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La drépanocytose est la première maladie génétique en France et notamment en Guadeloupe. Il s’agit d’une maladie du sang qui est due à une mutation ponctuelle au niveau du gène de la β-globine, laquelle entre dans la composition de l’hémoglobine. Ainsi les drépanocytaires ont une hémoglobine anormale appelée « HbS », contrairement à l’hémoglobine normale « HbA ». En condition de faible oxygénation, l’HbS polymérise et forme des fibres à l’intérieur des érythrocytes. Ces fibres rigidifient et fragilisent les globules rouges. Par conséquent ils peuvent bloquer la circulation à cause de leur faible déformabilité, et causer des crises vaso-occlusives douloureuses, complication caractéristique de la drépanocytose. Ce modèle physiopathologique classique a été complété par les résultats plus récents montrant l’importance du rôle des leucocytes dans l’établissement de ces obstructions. Par ailleurs, les globules rouges des drépanocytaires sont plus prompts à l’hémolyse en raison de leur fragilité. En raison de l’hémolyse exacerbée, l’hémoglobine se retrouve dans le plasma et diminue la biodisponibilité du principal vasodilatateur, le monoxyde d’azote. De plus, les globules rouges rigides et déformés entrainent activation de l’endothélium. Il en résulte dans la drépanocytose, un contexte pro-inflammatoire et pro-adhérent mais aussi pro-coagulant.Ce contexte est propice à l’activation des cellules sanguines et notamment à celle des plaquettes et des érythrocytes qui par bourgeonnement de leur membrane, émettent alors en grandes quantités, des vésicules sub-micrométriques appelées microparticules, ou MP. En l’absence de traitement curatif applicable à tous les patients drépanocytaires, nous avons décidé d’étudier le profil mais aussi le rôle des MP de patients drépanocytaires dans le but de mieux comprendre cette maladie et dans l’espoir de peut-être découvrir une nouvelle piste diagnostique ou thérapeutique.Nous avons donc montré que les patients SC ont des concentrations sanguines en MP plus importantes que les sujets AA, mais moindres que les patients SS. Etonnamment les MP SC, qu’elles soient d’origine érythrocytaire ou plaquettaire, ont aussi plus de phosphatidylsérine (PS) à leur surface que les MP SS. Ce phospholipide étant impliqué dans l’activation de la cascade de la coagulation, il serait intéressant d’évaluer l’intensité de cette activation par des MP SS ou SC. On pourrait aussi comparer ces intensités à celle induite par des MP de patients SS sous hydroxyurée. En effet nous avons aussi montré que 2 ans après avoir commencé ce traitement, les MP érythrocytaires des patients ont une taille plus importante et une exposition de la PS diminuée drastiquement.Les MP étant physiologiquement dans le sang, elles peuvent entrer en contact avec les cellules sanguines mais aussi avec l’endothélium vasculaire. Etant donné l’importance des changements que connaît cet endothélium chez les drépanocytaires (pro-adhérent, pro-inflammatoire et pro-coagulant), nous nous sommes ensuite focalisés sur l’impact des MP de drépanocytaires sur les cellules endothéliales. Ces dernières provenaient de la moelle osseuse humaine, territoire fréquemment affecté par les vaso-occlusions. Il ressort de ces travaux que les MP de patients SS et SC induisent, par rapport aux MP de sujets AA, une surexpression dose-dépendante de gènes impliqués dans l’adhérence (ICAM-1, VCAM-1, E-sélectine), dans l’inflammation (IL-6, IL-1β et CD40-I) et dans la coagulation (TF). Au niveau protéique, ICAM-1 est aussi surexprimé. En effet les MP SS induisent dès 4 heures d’incubation, une augmentation de la densité moyenne d’ICAM-1 membranaire, ainsi qu’une augmentation de la proportion de cellules exprimant cette protéine. ICAM-1 étant impliquée dans l’adhérence des leucocytes à l’endothélium (roulement, adhérence ferme et même transmigration). / Sicle cell disease (SCD) is the first genetic disease in France and more specifically in Guadeloupe. It is a blood disorder due to a point mutation in the β-globin gene. The corresponding peptide chain being a part of hemoglobin, SCD patients have an abnormal hemoglobin called “HbS”, contrary to the normal one, so called “HbA”. In hypoxic conditions, HbS forms polymers inside red blood cells (RBCs), thereby making them rigid but also fragile. Consequently, RBCs can stop blood flow due to their low deformability, and so cause a painful vaso-occlusive crisis, which is a complication characterizing SCD. This pathophysiological model has been modified by recent results showing the involvement of leukocytes in the establishing of these occlusions. Besides, sickle RBCs are more prone to hemolysis owing to their being fragile. Due to this exacerbated hemolysis, hemoglobin is released in the plasma and diminishes the bioavailability of the main vasodilator, nitrite monoxide. Moreover, rigid sickled RBCs entail endothelium activation, which results in a pro-inflammatory, a pro-adhesive and a pro-coagulant context. This latter favors blood cells activation, among which are platelets and erythrocytes that bud high quantities of submicrometric membrane vesicles called microparticles, or MPs. In the absence of curative treatment for all patients, we decided to study the profile but also the role of MPs from SCD patients to better understand this disease and hoping to find a new diagnostic or therapeutic pathway. We showed that SC patients have lower MP levels than SS patients, but higher MP levels than AA subjects. Surprisingly, we have observed that SC MPs, whether they derive from RBCs or platelets (PLTs), have higher densities of exposed phosphatidylserine (PS) than SS MPs. Since this phospholipid is involved in the activation of the coagulation cascade, it would be interesting to evaluate the intensity of this activation by SS or SC MPs. One could also compare these intensities to the one induced by MPs from SS patients under hydrocarbamide. Indeed we also showed that 2 years after the beginning of this treatment, erythrocyte-derived MP are larger and expose PS much less.As MPs are physiologically in the blood, they can interact with blood cells but also with the vascular endothelium. Given the known changes of this endothelium in SCD (pro-adhesive, pro-inflammatory and pro-coagluant), we then focused on the impact of SCD MPs on endothelial cells (ECs). These cells came from human bone marrow, a territory frequently affected by vaso-occlusions. These experiments showed that SS and SC MPs, induce, compared to AA MPs, a dose-dependent overexpression of genes involved in adherence (ICAM-1, VCAM-1, E-selectin), in inflammation (IL-6, IL-1β and CD40-I) and in coagulation (TF). At the protein level, ICAM-1 is also overexpressed. Indeed SS MPs induce within 4 hours of incubation, an increase of the mean membrane density of ICAM-1, but also an increased proportion of cells bearing this protein. As ICAM-1 is involved in leukocytes adherence to the endothelium (rolling, firm adhesion and even transmigration), SS MPs may, by triggering ICAM-1 overexpression at the endothelium surface, allow their adherence to the endothelium, thereby promoting RBC adherence and so the occlusion of the vessel and the occurring of a VOC. It would be interesting to determine which type of MP cause the overexpression of ICAM-1 and to evaluate if it is sufficient to increase in vitro adherence of leukocytes to ECs stimulated with MPs. This would allow to evaluate how important MPs are when considering the fight against sickle cell disease.

Actuellement, l’Hydroxyurée est le seul traitement médicamenteux qui permet d’améliorer la qualité de vie et l’espérance de vie des patients drépanocytaires. Ses effets sont essentiellement liés à l’augmentation de l’HbF par l’inhibition de la polymérisation de l’hémoglobine S qui constitue la base physiopathologique de la drépanocytose. Cependant d’autres paramètres de réponse contribuent à l’amélioration clinique, principalement les atteintes chroniques, et ce indépendamment de l’augmentation du %HbF. Le phénotype hémolytique est associé aux globules rouges denses (DRBC) qui constituent une sous population de globules rouges présentant une densité supérieure à 1,11. L’amélioration des manifestations chroniques est associée à une diminution du %DRBC qui semble être une cible thérapeutique de l’Hydroxyurée. Par son efficacité de plus en plus démontrée, l’Hydroxyurée pourrait être le traitement de recours dans le traitement de fond de la drépanocytose, cependant son mode d’action reste encore partiellement élucidé.Ce travail a été réalisé dans le but de mieux comprendre le mode d’action de l’Hydroxyurée.La première étude consiste à déterminer les facteurs prédictifs de la diminution des DRBC sous Hydroxyurée. Après 6 mois de traitement, une diminution significative du %DRBC associée à une amélioration des paramètres d’hémolyses a été observée. Cet effet est indépendant de l’augmentation du %HbF. La diminution du %DRBC semble être plus constante que l’augmentation du %HbF sous Hydroxyurée.La deuxième étude a pour but de mettre au point une nouvelle approche de mesure de la teneur en HbF par globule rouge. L’outil de quantification actuellement utilisé donne une mesure du pourcentage moyen de l’HbF. Or la teneur en HbF par globule rouge peut varier pour un même %HbF conduisant à une variabilité de réponse clinique et biologique. Dans l’hypothèse d’un seuil d’HbF inhibant la polymérisation de l’hémoglobine S, une méthode précise de mesure de la teneur en HbF par globule rouge a été développée. Dans le cadre d’une preuve de concept, une étude de la distribution de l’HbF a été effectuée au cours du traitement par Hydroxyurée. Le suivi longitudinal montre une distribution hétérogène de l’HbF avant le début du traitement par Hydroxyurée. La distribution de l’HbF devient homogène après 6 mois sur l’ensemble des globules rouges avec une diminution rapide du nombre de globules rouges ne contenant pas d’HbF au profit des autres populations globulaires.La troisième étude a pour but d’optimiser le traitement par Hydroxyurée. En effet les atteintes rénales associées à la drépanocytose sont de plus en plus fréquentes et constituent un facteur de mortalité. Elles peuvent influencer la pharmacocinétique de l’Hydroxyurée car l’excrétion rénale constitue une voie d’élimination de l’Hydroxyurée. Nous avons d’abord développé unetechnique de mesure simple et fiable de dosage de l’Hydroxyurée. La pharmacocinétique de l’Hydroxyurée a été comparée entre les patients drépanocytaires présentant une fonction rénale normale avec ceux présentant une insuffisance rénale modérée et une hyper filtration glomérulaire. Une diminution de l’élimination de l’Hydroxyurée associée à une augmentation des concentrations plasmatiques ont été observées chez les insuffisants rénaux. La pharmacocinétique de l’Hydroxyurée semble être similaire chez les patients normo-rénaux et hyperfiltrants.Ce travail a apporté des éléments de réponse que nous jugeons important quant à l’action de l’Hydroxyurée sur les DRBC impliqués dans la vasculopathie chronique et sur la distribution de l’HbF. Nous avons également apporté une nouvelle technique de mesure de l’Hydroxyurée et montré qu’une adaptation de dose est nécessaire chez les patients ayant une insuffisance rénale. / Hydroxyurea, the only sickle-cell–disease approved drug, has proven its efficacy in ameliorating patient quality of life and life expectancy. The classical biological response of Hydroxyurea therapy is increased fetal hemoglobin (HbF) which inhibits deoxy hemoglobin S polymerization. However, other parameters also support clinical benefits of Hydroxyurea especially for chronic organ failures which are related to hemolysis. Sickle-cell–disease hemolytic phenotype is associated with dense red blood cells (DRBC) defined as having a density >1,11. Improvement of chronic clinical complications is associated with a marked decrease in %DRBC emphasizing its role as a therapeutic target for Hydroxyurea treatment. Despite the known benefits in both acute and chronic sickle-cell–disease manifestations, the mechanism action of Hydroxyurea has not been fully elucidated.This thesis was undertaken in order to investigate the mechanism of action of Hydroxyurea in sickle-cell–disease treatment.The first aim is to determine biological parameters predictive of %DRBC decrease under Hydroxyurea. A significant decrease in %DRBC after 6 months of Hydroxyurea therapy was observed. This biological response was associated with a decrease in hemolysis. However no correlation with %HbF increase was detected; the decrease in %DRBC under Hydroxyurea was more constant than the increase in %HbF.The second aim of this study was to develop a new approach for HbF determination in individual red blood cells. Indeed, routine HbF quantification only provides a mean value. However clinical amelioration is not exclusively dependent on the average %HbF, since a wide distribution of HbF content per cell could indicate a HbF content threshold for inhibition of deoxy hemoglobin S polymerization. In this context, a simple and precise method was developed in order to assay HbF content per cell. The distribution of HbF during Hydroxyurea therapy was analyzed as proof of concept. The longitudinal monitoring showed an uneven distribution of HbF before Hydroxyurea and a normal distribution in the whole red blood cells after 6 months of therapy. A rapid decrease in red blood cells not containing HbF in favor of cells expressing a high quantity of HbF was observed.The third objective consisted of Hydroxyurea therapy optimization. Chronic kidney disease is a frequent complication during sickle-cell–disease. Since Hydroxyurea is cleared from plasma partially by renal excretion, impaired renal function could potentially affect Hydroxyurea pharmacokinetics. A new simple Hydroxyurea dosage method was performed in this context.Hydroxyurea pharmacokinetic parameters were compared among sickle-cell–disease patients with normal renal function, moderate renal insufficiency and renal hyper filtration. A decrease in Hydroxyurea elimination associated with a marked plasma concentration was observed inrenally impaired patients. No significant difference was observed between renal hyper filtration and normal patients.These results provide answers about Hydroxyurea effect on DRBC which are involved in chronic vasculopathy and on HbF distribution. Hydroxyurea dosage method underpins the need for dose adjustment in renally impaired patients.

La drépanocytose est une maladie génétique touchant l'hémoglobine, de transmission autosomique récessive, caractérisée par trois grandes manifestations cliniques :anémie hémolytique chronique, phénomènes vaso-occlusifs et susceptibilité accrue aux infections. Dans diverses régions du monde et particulièrement en Afrique subsaharienne, cette maladie est très fréquente et constitue un problème crucial de santé publique. Sa physiopathologie complexe est basée sur la polymérisation de l’hémoglobine anormale (Hb S) qui provoque une falciformation et une déshydratation du globule rouge. Les hématies falciformées sont impliquées dans les phénomènes de vaso-occlusion. Le traitement et la prise en charge de la maladie reste toujours problématique. A l’heure actuelle, le seul traitement curatif est la transplantation de moelle osseuse mais les donneurs compatibles sont assez rares et les coûts élevés. Des traitements symptomatiques et préventifs (principalement la transfusion et l’hydroxyurée) existent toutefois.<p>Des études in vitro et in vivo ont démontré les possibilités thérapeutiques de certaines molécules dont les cibles sont les transports membranaires impliqués dans la déshydratation cellulaire.<p>Depuis les années 1990, le cromoglycate de sodium, un médicament anti-allergique et anti-asthmatique, a montré un intérêt potentiel dans le traitement de la drépanocytose. Néanmoins, son mode d’action n’est actuellement pas connu. Notre travail a pour but de contribuer à l’étude du mécanisme d’action anti-drépanocytaire de la molécule.<p>Dans un premier temps, des globules rouges drépanocytaires préincubés en absence ou présence de cromoglycate ont été désoxygénés par un flux d’azote. Ensuite, les concentrations intracellulaires en Na+ et en K+ ont été mesurées. Les résultats de ces investigations ont montré un effet inhibiteur du cromoglycate sur l’efflux de K+ et l’influx du Na+ provoqués par la désoxygénation.<p>Sur base de ces observations, des expériences testant l’action du cromoglycate sur le canal K+ dépendant du Ca2+ (canal de Gardos) ont été effectuées. Dans des globules rouges normaux et drépanocytaires, ce canal a été activé par augmentation de la concentration intra-cellulaire en Ca2+. L'effet du cromoglycate a été comparé à celui d'un inhibiteur connu, le clotrimazole. Les résultats ont montré que 1e cromoglycate n'exerce pas d'effet inhibiteur sur le canal de Gardos, au contraire du clotrimazole. Il est également sans effet significatif sur la Ca2+-ATPase.<p>Nous avons ensuite investigué l’implication du Ca2+ dans les perturbations du flux des ions K+ et Na+. Des globules rouges drépanocytaires ont été incubés en absence et présence d’EGTA 5 mmol/l ou de BAPTA 10 µmol/l, respectivement chélateurs du Ca2+ extra et intracellulaire. Après désoxygénation, les concentrations intracellulaires en Na+ et K+ ont été mesurées. Les résultats de ces expériences montrent que seul le chélateur du Ca2+ extracellulaire bloque les perturbations ioniques causées par la désoxygénation. Ces résultats viennent donc confirmer les observations d’autres auteurs quant à l’implication du Ca2+ extracellulaire dans la fuite de K+ des globules drépanocytaires soumis à la désoxygénation. <p>Enfin, l’effet du cromoglycate sur l’influx de Ca2+ extracellulaire et sur la falciformation induits par le métabisulfite a été mesuré et comparé à celui du clotrimazole. Des globules rouges drépanocytaires, prélablement chargés en Fura Red, un indicateur fluorescent du Ca2+, ont été exposés au métabisulfite, un puissant réducteur provoquant une falciformation rapide. L’influx de Ca2+ a été mesuré par la diminution de la fluorescence du Fura Red. Parallèlement, la falciformation a été suivie en mesurant la lumière diffractée à 90° par les cellules. Les résultats de ces investigations montrent que le cromoglycate (1 µmol/l) et le clotrimazole (10 µmol/l) ont des effets inhibiteurs comparables sur la falciformation mais que le cromoglycate freine significativement plus l'influx de Ca2+ au cours de ce processus.<p>En conclusion, sur base de ces différents tests in vitro, le cromoglycate inhibe la falciformation induite par la désoxygénation. Cette inhibition résulte du blocage des perturbations ioniques induites par la désoxygénation en empêchant l’influx du Ca2+ extracellulaire et secondairement la fuite du K+ intracellulaire, ce qui inhibe la déshydratation cellulaire.<p>La diminution des crises vaso-occlusives observée chez les patients drépanocytaires traités par le cromoglycate s’expliquerait donc par ces effets. En présence de cromoglycate, les globules rouges sont moins déshydratés et falciforment moins rapidement. Ils sont dès lors moins impliqués dans les phénomènes de vaso-occlusion, ce qui améliore l’état des patients.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Résumé non transmis / Summary not transmitted

Le premier objectif de cette thèse était d’améliorer l’utilisation et la compréhension des outils de mesure de la déformabilité du globule rouge (GR) dans la drépanocytose (Etudes 1 et 2). L’étude 1 a montré l’importance de la standardisation des mesures de déformabilité par ektacytométrie chez les enfants drépanocytaires. Au cours de l’étude 2, les propriétés des GR ont été modifiées et la variation des courbes de déformabilité érythrocytaire « classique » (index d’élongation en fonction de la contrainte de cisaillement en milieu isotonique) a été comparée aux résultats d’osmoscan (mesure de la déformabilité érythrocytaire en gradient osmolaire à contrainte de cisaillement fixe), méthode de référence pour étudier les anomalies de la membrane du GR. Ainsi, les variations de déformabilité érythrocytaire au-delà de 3 Pa sont affectées à la fois par la viscosité interne du GR et par des modifications de la surface cellulaire (rapport surface/volume) alors que les modifications de l’élasticité membranaire affectent la déformabilité érythrocytaire quelles que soient les forces de cisaillements utilisées (faibles, modérées ou hautes). Le deuxième objectif de cette thèse était d’apporter des éléments supplémentaires sur l’implication des facteurs génétiques, des paramètres hémorhéologiques et du niveau de stress oxydant sur la survenue des complications vaso-occlusives chez les patients atteints de syndrome drépanocytaire majeur (Etudes 3 à 6). La mise en commun des résultats d’hémorhéologie obtenus sur 165 patients de notre cohorte lyonnaise et 240 patients de la cohorte guadeloupéenne a permis de montrer que la rhéologie du GR chez les patients drépanocytaires était dépendante de l’âge. Ainsi, la viscosité sanguine augmente avec l’âge pour atteindre un plateau vers 30 ans alors que la déformabilité érythrocytaire diminue avec l’âge (Etude 3). Ces modifications participent vraisemblablement à l’apparition de complications chroniques chez l'adulte drépanocytaire. Les études 4 et 5 ont été réalisées sur la cohorte pédiatrique lyonnaise. Au cours de ces 2 études, nous avons étudié l’influence sur la rhéologie du sang et la survenue de crises vaso-occlusives (CVO) des facteurs génétiques (alpha-thalassémie, déficit en Glucose-6-Phosphate Déshydrogénase (G6PD) et haplotypes S) d’une part (Etude 4) et du niveau de stress oxydant et nitrosatif d’autre part (Etude 5). L’alpha-thalassémie augmente la déformabilité des GR et l’agrégation érythrocytaire. Ces 2 phénomènes pourraient participer à augmenter le risque de CVO. De plus, l’alpha-thalassémie, en diminuant l’hémolyse, diminuerait le niveau de stress oxydant, élément majeur impliqué dans la physiopathologie de la drépanocytose. Enfin, l’étude 6 a montré que la rhéologie sanguine des patients Sbêta+ était quasi-identique à celle des sujets sains AA mais que les patients les plus sévères pourraient avoir un déficit en monoxyde d’azote circulant. En conclusion, mon travail de thèse contribue à une meilleure compréhension de la physiopathologie de la drépanocytose / The first goal of this thesis (Study 1 and 2) was to improve the use and the comprehension of tools for red blood cell (RBC) deformability measurements in sickle cell disease (SCD). The first study showed the importance of standardization of RBC deformability measurements by ektacytometry in SCD children. In the study 2, the RBC proprieties was modified and the variation of « classic » RBC deformability curve (elongation index as a function of the shear stress in isotonic medium) was compared to osmoscan results (elongation index in hyperosmolar gradient and constant shear stress), the gold standard for RBC membrane defect studies. Thus, the modifications of RBC deformability curve above 3 Pa were affected by RBC internal viscosity and cellular surface modification (and thus surface/volume ratio) while membran elasticity modifications affected RBC deformability whatever the shear stress (low, moderate or high). The second goal of this thesis was to study the effects of genetic modifiers, hemorheological parameters and oxidative stress level on vaso-occlusive complications (VOC) in SCD (Study 3 to 6). Hemorheological parameters were measured on 165 patients from Lyon and 240 patients from Gwada and the results showed that blood viscosity increased until the age of 30 and RBC deformability decreased with age (Study 3). This modifications probably play role in the chronic complications of SCD adult patients. The studies 4 and 5 were conducted on SCD children. We studied the effects of genetic modifiers (alpha-thalassemia, glucose-6-phospho-deshydrogenase deficiency and S haplotypes ; study 3) and nitro-oxidative stress level (study 5). Alpha-thalassemia increase RBC deformability and RBC aggregation. This phenomenon could contribute to increase VOC. Moreover, alpha-thalassemia decreased hemolysis and thus oxidative stress, a major component of SCD physiopathology. Then the study 6 showed that Sbeta+ patient hemorheology was quite the same of AA ubjects but the more severe patients could have a defect in circulating nitric oxide. To conclude, my thesis contribute to a better understanding of SCD physiopathology

Les β-hémoglobinopathies (β-thalassémies et drépanocytose) sont des anémies génétiques qui touchent des milliers de nouveaux nés chaque année dans le monde. Ces maladies sont causées par des mutations affectant l'expression de l'hémoglobine chez l'adulte. Le seul traitement disponible est la transfusion sanguine à vie, associée à une chélation du fer. Pour les patients les plus touchés, la greffe de cellule souche hématopoïétique (CSH) demeure le seul traitement curatif. Néanmoins, la transplantation autologue de cellules souches génétiquement corrigées représente une alternative thérapeutique pour les patients dépourvus de donneur compatible. Certaines délétions naturelles comprenant les gènes de la β- et δ- globine dans le locus de l'hémoglobine sont corrélées à une persistance de l'expression de l'hémoglobine fœtale (HPFH) à l'âge adulte. Ainsi il a été démontré que un taux élevé d'hémoglobine fœtale (HbF) améliore l'évolution clinique de ces deux pathologies. Afin d'identifier les régions régulatrices potentielles de la γ-globine, nous avons combiné les données issues d'analyses de mutations rencontrées chez des patients HPFH avec les sites d'hybridation de facteur de transcription. Sur la base de cette analyse, en ayant recours à la technologie CRISPR/CAS9, nous avons développé un protocole permettant de générer: (i) la délétion d'un potentiel suppresseur de l'HbF situé entre les gènes des globines δ et γ, ciblé par le répresseur de l’HbF BCL11A chez les érythroblastes adultes; (ii) la plus courte délétion associée à des taux élevés d’HbF (délétion Corfu) chez les patients β-thalassemiques; (iii) une délétion de 13.6-kb rencontrée fréquemment chez les patients HPFH et incluant les gènes des globines β et δ ainsi que le potentiel suppresseur de l'HbF. Notre travail a montré que la délétion de la région génomique de 13.6-kb entraîne une forte production de HbF et une réduction concomitante de l'expression de la β-globine soit dans des lignées cellulaires érythroïdes humaines soit dans des érythroblastes primaires dérivées des cellules souches et progéniteurs hématopoïétiques (CSPH). Par ailleurs, nous avons montré que la génération de cette délétion sur des CSPHs issus de patients drépanocytaires entraîne une augmentation de la transcription de la γ-globine dans une proportion significative d'érythroblastes, conduisant à une amélioration du phénotype drépanocytaire. Enfin, nous avons exploré le mécanisme menant à la réactivation de l'expression de la γ-globine. Nous avons évalué des changements dans la conformation de la chromatine et des modifications épigénétiques dans le locus de la β-globine lors de la délétion ou de l'inversion de la région de 13.6 kb. Dans l'ensemble, cette étude contribue à la connaissance des mécanismes favorisant l'échange de l'hémoglobine fœtale à l'adulte et fournit des indices pour une approche d'édition du génome dans le traitement de la β-thalassémies et de la drépanocytose. / Β-hemoglobinopathies (β-thalassemias and sickle cell disease) are genetic anemias affecting thousands of newborns annually worldwide. β-thalassemias and sickle cell disease (SCD) are caused by mutations affecting the adult hemoglobin expression and are currently treated by red blood cell transfusion and iron chelation regiments. For patients affected by severe β-hemoglobinopathies, allogenic hematopoietic stem cell (HSCs) transplantation is the only definitive therapy. However, transplantation of autologous, genetically corrected HSCs represents an alternative therapy for patients lacking a suitable HSC donor. Naturally occurring large deletions encompassing β- and δ-globin genes in the β-globin gene cluster, defined as Hereditary Persistence of Fetal Hemoglobin (HPFH) traits, lead to increased fetal hemoglobin (HbF) expression ameliorating both thalassemic and SCD clinical phenotypes. In this study, we integrated transcription factor binding site analysis and HPFH genetic data to identify potential HbF silencers in the β-globin locus. Based on this analysis, we designed a CRISPR/Cas9 strategy disrupting: (i) a putative δγ-intergenic HbF silencer targeted by the HbF repressor BCL11A in adult erythroblasts; (ii) the shortest deletion associated with elevated HbF levels (“Corfu” deletion) in β-thalassemic patients, encompassing the putative δγ-intergenic HbF silencer; (iii) a 13.6-kb genomic region including the δ- and β-globin genes and the putative intergenic HbF silencer. Targeting the 13.6-kb region, but not the Corfu and the putative δγ-intergenic regions, caused a robust HbF re-activation and a concomitant reduction in β-globin expression in an adult erythroid cell line and in healthy donor hematopoietic stem/progenitor cells (HSPC)-derived erythroblasts. We provided a proof of principle of this potential therapeutic strategy: disruption of the 13.6-kb region in HSPCs from SCD donors favored the β-to-γ globin switching in a significant proportion of HSPC-derived erythroblasts, leading to the amelioration of the SCD cell phenotype. Finally, we dissected the mechanisms leading to HbF de-repression demonstrating changes in the chromatin conformation and epigenetic modifications within the β-globin locus upon deletion or inversion of the 13.6-kb region. Overall, this study contributes to the knowledge of the mechanisms underlying fetal to adult hemoglobin switching, and provides clues for a genome editing approach to the treatment of SCD and β-thalassemia.

La drépanocytose (SCD) et l'athérosclérose sont deux maladies très diffèrentes et distinctesqui partagent les même caractéristiques. La drépanocytose est une maladie autosomalerécessive appartenant à la classe des hémoglobinopathies causée par la mutation del'hémoglobine (Hb) A en HbS. En réponse à des stress physiques tels que l'hypoxie,l'acidose, la déshydratation ou l'hyperthermie, HbS devient plus vulnérable à lapolymérisation et favorise le processus de falciformation des globules rouges. La répétitiondes cycles de polymérisation et dépolymérisation de HbS altère la forme saine desérythrocytes et conduisent aux manifestations cliniques principales de la drépanocytose:anémie, épisodes vaso-occlusifs aigus et crises hémolytiques. Il est aujourd'hui largementadmis que le stress oxydatif et l'inflammation jouent un rôle majeur dans la pathogènèse et lesconséquences physiopathologiques de la drépanocytose. L'athérosclérose, quant à elle, estune maladie inflammatoire chronique qui se caractérise par l'accumulation de plaques àl'intérieur des parois vasculaires au niveau de l'endothélium. Le stress oxydatif et la mise enjeu de phénomènes inflamatoires sont impliqués dans l'oxydation des lipides de faible densité(LDL), étape essentielle dans la pathogenèse de cette maladie.D'autre part, l'activité physique est un mécanisme important de modulation bénéfique dustress oxydatif et de l'inflammation au travers de plusieurs voies d'adaptation : l'améliorationdes enzymes antioxydantes, de la vasodilatation et des cytokines anti-inflammatoires, et labaisse des contraintes de cisaillement. Nous avons donc cherché à déterminer dans ce travailde thèse comment le contrôle du stress oxydatif et de l'inflammation par l'activité physiquepourrait réduire les complications de ces 2 pathologies (SCD et athérosclérose).

L’altération de la réserve fonctionnelle cardiovasculaire (CV) à l’exercice est un signe précoce d’insuffisance cardiaque (IC). Nous avons étudié l’hypothèse d’une altération de la réserve CV dans deux modèles physiopathologiques : -une étude des pressions de remplissages du ventricule gauche (VG) lors d’un exercice de faible intensité avait pour finalité de démasquer une anomalie cardiaque latente au repos; cette approche a été appliquée à des patients à risque élevé d’IC à fraction d’éjection préservée.-une étude plus approfondie de la réponse CV au cours d’un exercice maximal avait pour double objectif, de démasquer, mais aussi d’analyser en détail les composantes physiopathologiques de l’altération de la fonction cardiaque. Cette approche a été appliquée à l’étude de la drépanocytose, un modèle de cardiopathie à haut débit. Dans la première partie de ce travail, nous avons montré qu’il était possible de démasquer une altération du remplissage VG dès une faible intensité d’exercice. Ces résultats observés initialement en utilisant des outils non-invasifs ont été confirmés en utilisant le cathétérisme cardiaque comme gold standard. Dans la seconde partie de ce travail, l’évaluation de patients drépanocytaires au cours d’un exercice maximal a permis de mettre en évidence une altération de la réserve fonctionnelle CV liée à un défaut de la réserve chronotrope et de la réserve en pré-charge du VG.Nos travaux constituent une contribution à l’étude de la physiopathologie CV. Les différentes modalités d’exploration qui ont été utilisées, et qui ont pour certaines été mises au point pour la réalisation de cette thèse, pourraient servir à l’étude d’autres cardiopathies. / Despite normal investigations at rest, latent heart failure can be observed in a number of patients during exercise. We investigated the hypothesis of an impairment of cardiovascular reserve in two pathophysiological models: - in patients at high risk of heart failure with preserved ejection fraction, we measured left ventricular filling pressures at low exercise level in order to unmask early stages of left ventricular diastolic dysfunction;- moreover, using combined echocardiography and cardiopulmonary exercise testing, a comprehensive study of cardiovascular response to maximal exercise was performed in patients with sickle cell anemia which was chosen as a model of chronic high-output states. We showed that very low exercise level could unmask early stage heart failure with preserved ejection fraction. These results, initially observed using Doppler echocardiography, were confirmed by direct invasive measurement of left ventricular filling pressure during exercise. In patients with sickle cell anemia, we found a decrease of cardiac output response to exercise. This alteration of cardiovascular reserve was characterized by a chronotropic incompetence and a blunted left ventricular preload reserve. The pathophysiological data provided by our studies may help improve and optimize management of patients with heart failure. The stress protocols which have been developed and used in our investigations could be useful to study other models of heart diseases.

IntroductionLa drépanocytose est l’affection génétique la plus répandue dans le monde plus particulièrement en Afrique subsaharienne, considérée à juste titre comme l’une des régions originaires de la mutation drépanocytaire avec de fortes prévalences. Elle est reconnue comme un problème de santé majeur par la communauté internationale en raison de sa morbidité et de sa mortalité élevées. Au Mali, environ 5 à 6 milles naissances de drépanocytaires sont enregistrées par an [Diallo, 2008] et ils auront besoin d’une prise en charge médicale spécifique. Le Centre de Recherche et de Lutte contre la Drépanocytose (CRLD) situé à Bamako est le seul centre de traitement spécifique dédié à la lutte contre la drépanocytose au Mali. Il reçoit des patients drépanocytaires du Mali et de la sous région. Ces patients sont pour la plupart vus au stade de complications puisqu’il n’existe pas de programme de dépistage systématique dès la naissance et à fortiori de suivi.La transfusion sanguine intervient dans une large mesure pour la prise en charge thérapeutique de ces patients. Acte thérapeutique essentiel sur le continent Africain en raison de la fréquence d’anémies de diverses origines (certaines nécessiteront un traitement de la cause).Cette transfusion sanguine comporte des risques non négligeables en Afrique, notamment dans le domaine des agents transmissibles par le sang. Un dépistage systématique des infections par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH), le virus de l’hépatite C (VHC), le virus de l’hépatite B (VHB) et le tréponème, agent de la syphilis, est en vigueur sur tous les dons de sang à Bamako, mais les prévalences élevées de ces agents infectieux dans la population générale dont sont issus les donneurs de sang incitent à penser que le risque transfusionnel résiduel doit être important. Dans le but de renforcer la sécurité transfusionnelle au Mali, nous avons entrepris des études prospectives et rétrospectives chez les donneurs de sang et chez les drépanocytaires transfusés, ceci afin d’identifier les problèmes spécifiques liés à la thérapeutique transfusionnelle chez les drépanocytaires et de proposer une meilleure stratégie pour leur prise en charge.Méthodologie :Nous avons conduit une série d’études, visant à déterminer :- les caractéristiques des donneurs, des dons de sang et de l’organisation des centres de transfusion en Afrique subsaharienne francophone ;- la séroprévalence des agents infectieux transfusionnels majeurs (VIH, VHB, VHC) pour les dons de sang effectués au CNTS du Mali et chez les patients drépanocytaires recrutés au CRLD. - la fréquence de l’allo-immunisation anti-érythrocytaire avant et après la transfusion sanguine chez les drépanocytaires.- identifier les problèmes liés au dépistage néonatal et au suivi des drépanocytaires dépistés au Mali.Les donneurs de sang (volontaires et familiaux) ont été inclus selon les critères du don en vigueur au Mali. Le diagnostic de la drépanocytose a été réalisé par une technique de chromatographie liquide à haute performance (CLHP) avant inclusion des patients.Le dépistage des infections virales a été effectué par une méthode immunoenzymatique (ELISA) et la recherche des anticorps anti-érythrocytaire par un test de Coombs indirect.Résultats :Dans les sept pays, les donneurs de la tranche d’âge 18 à 30 ans étaient les plus nombreux, représentant plus de 45 % dans tous les centres, et plus de 70%dans quatre centres sur sept. Les donneurs masculins étaient les plus nombreux (plus de 70% de l’ensemble). Les donneurs étaient majoritairement volontaires (plus de 70 %), sauf au Cameroun et au Mali où ils représentaient respectivement 25,5 et 30 %. Quatre pays, dont ces deux derniers, avaient moins de 50 % de donneurs réguliers.Sur un total de 25 543 dons de sang recueillis au CNTS de Bamako en 2007, les séroprévalences des agents infectieux dépistés étaient de :2,6 % pour le VIH; 3,3 % pour le VHC et 13,9 % pour le VHB. En fonction du type de don, il y’avait une différence statistiquement significative (p <0,05) entre ces séroprévalences et plus élevées chez les donneurs familiaux que chez les donneurs volontaires bénévoles.Chez les 133 drépanocytaires transfusés au moment de leur inclusion dans l’étude, les séroprévalences des infections virales observées étaient de :1%, 3% et 1% respectivement pour les VIH, VHB et VHC. Trois cas de séroconversion post-transfusionnelle ont été observés. Tous avaient reçu du sang de donneurs familiaux. L’allo-immunisation anti-érythrocytaire était observée chez 4,4% (4/90) des drépanocytaires avec antécédents transfusionnels au moment de leur inclusion; les anticorps observés étaient de type anti D (un cas), anti C (deux cas) et un anti c (un cas). Elle n’a été observée chez aucun patient drépanocytaire ayant reçu leur 1ère transfusion au CRLD, avec exclusivement des concentrés de globules rouges phénotypés.Concernant le dépistage néo-natal de la drépanocytose, sur un total de 2480 nouveau-nés dépistés, 16 étaient atteints de l’affection. Aucun suivi médical programmé n’a pu être réalisé.Conclusion :Les prévalences relativement élevées des agents infectieux dans les dons de sang effectués par des donneurs familiaux majoritaires et les séroconversions observées après transfusion sanguine, justifient une politique de sécurisation des procédures de transfusions chez les drépanocytaires basée notamment sur le recrutement de donneurs volontaires.L’amélioration de la survie des patients drépanocytaires passe par la mise en place de programmes de dépistage précoce et de suivi régulier, mais si cette stratégie est réalisable du point de vue du diagnostic, il n’en demeure pas moins qu’elle soulève des problèmes de financement de cette activité et de sa pérennisation ;ces aspects doivent faire l’objet de réflexions pour une solution à long terme. / Introduction Sickle cell disease is the most common genetic disorder in the world, especially in sub-Saharan Africa where sickle cell mutation with high prevalence’s is originated high. It is recognized as a major health problem by the international community due to its morbidity and mortality. In Mali, around 5-6000 newborns annually affected by sickle cell disease [Diallo, 2008] and they will require specific medical that is by the “Centre de Recherche et de Lutte contre la Drépanocytose » (CRLD) in Bamako. This is the unique Malian center where sickle cell patients from Mali and the sub-region are treated. Because of the lack of systematic screening program at birth, most of the patients are seen at the stage of complications. Blood transfusion is largely used for therapeutic management of these patients. It constitutes an essential therapeutic approach against anemia of highly prevalent in Africa various origins (some requiring also treatment of the cause). However, blood transfusion means significant risks, particularly in area of high prevalence of transfusion transmissible infectious agents. A systematic screening for viral infections like human immunodeficiency virus (HIV), hepatitis C virus (HCV), hepatitis B virus(HBV) and Treponema agent of syphilis is required for all blood donations in Bamako, but the high prevalence of these infectious agents in the general population, i.e. blood donors, suggest that the residual risk of transfusion must be important.In order to enhance blood transfusion safety in Mali, we undertook prospective and retrospective studies in the population of blood donor and sickle cell patient transfused to identify transfusion related adverse events and especially for SCD’ patients, suggest a better strategy for their follow-up. Methodology:We conducted a sery of studies which aims to determine:- The characteristics of donors, blood donation and the organization of blood transfusion centers in sub-Saharan French speaking Africa;- The seroprevalence of major infectious agents (HIV, HBV, and HCV) in blood donations at the CNTS in Mali and in sickle cell patients at CRLD. The frequency of anti-erythrocyte allo immunization before and after blood transfusion in sickle cell disease patients;- Identification of difficulties related to newborn screening and monitoring of sickle cell patients in Mali.Blood donors (volunteers and family) were included according to the criteria of blood donation in Mali.Hemoglobin type in sickle cell was determined by the technique of high performance liquid chromatography (HPLC) before patients’ inclusionScreening for viral infections was performed by enzyme immunoassay (ELISA) and the search for anti-erythrocyte antibodies by indirect Coombs test. ResultsIn the seven countries, donors aged from 18 to 30 years old were more represented i.e. 45% in all centers and more than 70%in four of the seven centers. More than 70% of blood donors were males. Donors were mostly volunteers (over 70%), except in Cameroon and Mali accounting for25.5% and30%, respectively four countries, including Cameroon and Mali had less than,50% of regulars donors.Of the 25 543 blood donations collected at the CNTS in Bamako in 2007, seroprevalence of infectious agents detected represented: 2.6%, 3.3%, and 13.9% for HIV, HCV, and HBV respectively. A statistical significative difference (p<0.05) was observed between family and volunteer donors in term of seroprevalence.the 133 sickle cell patients who received blood transfusion at inclusion, the seroprevalence of viral infections was1%, 3%, and 1%,for HIV, HBV, and HCV, respectively. Three cases of post-transfusion seroconversion were observed but only in sickle cell patients who received blood from family donors.Anti-erythrocyte alloimmunization was observed in 4.4% (4/90) among sickle cell patients with blood transfusion history at the time of inclusion; observed antibodies were anti type D (one case), anti C (two cases) and anti c (one case). However, no case was observed in any sickle cell patients, who received phenotyped RBC at CRLD,For neonatal screening, among the 2480 newborns, 16 were affected. However no scheduled medical follow-up was realized. Conclusion The relatively high prevalence’s of infectious agents in family donors, who represented the majority of blood donors, and of seroconversion observed after blood transfusion in sickle cell patients justify a security policy of blood transfusion procedures based, particulary for SCD patients, blood donations by volunteers. Improved survival of patients with sickle cell disease should be based on the development of early detection programs and regular monitoring. However if this strategy is feasible in terms of diagnosis ,it raises problems at funding for this activity and also of; those should be the subject of discussion for a long term solution / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished