors of macropinocytosis are strongly altered according to the grade of the tumour using public datasets of human glioma tumour samples. A “signature” based on the expression of 38 macropinocytosis-related gene allows the discrimination of the glioblastoma samples, i.e. the most aggressive tumours. We next compared the effects induced by MOMIPP and Vacquinol-1, two well-known macropinocytosis inducers to those of Honokiol which also induces a severe vacuolisation within glioma cells. Despite high phase-contrast morphological similarities, Honokiol appeared different from the others by the induction of vacuoles from both endocytosis and endoplasmic reticulum origins. Each of the three compounds nevertheless induces a marked increase in 10 kDa dextran internalisation. Acridine orange staining however suggested differences in the fate of vacuoles induced by those three molecules. MOMIPP has recently been shown to prevent the macropinosomes maturation which is consistent with our observation ofthe lack of acridine orange staining of the vacuoles that may be attributed to a limited fusion with lysosomes. Although each of the three compounds allows nevertheless a marked increase of temozolomide (i.e. first-line treatment) concentration into glioma cells, their impact on the internalisation of doxorubicin is poor. The increased internalisation of drugs by inducing macropinocytosis does not seem to be always efficient and could depend on their physicochemical properties and their basal way of internalisation. Considering that sustained macropinocytosis induction may also trigger cell death of both chemo-sensitive and chemo-resistant glioblastoma cells, we proposefor future perspectives to consider macropinocytosis in combination approaches to benefit from an increased drug uptake and additive/synergistic effects. As mesenchymal stromal / stem cells are increasingly studied for their use as drug-carrier in addition to their intrinsic potential for regenerative medicine, the effects of these vacuolisation inducers were also studied on mdMSCs. These lasts are characterised by a higher basal level of macropinocytosis than the glioma models used in this work. They seem to better respond to Vacquinol-1 which allows to increase more efficiently the intracellular concentration of doxorubicin than MOMIPP, with an uptake approximatively 2-fold higher than without stimulation. Given that these cells can be used as vehicle to transport molecules with a poor bioavailability in order to improve their clinical usage, we evaluated the impact of the loading of mdMSCs with curcumin, a natural polyphenol well-known for its antioxidant and anti-inflammatory properties whose clinical potential remains limited notably by reason of its poor solubility. Therefore, the use of NDS27, a complex of curcumin lysinate and hydroxypropyl-beta-cyclodextrin displaying an increased solubility in aqueous solution, was preferred. We observed that the uptake of curcumin from NDS27 into mdMSCs is concentration-dependent and not time-dependent. Moreover, it cannot be improve using macropinocytosis inducers. Further investigations of the effects of curcumin internalisation from NDS27 depending on the concentration used on their viability, proliferation, mesenchymal properties and their mitochondrial function allowed us to show that a loading of 2 h with NDS27 at 7 µM seems acceptable to preserve the possibility to benefit from mdMSCs as a cellular therapy agent in addition to the delivery aspect. The investigation of the double potential therapeutic benefits of such curcumin-loaded mdMSCs to treat osteoarthritis in horses is still ongoing. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Pharmacie) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les cellules dendritiques (DCs) patrouillent les tissus périphériques à la recherche de dangers potentiels en se déplaçant à travers les tissus et en incorporant de grande quantité de matériel extracellulaire. Cet événement précoce de la réponse immunitaire adaptative est susceptible de déterminer l'amplitude et la qualité de l'activation des lymphocytes T et B. De ce fait, les DCs pourraient avoir besoin d'orchestrer leur motilité et leur fonction de capture des antigènes afin d'initier un réponse immunitaire efficace et adaptée. Afin d'étudier les mécanismes responsables de l'optimisation de l'échantillonnage des tissus par les DCs, nous avons suivi leur migration et leur capacité à capturer des antigènes dans des chambres micro-fluidiques contenant des canaux étroits qui permettent de reproduire l'espace confiné des tissus périphériques. De manière surprenante, nous avons découvert que la migration des DCs et leur aptitude à accumuler des antigènes sont des fonctions antagonistes et dépendent de l'activité du moteur moléculaire Myosine II. Nous avons observé que les DCs se déplacent en alternant des phases rapides au cours desquelles la Myosine II est distribuée de manière asymétrique à l'arrière des cellules, et des phases plus lentes pendant lesquelles la Myosine II est enrichie à l'avant. Les enrichissements transitoires de Myosine II à l'avant des DCs dépendent de l'association de la Myosine II avec la chaîne invariante associée au CMH-II (Ii). Ces évenements favorisent l'absorption d'antigènes et leur transport dans les compartiments endolysosomaux. Des expériences menées avec une pince optique nous ont permis de montrer que l'activité de la Myosine II à l'avant des cellules génère des forces mécaniques qui induisent le transport des vésicules vers l'intérieur de la cellule, probablement en modulant le flux rétrograde d'actine. Ainsi, au cours de cette thèse, nous avons montré que la Myosine II était nécessaire à la fois pour la migration cellulaire et la capture d'antigènes, établissant un mécanisme moléculaire qui permet de coordonner ces deux processus dans le temps et l'espace. Nous proposons que l'alternance de phases de haute mobilité et de phases d'arrêt associées à la capture d'antigènes confère aux DCs une stratégie de recherche intermittente qui leur permettrait d'optimiser la surveillance des tissus périphériques. / Dendritic cells (DCs) patrol peripheral tissues in search for potential dangers by actively crawling and internalizing extracellular materiel. This initial event of an adaptive immune response is likely to determine the magnitude and quality of T cell and B cell immunity. Therefore, DCs might need to tightly orchestrate their migration and their antigen uptake function in order to mount an efficient and adapted immune response. To investigate the mechanisms responsible for the optimization of tissues sampling by DCs, we monitored their migration and their ability to capture antigens in micro-fluidic chambers containing narrow channels that mimic the confined space of peripheral tissues. Surprisingly, we found that cell migration and antigen accumulation in endolysosomes are antagonistic, both relying on the activity of the motor protein Myosin II. We observed that DCs alternate between phases of fast motility during which Myosin II is asymmetrically distributed at the cell rear, and phases of slow motility during which Myosin is enriched at the cell front. Transient Myosin II enrichments at the leading edge depends on its association with the MHC-II associated Invariant Chain (Ii). These events promote antigen uptake and arrival in endolysosomal compartments. Using optical tweezers, we further showed that Myosin II activity at the leading edge generates mechanical forces that drive vesicles transport toward the cell body probably through the modulation of F-actin retrograde flow. Thus, during my PhD, we have shown that Myosin II is required for both migration and antigen capture, providing a molecular mechanism to couple these two processes and allow their coordination in time and space. We propose that alternation between phases of fast motility and phases of low motility associated with efficient antigen capture imposes an intermittent search behavior on DCs, which might be optimal for environment patrolling.

Cotutelle - Mélanie Dieudé / L’ischémie-reperfusion inhérente à toute transplantation d’organe solide induit l’apoptose des cellules endothéliales. Les cellules endothéliales apoptotiques sécrètent des vésicules extracellulaires apoptotiques de type exosome (ApoExo). L’internalisation des ApoExo par les cellules endothéliales (CE) adjacentes conduit à des changements fonctionnels importants dont le dysfonctionnement endothélial. Cependant, les mécanismes d’internalisation des ApoExo par les CE sont méconnus. Des marqueurs fluorescents spécifiques aux protéines et à l’ARN ont été utilisés afin de marquer spécifiquement les ApoExo et étudier leur internalisation par microscopie confocale et cytométrie de flux. Les ApoExo ont été internalisés par les CE en fonction du temps et de la concentration. L’inhibition des voies classiques d’endocytose à l’aide d’inhibiteurs pharmacologiques et d’interférence par ARN n’a pas réduit les niveaux d’internalisation des ApoExo. Le blocage de la phosphatidylsérine des ApoExo avec l’annexine-V a réduit leur internalisation. L’analyse ultrastructurelle par microscopie électronique des CE a révélé la présence de structures lamellipodes importantes pour la macropinocytose dont l’inhibition a diminué le transfert d’ARN et de protéines dans les CE. L’analyse par RT-qPCR a révélé que l’ARNm PCSK5, le plus enrichi dans les ApoExo, est augmenté dans les CE traitées aux ApoExo. Cette augmentation est abolie avec ApoExo exempts d’ARNm PCSK5. Ces résultats démontrent que les ApoExo sont activement internalisés par macropinocytose dépendante de la phosphatidylsérine, favorisant leur internalisation en augmentant l’activité macropinocytique des CE. Les ApoExo transfèrent ainsi des ARN fonctionnels capables de moduler le protéome des CE. Ces résultats ouvrent de nouvelles portes pour la prévention de l’internalisation des ApoExo, et donc de la dysfonction endothéliale. / Ischemia-reperfusion injury inherent to solid organ transplantation induces endothelial apoptosis, releasing apoptotic exosome-like vesicles (ApoExo) which in turn induce endothelial dysfunction. We showed that ApoExo modulates gene expression, functions, and morphology of endothelial cells (EC) towards endothelial dysfunction. However, the mechanism by which EC internalize ApoExo remains unclear. Fluorescent probes specifically targeting proteins and RNA were used to track ApoExo uptake in EC by flow cytometry and confocal microscopy. Pharmacological inhibitors and gene silencing were used to probe uptake mechanisms. RNA and protein expression were quantified using Taqman RT-qPCR and immunoblot, respectively. Uptake of ApoExo by EC was observed in a time- and concentration-dependent manner. Inhibition of clathrin- and caveolae-dependent endocytosis did not decrease ApoExo internalization by EC. Blocking phosphatidylserine on ApoExo surface with annexin-V decreased ApoExo uptake. Ultrastructural analysis of serum-starved EC via electron microscopy revealed lamellipodia-like structures, hallmark of macropinocytosis, whose number increased following ApoExo exposure. Inhibition of macropinocytosis abrogated both RNA and protein transfers from ApoExo to EC. The most enriched mRNA in ApoExo, coding for PCSK5, showed enhanced levels in ApoExo-treated EC along with increased PCSK5 protein levels. This was abrogated by both macropinocytosis inhibition and depletion of PCSK5 mRNA in ApoExo. These results demonstrate that EC actively internalize ApoExo through phosphatidylserine-dependent macropinocytosis, and moreover, that ApoExo further increase macropinocytosis. These findings also show that functional RNAs can be delivered to EC through ApoExo. These results open new avenues for preventing ApoExo internalization and counteracting the development of endothelial dysfunction.