Thèse Médecine Paris, 1813 numéro 69.

Le cancer du sein est le cancer féminin le plus fréquent et le plus létal chez la femme dans le monde. Malgré l'amélioration du dépistage dans les phases précoces du développement tumoral, il demeure difficile de traiter les phases tardives lorsque les processus métastatiques sont engagés. Le développement métastatique dépend notamment de l'acquisition de capacités migratoires par les cellules épithéliales impliquant un remodelage du cytosquelette, hautement dépendant de la concentration calcique intracellulaire. Alors que les travaux se sont intéressés à l'implication des canaux ioniques membranaires dans les processus de migration, le rôle des récepteurs à l'inositol 1,4,5-trisphosphate (IP₃Rs) reste peu étudié et donc méconnu. Dans un premier temps nous avons montré une augmentation du niveau d'expression d'IP₃R3 avec le niveau du potentiel migratoire de trois lignées cancéreuses mammaires humaines : MCF-7 (les moins migrantes), MDA-MB-231 et MDA-MB-435s (les plus migrantes). D'autre part, nous montrons que la modulation de l'expression d'IP₃R3 module leurs capacités migratoires: elles sont diminuées par l'inhibition d'IP₃R3, alors qu'elles sont augmentées par la surexpression d'IP₃R3 dans les cellules mammaires peu migrantes. De plus, l'inhibition d'IP₃R3 révèle un signal calcique oscillant, alors que sa surexpression induit un signal calcique maintenu dans ces cellules. Dans un second temps, nous avons mis en évidence une corrélation inverse entre le niveau d'expression d'IP₃R3 et la morphologie arrondie de ces trois lignées cellulaires. En effet, plus la morphologie cellulaire est arrondie, plus l'expression d'IP₃R3 est importante. Par ailleurs, l'inhibition d'IP₃R3 induit un arrondissement des cellules migrantes et une diminution des protrusions membranaires accompagnés d’une diminution de leur adhésion. Ces résultats suggèrent fortement l'implication d'IP₃R3 dans la modulation des acteurs du cytosquelette. En effet, l'inhibition d'IP₃R3 induit une diminution de l'expression de l'ARHGAP18, de l'activité de RhoA et de l'expression de Cdc42. Ces Rho GTPases permettent à leur tour une diminution de la phosphorylation de FAK_⁸⁶¹ et la réorganisation du cytosquelette d'actine et de profiline. Enfin, dans un modèle migratoire, le profil oscillant s'établit dès réalisation d'une blessure et prédomine 3 h après dans les cellules du front de migration alors qu'il se met en place dans les cellules à l'arrière uniquement après 3 h. L'intervalle spatio-temporel de ce signal calcique oscillant reflète une dynamique calcique intracellulaire nécessaire aux processus migratoires et au remodelage du cytosquelette des cellules du cancer du sein. En conclusion, nos résultats révèlent un rôle clé de l'IP₃R3 dans les processus migratoires et dans le remodelage du cytosquelette de profilactine via la voie ARHGAP18/ RhoA/ FAK associé à une modulation du profil calcique intracellulaire / Breast cancer is the most common lethal cancer in women in worldwide. In spite of screening improvement in early stages of tumor development, it remains difficult to cure late stages when metastases are begun. Metastatic development depends on migratory capacities acquisition by epithelial cells, involving a cytoskeleton remodeling, highly depending of intracellular calcium concentration. While plasma membrane calcium channels have been highly studied in migration processes, the role of IP₃Rs remains misunderstood. Firstly, we highlighted a correlation between IP₃R3 expression level and migratory potential of three human breast cancer cell lines with different migratory potential. Indeed, the more the migratory profile increases, the more is the expression of IP₃R3. Moreover, IP₃R3 expression modulation regulates their migratory capacities. The migratory capacities decreased when silencing IP₃R3, whereas they increased by overexpressing IP₃R3 in the low migratory breast cancer cell line (MCF-7). Furthermore, IP₃R3 silencing reveals an oscillating calcium profile, while its overexpression induces a sustained calcium profile. Secondly, we demonstrated a reverse correlation between IP₃R3 expression level and rounded shape of these three cell lines. Indeed, the longer the cell has an elongated morphology, the greater the IP₃R3 expression is important. Moreover, IP₃R3 silencing induced a rounded shape of migrating cells and decreased of protrusions and adhesion. Our results suggest IP₃R3 implication in modulation of cytoskeleton actors. Indeed, knockdown of IP₃R3 induced a decrease of ARHGAP18 and Cdc42 expression, RhoA and FAK_⁸⁶¹ activity, and a reorganization of profilactin cytoskeleton. Furthermore, in a migratory model, oscillating profile is revealed at wound realization and predominates 3 h amer in cells of the front wound whereas it sets up in cells of back only amer 3 h. The spatio-temporal gap of this oscillating calcium signal reflects an intracellular calcium dynamic essential to migratory processes and cytoskeleton remodelling in breast cancer. In conclusion, our results reveal a key role of IP₃R3 in migratory processes by profilactin cytoskeleton remodeling through ARHGAP18/ RhoA/ FAK pathway thanks to intracellular calcium profile modulation.

La prééclampsie, une pathologie obstétricale survenant dans la deuxième moitié de la grossesse, est caractérisée par l'hypertension et la proteinuric L'étiologie de la prééclampsie est inconnue mais un défaut de placentation pourrait contribuer à son établissement. Plusieurs études ont lié la prééclampsie au stress oxydatif, défini comme un déséquilibre entre les oxydants et les antioxydants. Le stress oxydatif pourrait aussi jouer un rôle dans la régulation de l'inflammation et de l'hypertension en prééclampsie. Au cours de cette étude, nous avons confirmé la présence du stress oxydatif dans le placenta prééclamptique grâce à l'analyse des marqueurs de stress Hème-Oxygénase (HO-1) et Protéine de choc thermique 70 (Hsp-70). L'expression des glutathion peroxydases (GPx-1 à -4) et des superoxydes dismutases (SOD1 à -3) a aussi été étudiée. Les résultats montrent une baisse des principales défenses antioxydantes enzymatiques SOD1, GPx-1 et GPx-4 dans les placentas prééclamptiques. De plus, nous avons observé que le travail durant l'accouchement influençait l'expression des défenses antioxydantes dans le placenta. Les anti oxydants non-enzymatiques, vitamine E et coenzyme Qio (CoQio) ont aussi été impliqués dans l'inflammation et l'hypertension en prééclampsie. Nous avons démontré qu'en prééclampsie, le niveau plasmatique de CoQio réduite (CoQ₁₀H₂), était lié à la concentration d'interleukine-18 (IL-18), une cytokine pro-inflammatoire. De plus, la forme oxydée de vitamine E corrélait avec le ratio de prostacycline (PGI₂)/ thromboxane (TXA₂), deux agents à effets vasoactifs. Ce travail démontre que les stress oxydatifs placentaire et systémique jouent un rôle primordial dans l'établissement de l'hypertension et de l'inflammation en prééclampsie.

Les intégrines, des récepteurs trans-membranaires exerçant une fonction importante dans l'adhésion et la migration cellulaire, pourraient contribuer aux propriétés, tumorigènes et métastatiques du mélanome uvéa!. Nous avons démontré que le patron d'expression de certaines intégrines différait entre les lignées tumorales: la sous-unité d'intégrine a4 est anormalement élevée dans la lignée métastatique H79 alors que l'expression de la sous-unité a5 est presque entièrement abolie dans des lignées à plus fort potentiel tumorigène mais non dans les lignées peu agressives. La transcription du gène a4 étant sous l'influence régulatrice du facteur de transcription (FT) Pax-6, nous avons démontré que celui-ci n'est cependant pas l'élément déterminant dans l'expression aberrante du gène a4. Sachant que le promoteur du gène a5 est sous l'influence des FTs Spl/Sp3, AP-l et NFI, nous avons démontré que l'agressivité des lignées de mélanomes pouvait être étroitement liée à des changements dans l'expression ou les propriétés de ces FTs.

Le fer est un élément vital pour l’organisme, mais peut s’avérer toxique si présent en excès. L’hepcidine est le régulateur principal de l’homéostasie du fer dans l’organisme. Un défaut d’expression d’hepcidine est à l’origine de l’hémochromatose, une maladie génétique humaine caractérisée par une surcharge en fer ; inversement, une hypersécrétion d’hepcidine est la cause de différents types d’anémie. L’hepcidine est secrétée principalement par le foie, mais des découvertes récentes ont montré que de nombreux tissus de l’organisme sont capables de produire l’hormone. Au laboratoire nous avons généré un modèle de souris transgénique permettant d’invalider le gène codant pour l’hepcidine dans les tissus d’intérêt. Ce modèle permet d’étudier la contribution de différents tissus dans l’homéostasie du fer. En comparant les souris déficientes pour l’hepcidine spécifiquement dans le foie (HepcΔfoie) avec les souris présentant une délétion de l’hepcidine dans tout l’organisme (HepcΔtot), j’ai pu montrer que les souris HepcΔfoie présentent la même surcharge en fer que les souris HepcΔtot ; dans la circulation sanguine des souris HepcΔfoie, l’hepcidine n’est pas détectable, montrant ainsi que l l’hépatocyte est la source majeure d’hepcidine pour réguler les niveaux de fer dans l’organisme. En conclusion, mes résultats ont permis de montrer que l’hepcidine hépatique est le régulateur principal de l’homéostasie du fer, et que les autres tissus ne sont pas capables de compenser. / Iron is fundamental for the organism, but can be toxic if in excess. The major regulator of iron homeostasis is hepcidin, first identified as an antimicrobial peptide. Hepcidin deficiency is associated with hereditary hemochromatosis, a human genetic disease characterized by iron overload. Conversely, abnormal hepcidin induction is the cause of some types of anemia. Hepcidin is produced and secreted mainly by the liver, but many cells and tissues express low levels of the hormone. To investigate the contribution of hepcidin-producing tissues in iron homeostasis, we generated a new mouse model in which the hepcidin gene can be conditionally inactivated: the hepcidin floxed mice. The main aim of my thesis was to evaluate the contribution of different tissues in hepcidin production and iron homeostasis regulation. I generated hepcidin liver-specific knockout mice and compared them to total knockouts: hepatic hepcidin ablation fully recapitulates the severe iron overload phenotype observed in the total knockout. Moreover, hepcidin was undetectable in the plasma of liver-specific knockouts, showing that hepatocytes are the main source of the peptide in the bloodstream. These results demonstrate that hepatic hepcidin is the major regulator of iron homeostasis and that tissues other than the liver are not able to compensate. The hepcidin floxed mice provide a useful tool for the investigation of hepcidin role in extra-hepatic tissues in physiological and pathological conditions.

Le fer est un élément vital pour l’organisme, mais peut s’avérer toxique si présent en excès. L’hepcidine est le régulateur principal de l’homéostasie du fer dans l’organisme. Un défaut d’expression d’hepcidine est à l’origine de l’hémochromatose, une maladie génétique humaine caractérisée par une surcharge en fer ; inversement, une hypersécrétion d’hepcidine est la cause de différents types d’anémie. L’hepcidine est secrétée principalement par le foie, mais des découvertes récentes ont montré que de nombreux tissus de l’organisme sont capables de produire l’hormone. Au laboratoire nous avons généré un modèle de souris transgénique permettant d’invalider le gène codant pour l’hepcidine dans les tissus d’intérêt. Ce modèle permet d’étudier la contribution de différents tissus dans l’homéostasie du fer. En comparant les souris déficientes pour l’hepcidine spécifiquement dans le foie (HepcΔfoie) avec les souris présentant une délétion de l’hepcidine dans tout l’organisme (HepcΔtot), j’ai pu montrer que les souris HepcΔfoie présentent la même surcharge en fer que les souris HepcΔtot ; dans la circulation sanguine des souris HepcΔfoie, l’hepcidine n’est pas détectable, montrant ainsi que l l’hépatocyte est la source majeure d’hepcidine pour réguler les niveaux de fer dans l’organisme. En conclusion, mes résultats ont permis de montrer que l’hepcidine hépatique est le régulateur principal de l’homéostasie du fer, et que les autres tissus ne sont pas capables de compenser. / Iron is fundamental for the organism, but can be toxic if in excess. The major regulator of iron homeostasis is hepcidin, first identified as an antimicrobial peptide. Hepcidin deficiency is associated with hereditary hemochromatosis, a human genetic disease characterized by iron overload. Conversely, abnormal hepcidin induction is the cause of some types of anemia. Hepcidin is produced and secreted mainly by the liver, but many cells and tissues express low levels of the hormone. To investigate the contribution of hepcidin-producing tissues in iron homeostasis, we generated a new mouse model in which the hepcidin gene can be conditionally inactivated: the hepcidin floxed mice. The main aim of my thesis was to evaluate the contribution of different tissues in hepcidin production and iron homeostasis regulation. I generated hepcidin liver-specific knockout mice and compared them to total knockouts: hepatic hepcidin ablation fully recapitulates the severe iron overload phenotype observed in the total knockout. Moreover, hepcidin was undetectable in the plasma of liver-specific knockouts, showing that hepatocytes are the main source of the peptide in the bloodstream. These results demonstrate that hepatic hepcidin is the major regulator of iron homeostasis and that tissues other than the liver are not able to compensate. The hepcidin floxed mice provide a useful tool for the investigation of hepcidin role in extra-hepatic tissues in physiological and pathological conditions.

Le fer est un élément vital pour l’organisme, mais peut s’avérer toxique si présent en excès. L’hepcidine est le régulateur principal de l’homéostasie du fer dans l’organisme. Un défaut d’expression d’hepcidine est à l’origine de l’hémochromatose, une maladie génétique humaine caractérisée par une surcharge en fer ; inversement, une hypersécrétion d’hepcidine est la cause de différents types d’anémie. L’hepcidine est secrétée principalement par le foie, mais des découvertes récentes ont montré que de nombreux tissus de l’organisme sont capables de produire l’hormone. Au laboratoire nous avons généré un modèle de souris transgénique permettant d’invalider le gène codant pour l’hepcidine dans les tissus d’intérêt. Ce modèle permet d’étudier la contribution de différents tissus dans l’homéostasie du fer. En comparant les souris déficientes pour l’hepcidine spécifiquement dans le foie (HepcΔfoie) avec les souris présentant une délétion de l’hepcidine dans tout l’organisme (HepcΔtot), j’ai pu montrer que les souris HepcΔfoie présentent la même surcharge en fer que les souris HepcΔtot ; dans la circulation sanguine des souris HepcΔfoie, l’hepcidine n’est pas détectable, montrant ainsi que l l’hépatocyte est la source majeure d’hepcidine pour réguler les niveaux de fer dans l’organisme. En conclusion, mes résultats ont permis de montrer que l’hepcidine hépatique est le régulateur principal de l’homéostasie du fer, et que les autres tissus ne sont pas capables de compenser. / Iron is fundamental for the organism, but can be toxic if in excess. The major regulator of iron homeostasis is hepcidin, first identified as an antimicrobial peptide. Hepcidin deficiency is associated with hereditary hemochromatosis, a human genetic disease characterized by iron overload. Conversely, abnormal hepcidin induction is the cause of some types of anemia. Hepcidin is produced and secreted mainly by the liver, but many cells and tissues express low levels of the hormone. To investigate the contribution of hepcidin-producing tissues in iron homeostasis, we generated a new mouse model in which the hepcidin gene can be conditionally inactivated: the hepcidin floxed mice. The main aim of my thesis was to evaluate the contribution of different tissues in hepcidin production and iron homeostasis regulation. I generated hepcidin liver-specific knockout mice and compared them to total knockouts: hepatic hepcidin ablation fully recapitulates the severe iron overload phenotype observed in the total knockout. Moreover, hepcidin was undetectable in the plasma of liver-specific knockouts, showing that hepatocytes are the main source of the peptide in the bloodstream. These results demonstrate that hepatic hepcidin is the major regulator of iron homeostasis and that tissues other than the liver are not able to compensate. The hepcidin floxed mice provide a useful tool for the investigation of hepcidin role in extra-hepatic tissues in physiological and pathological conditions.

L'hémolyse intravasculaire est la destruction prématurée et chronique des globules rouges. Elle est caractérisée par une libération accrue d’hème et de microvésicules (MV) membranaires dans la circulation sanguine. L'hémolyse chronique est une des caractéristiques de la drépanocytose. Elle joue un rôle très important dans la physiopathologie de la drépanocytose. La drépanocytose est associée à une agrégation des globules rouges dans la circulation, menant à des occlusions vasculaires et des crises vaso-occlusives extrêmement douloureuses. Les travaux précédents de l’équipe dans la drépanocytose, ont montré que les MV de globules rouges transfèrent de l’hème aux cellules endothéliales, participent à la dysfonction vasculaire et induisent des vaso-occlusions rénales dans un modèle de souris drépanocytaire. Ces résultats nous ont incités à poursuivre l’étude des effets des MV de globules rouges, chargées en hème. Nous avons émis l’hypothèse que les MV chargées en hème stimulent également l’inflammation dans la drépanocytose au de-là de la dysfonction endothéliale. Ce travail regroupe trois parties. Dans une première partie, nous nous sommes intéressés à l’effet pro-inflammatoire des MV de globules rouges, chargées en hème. Nous avons démontré que les MV stimulent les neutrophiles qui libèrent leur ADN. Les taux plasmatiques d’ADN extracellulaire sont élevés dans la drépanocytose, comparés aux taux plasmatiques chez les individus sains, et augmentent encore durant les crises vaso-occlusives. Cet ADN, qui pourrait provenir en partie des pièges extracellulaires d’ADN (dits NETs), affecte l’hémorhéologie drépanocytaire en modifiant les propriétés d’agrégation et d’adhésion des globules rouges. Par ailleurs, nous avons constaté que le plasma des patients drépanocytaires était incapable de dégrader l’ADN in vitro, et présentait une activité DNase plasmatique réduite. La baisse de l’activité DNase dans la drépanocytose crée un déséquilibre entre les taux d’ADN circulant et son inhibiteur endogène. En contre partie, une supplémentation en DNase-I humaine recombinante par perfusion intraveineuse a libèré les vaso-occlusions rénales dans le modèle de souris drépanocytaire et a réduit l’excès d’agrégation et d’adhésion des globules rouges drépanocytaires. Ces résultats démontrent un déséquilibre entre les taux d’ADN circulant et l’activité DNase chez les patients drépanocytaires conduisant à une inflammation chronique, une forte agrégation des globules rouges et la survenue des vaso-occlusions. Dans une deuxième partie, nous nous sommes intéressés aux effets du remodelage et du remaniement membranaire des globules rouges dans la drépanocytose. Nous avons identifié que les globules rouges et leurs MV sont associés à une externalisation accrue de la phosphatidylsérine et que cette externalisation accrue ne résulte pas d’une composition lipidique modifiée de la membrane des globules rouges, mais, il s’agit principalement d'une externalisation exagérée de la phosphatidylsérine. L’externalisation de la phosphatidylsérine contribue aux occlusions vasculaires in vivo. La neutralisation de la phosphatidylsérine des MV et des globules rouges avec de l’annexine-A5 recombinante permet la libération des vaso-occlusions rénales induites par les MV de globules rouges dans le modèle de souris drépanocytaire. Ces résultats démontrent le rôle de la phosphatidylsérine externalisée par les globules rouges et les MV dans les occlusions vasculaires in vivo et le potentiel thérapeutique de l’annexine-A5 pour restaurer l’hémorhéologie et la perfusion tissulaire durant les vaso-occlusions drépanocytaires. Dans une troisième partie, nous nous sommes intéressés aux annexines en tant qu’inhibiteurs endogènes de la phosphatidylsérine des membranes de globules rouges et de MV. Nous avons mis au point un nouveau test qui permet de quantifier la fonctionnalité de l’annexine-A5 et –A7. (...) / Pas de résumé

Thèse de doctorat : Biologie cellulaire et moléculaire : Evry-Val d'Essonne : 2008. / Titre provenant de l'écran-titre.

Le lien entre la prolactine (PRL) et la tumorigenèse mammaire est soutenu par de nombreux arguments expérimentaux, cliniques et épidémiologiques. Cependant, aucune mutation des gènes de la PRL ou de son récepteur (PRLR) n'a jamais été identifiée dans le contexte du cancer du sein. En 2008, notre Laboratoire a identifié le premier polymorphisme gain-de-fonction du PRLR chez des patients présentant une forme rare de tumeur mammaire bénigne (polyadénomatose mammaire). En effet, la seule substitution de l'isoleucine 146 par une leucine dans le domaine extracellulaire du PRLR lui confère une activité de signalisation basale plus élevée que le PRLR sauvage. Dans le cadre de ma thèse, nous avons essayé de déterminer expérimentalement quelles pouvaient être les conséquences de l'expression d'un PRLR constitutivement activé dans une cellule mammaire saine ou tumorale. Pour ce faire, nous avons utilisé deux approches complémentaires. D'une part, nous avons généré deux modèles de souris knock-in ayant intégré une seule copie du PRLR humain, muté (I146L) ou sauvage (en contrôle). Nous avons ensuite analysé les phénotypes mammaires de ces souris à différents âges. Nous n'avons observé aucun développement tumoral, indiquant que le PRLR-I146L n'est pas un oncogène. Néanmoins, les glandes mammaires des souris âgées présentent certaines anomalies histologiques suggérant une interférence possible du PRLR muté avec la différenciation mammaire. L'analyse des ces phénotypes doit être poursuivie pour en déterminer l'ampleur exacte et les mécanismes potentiels. D'autre part, nous avons réalisé une étude in vitro en utilisant des cellules tumorales mammaires humaines. Une étude parallèle au Laboratoire ayant permis de montrer que la substitution I146D conduisait à une activité constitutive plus forte que le polymorphisme naturel I146L, nous avons généré des clones stables de deux lignées tumorales mammaires humaines exprimant le PRLR-I146D. Malgré une signalisation constitutive démontrée, l'expression de ce PRLR muté ne procure aucun avantage sélectif aux cellules tumorales en termes de prolifération, ni ne modifie leur phénotype histologique (Zhang, Cherifi et al, en révision). En conclusion, notre travail a permis de montrer que la seule expression d'un variant gain-de-fonction du PRLR est insuffisante pour transformer une cellule mammaire saine, ou pour favoriser la prolifération de cellules mammaires tumorales. / The link between prolactin (PRL) and mammary tumorigenesis is supported by many experimental, clinical and epidemiologic data. However, mutations on the gene coding for PRL or its receptor (PRLR) have never been identified in the context of breast cancer. In 2008, our Laboratory identified the first gain-of-function polymorphism of the PRLR in patients presenting with a rare form of benign mammary tumors (mammary polyadenomatosis). Indeed, the one-residue substitution of isoleucine 146 by a leucine in the extracellular domain of the PRLR conferred a higher basal activity than that of the wild-type PRLR. Within the framework of my thesis, we have tried to determine the consequences of expressing a constitutively active PRLR in a healthy or cancerous mammary cell. With this aim, we have used two complementary approaches. On one hand, we generated two models of knock-in mice carrying only one copy of the mutated (I146L) or wild-type (as control) human PRLR. We then analyzed the mammary phenotypes of these mice at various ages. We did not observe any tumor development, indicating that the PRLR-I146L is not an oncogene. Nevertheless, the mammary glands of old mice presented certain histological anomalies suggesting a possible interference of the mutated PRLR with normal mammary differentiation. The analysis of these phenotypes must continue to determine their extent and the potential underlying mechanisms. On the other hand, we carried out an in vitro study using human breast cancer cell lines. A parallel study in the Laboratory had showed that the I146D substitution led to a stronger constitutive activity of the PRLR than the natural I146L polymorphism. Thus, we generated stable clones of two human breast cancer cell lines expressing the PRLR-I146D. In spite of its constitutive activity, the expression of PRLR-I146D did not result in any selective advantage for tumor cells in terms of proliferation, nor did it modify their histological phenotype (Zhang, Cherifi et al., in revision). In conclusion, our work has shown that the expression of a gain-of-function mutation in the PRLR is insufficient to transform a healthy mammary cell, or to enhance the proliferation of mammary cancer cells.