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Le lien entre la prolactine (PRL) et la tumorigenèse mammaire est soutenu par de nombreux arguments expérimentaux, cliniques et épidémiologiques. Cependant, aucune mutation des gènes de la PRL ou de son récepteur (PRLR) n'a jamais été identifiée dans le contexte du cancer du sein. En 2008, notre Laboratoire a identifié le premier polymorphisme gain-de-fonction du PRLR chez des patients présentant une forme rare de tumeur mammaire bénigne (polyadénomatose mammaire). En effet, la seule substitution de l'isoleucine 146 par une leucine dans le domaine extracellulaire du PRLR lui confère une activité de signalisation basale plus élevée que le PRLR sauvage. Dans le cadre de ma thèse, nous avons essayé de déterminer expérimentalement quelles pouvaient être les conséquences de l'expression d'un PRLR constitutivement activé dans une cellule mammaire saine ou tumorale. Pour ce faire, nous avons utilisé deux approches complémentaires. D'une part, nous avons généré deux modèles de souris knock-in ayant intégré une seule copie du PRLR humain, muté (I146L) ou sauvage (en contrôle). Nous avons ensuite analysé les phénotypes mammaires de ces souris à différents âges. Nous n'avons observé aucun développement tumoral, indiquant que le PRLR-I146L n'est pas un oncogène. Néanmoins, les glandes mammaires des souris âgées présentent certaines anomalies histologiques suggérant une interférence possible du PRLR muté avec la différenciation mammaire. L'analyse des ces phénotypes doit être poursuivie pour en déterminer l'ampleur exacte et les mécanismes potentiels. D'autre part, nous avons réalisé une étude in vitro en utilisant des cellules tumorales mammaires humaines. Une étude parallèle au Laboratoire ayant permis de montrer que la substitution I146D conduisait à une activité constitutive plus forte que le polymorphisme naturel I146L, nous avons généré des clones stables de deux lignées tumorales mammaires humaines exprimant le PRLR-I146D. Malgré une signalisation constitutive démontrée, l'expression de ce PRLR muté ne procure aucun avantage sélectif aux cellules tumorales en termes de prolifération, ni ne modifie leur phénotype histologique (Zhang, Cherifi et al, en révision). En conclusion, notre travail a permis de montrer que la seule expression d'un variant gain-de-fonction du PRLR est insuffisante pour transformer une cellule mammaire saine, ou pour favoriser la prolifération de cellules mammaires tumorales. / The link between prolactin (PRL) and mammary tumorigenesis is supported by many experimental, clinical and epidemiologic data. However, mutations on the gene coding for PRL or its receptor (PRLR) have never been identified in the context of breast cancer. In 2008, our Laboratory identified the first gain-of-function polymorphism of the PRLR in patients presenting with a rare form of benign mammary tumors (mammary polyadenomatosis). Indeed, the one-residue substitution of isoleucine 146 by a leucine in the extracellular domain of the PRLR conferred a higher basal activity than that of the wild-type PRLR. Within the framework of my thesis, we have tried to determine the consequences of expressing a constitutively active PRLR in a healthy or cancerous mammary cell. With this aim, we have used two complementary approaches. On one hand, we generated two models of knock-in mice carrying only one copy of the mutated (I146L) or wild-type (as control) human PRLR. We then analyzed the mammary phenotypes of these mice at various ages. We did not observe any tumor development, indicating that the PRLR-I146L is not an oncogene. Nevertheless, the mammary glands of old mice presented certain histological anomalies suggesting a possible interference of the mutated PRLR with normal mammary differentiation. The analysis of these phenotypes must continue to determine their extent and the potential underlying mechanisms. On the other hand, we carried out an in vitro study using human breast cancer cell lines. A parallel study in the Laboratory had showed that the I146D substitution led to a stronger constitutive activity of the PRLR than the natural I146L polymorphism. Thus, we generated stable clones of two human breast cancer cell lines expressing the PRLR-I146D. In spite of its constitutive activity, the expression of PRLR-I146D did not result in any selective advantage for tumor cells in terms of proliferation, nor did it modify their histological phenotype (Zhang, Cherifi et al., in revision). In conclusion, our work has shown that the expression of a gain-of-function mutation in the PRLR is insufficient to transform a healthy mammary cell, or to enhance the proliferation of mammary cancer cells.

Le cancer du sein a touché près de 49000 femmes en France en 2012. Deux pour cents surviennent chez des femmes de moins de 35 ans. Comme beaucoup de femmes reportent leur maternité à plus tard, les médecins font de plus en plus face aux questions relatives à une grossesse post-traitement. L’histoire reproductive, les influences hormonales et le cancer du sein semblent liés. Pourtant aucune étude n’a rapporté d’impact péjoratif de la grossesse sur l’évolution du cancer ; par contre beaucoup d’études ont annoncé que la grossesse n’avait aucun impact, et pourrait même avoir un effet de protection à long terme. Toutefois l’interprétation des résultats est souvent limitée par un biais de confusion connu, le « healthy mother bias » : seules les femmes se sentant en bonne santé vont mener une grossesse. La grossesse est donc un événement dont la survenue est liée au statut pronostique de la patiente et qui pourrait interagir avec l’hormonosensibilité du cancer du sein. Pour tenter de prendre en compte ce biais de confusion dans l’estimation et l’interprétation de l’effet d’une grossesse qui est un événement survenant au cours du temps, nous avons exploré deux approches. La grossesse est assimilée à une exposition survenant au cours du temps. Dans un premier temps nous avons appliqué le modèle « illness-death » sur des données de cohorte : l’exposition est l’état intermédiaire dont la valeur dépend du temps ; l’estimation des facteurs influençant le passage vers l’exposition permet une évaluation qualitative de la confusion. L’effet de l’exposition est étudié à partir de la comparaison des transitions vers l’événement d’intérêt : celles ayant eu l’événement intermédiaire versus les autres. Cet effet est estimé en prenant en compte l’interaction entre les facteurs pronostiques caractérisant le niveau de gravité de la maladie et l’exposition. Dans la seconde approche, nous avons constitué, à partir de la cohorte, des paires composées d’un sujet exposé et d’un sujet non exposé. Dans la littérature, l’appariement est réalisé en créant les paires a posteriori comme si la grossesse était connue lors du diagnostic du cancer. Nous proposons, dans ce cas particulier où l’événement caractérisant les sujets d’une paire survient au cours du temps, une nouvelle méthode d’appariement. De plus, nous étudions des modèles d’analyse connus et dédiés aux données censurées corrélées : le modèle de Cox stratifié de Holt et Prentice, le plus utilisé, et le modèle de Cox de Lee Wei et Amato. Tout le travail est basé sur une large étude de simulation afin d’estimer et interpréter l’effet pronostique d’un événement survenant au cours du temps et en lien avec le statut pronostique. Les conclusions de ces simulations ont été appliquées à l’analyse d’une cohorte réelle de patientes jeunes traitées pour un cancer du sein, afin d’évaluer l’effet d’une éventuelle grossesse post-traitement sur l’évolution de la maladie. / Almost fifty thousand women were treated for breast cancer in France in 2012. Two percents occur in women under 35 years old. As more women are postponingchildbearing until later life, physicians are more often faced with questions regarding their subsequent pregnancy. Reproductive history, hormonal influences, and breastcarcinoma may be interrelated. However no study has reported a pejorative effect of the pregnancy on the breast cancer recurrences; many studies have found that pregnancy has no adverse effects on clinical outcome in women diagnosed previously with breast cancer, and may even have a long-term protective effect in some. This phenomenon may be due to the « healthy mother bias »: only women who feel well will pursue a subsequent pregnancy. So the pregnancy is an event which occurrence is linked to the prognostic status of the patient; and its appearance might interact with the hormonal sensitivity of the breast cancer. To try to take into account this confusion bias in the estimation and interpretation of the pregnancy effect, we explore two approaches. The pregnancy is considered as an exposure. In a first way, we apply the illness-death model to analyze cohort data: the exposition is the intermediate state which value depends on time; the estimation of the factors related to the transition to the exposure allows a qualitative evaluation of the confusion. The effect of the exposure is studied through the comparison between the transitions to the event of interest: those which underwent the intermediate state and the others. This effect is estimated by taking into account the interaction between the exposure and the prognostic factors characterizing the gravity of the disease as reflecting the health status. In the second approach, pairs composed of an exposed and a non-exposed subject are created from the cohort data. In the literature, the matching is realized by creating pairs a posteriori, as if the pregnancy was known at the cancer diagnosis date. We propose in this particular case where the event characterizing the member of the pair is an event occurring over time, a newmatching method. Moreover, we studied some known models of analysis dedicated to the censored correlated data: the stratified Cox model of Holt and Prentice, the more used, and the Cox model of Lee, Wei and Amato. All the work is based on a large simulation study in order to estimate and interpret the prognostic effect of an event occurring over time and related to the prognostic status. The simulations conclusions were applied to the analysis of real data of young women treated for a breast cancer, in order to evaluate the possible prognostic effect of a subsequent pregnancy.

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Le cancer du sein touche une femme sur huit dans le monde et représente un problème majeur de santé publique. Alors que la majorité des tumeurs du sein sont aujourd’hui la cible de traitement efficaces, il reste une sous-population de tumeurs (dites triple-négatives) à fort potentiel métastatique qui ne sont pas accessibles aux thérapies ciblées et demeurent de mauvais pronostic. L’élucidation des processus impliqués dans la progression tumorale et la formation de métastases reste un challenge majeur dans la recherche de nouvelles thérapies contre le cancer du sein de mauvais pronostic. ATIP3 (AT2-interacting protein 2), produit du gène candidat suppresseur des tumeurs MTUS1 (Microtubule-Associated Tumor Suppressor), a été identifiée par le laboratoire comme étant un biomarqueur des tumeurs du sein les plus agressives. En effet, les résultats précédents de notre équipe ont montré que l’expression d’ATIP3 est diminuée dans 85% des tumeurs de haut grade, 83% des tumeurs triples négatives et dans 62% des tumeurs métastatiques. Il a également été montré qu’ATIP3 inhibe la prolifération cellulaire in vitro, ainsi que la croissance tumorale in vivo. Au niveau moléculaire, ATIP3 a été identifiée comme étant une nouvelle protéine associée aux microtubules (MAP) localisée au centrosome, le long de microtubules dans les cellules en interphase, au fuseau mitotique pendant la division cellulaire et au pont intercellulaire lors de la cytokinèse. La localisation cellulaire d’ATIP3, étroitement associée aux microtubules, prend toute son importance du fait du rôle de ce cytosquelette dans la division et migration cellulaire, deux étapes essentielles du processus tumoral.Mon projet de thèse a pour objectif principal d'évaluer le rôle potentiel d'ATIP3 dans la migration cellulaire et la formation de métastases tumorales. Dans un premier temps, les niveaux d’expression d’ATIP3 ont été analysés dans des séries de puces à ADN issues de trois cohortes indépendantes de patientes atteintes d’un cancer du sein invasif, et les données ont été comparées avec les caractéristiques cliniques des patientes. Ces analyses transcriptomiques ont permis de montrer que l’expression d’ATIP3 est un marqueur pronostic de la survie des patientes et de façon intéressante, qu’ATIP3 est un nouvel indicateur de la progression métastatique. L’effet d’ATIP3 sur la progression des métastases a alors été évalué dans un modèle de bioluminescence in vivo, ce qui a permis de montrer que cette protéine est une molécule anti-métastatique qui réduit la progression, le nombre et la taille des foyers métastatiques. La colonisation métastatique inclut la migration des cellules cancéreuses à travers la matrice extracellulaire (invasion) et l’endothélium vasculaire (extravasation), puis leur prolifération au site secondaire. L’évaluation détaillée de ces étapes a montré qu’ATIP3 diminue tous ces processus. En ce qui concerne la migration, une réduction de vitesse, de la direction de migration et possiblement de la polarité cellulaire, pourraient expliquer les effets inhibiteurs d’ATIP3 sur la migration des cellules. Comme de nombreuses études ont démontré que la migration et la polarité cellulaires dépendent du cytosquelette de microtubules, je me suis intéressée aux effets d’ATIP3 sur la dynamique microtubulaire. Des expériences de vidéomicroscopie ont permis de montrer que l’extinction d’ATIP3 augmente la dynamique des microtubules en incrémentant les épisodes et la vitesse de croissance et en diminuant le temps passé en pause et la fréquence des catastrophes. Ces résultats, couplés à des expériences de dépolymérisation et de re-croissance ont permis de conclure qu’ATIP3 est une MAP qui stabilise les microtubules et diminue leur dynamique pour contrôler la polarité et la migration cellulaires. L’ensemble de ces travaux font l’objet d’une publication parue en 2013 (Molina et al., Cancer Res 73, 2905). (...) / Breast cancer is the most common malignancy in women, affecting one out of eight women worldwide. Even if most of the breast tumors are efficiently treated using targeted therapies, there is still a heterogeneous breast cancer subpopulation known as “triple-negative”, which is highly metastatic and, due to the absence of targeted therapies, of poor prognosis. The elucidation of the processes involved in tumor progression and metastasis remains an important challenge in the search for new therapies against this subtype of breast cancer. Previous results from the laboratory have shown that ATIP3, a major product of the candidate tumor suppressor gene MTUS1, is a microtubule associated protein (MAP), whose expression is decreased in 85% of high grade, 83% of triple negative and 62% of metastatic breast carcinomas. Re-expression of ATIP3 in breast cancer cells significantly reduces cell proliferation in vitro, and tumor growth in vivo. Based on these results, my PhD project aimed at evaluating the role of ATIP3 in tumor cell migration and cancer metastasis. In the first part of my thesis, I will present data showing that ATIP3 is a novel prognostic marker for breast cancer patients’ survival and a new anti-metastatic molecule. By means of DNA microarray analysis, we showed that low ATIP3 expression levels correlate with reduced overall survival of metastatic breast cancer patients. Using an in vivo model for cancer metastasis, we then showed that re-expression of ATIP3 reduces metastatic progression and lowers the number and size of metastatic foci. At the functional level, ATIP3 reduces breast cancer cell migration by reducing cell velocity and directionality. At the molecular level we further showed, using nocodazole washout experiments and MT growing ends tracking, that ATIP3 slows MT regrowth and decreases MT dynamics. Altogether, these studies indicate that ATIP3 is a novel MT stabilizing protein that controls the ability of MT tips to reach the cell cortex during migration, a mechanism that may account for reduced cell migration and metastasis. In the second part of my thesis, I will present data investigating the mechanisms by which ATIP3 regulates MT dynamics. To this end, we searched for new ATIP3-interacting partners. Interestingly, EB1, the core component of plus-end tracking proteins, was found to interact with ATIP3 not at the growing end of the MTs (as most EB1-interacting proteins), but mostly in the cytosol and at the MT lattice. The identification of the EB1-interacting domain of ATIP3 (termed CN) and further characterization of deletion mutants revealed that ATIP3-EB1 interaction is involved in impaired accumulation of EB1 at the plus-end. Based on these results and on FRAP analysis of EB1-GFP fluorescence recovery, a model was proposed in which the interaction between ATIP3 and EB1 may slower EB1 turnover at the MT plus-end, possibly by limiting EB1 association with its recognition site. In line with this model, in ATIP3-depleted cells dynamic EB1 molecules are more prone to accumulate at the growing end to increase MT dynamics. Relevance of this model in human pathology was then tested by evaluating ATIP3-EB1 expression levels in breast tumors, indicating that combined relative expression levels of both proteins may be considered as a prognostic marker of patient survival. Finally, in a third part of my thesis, I will present some preliminary data showing that ATIP3 may interact with the depolymerizing kinesin MCAK and the tumor suppressor APC, both of which are also well-known partners of EB1. The characterization and the implication of these interactions on ATIP3 functions (MT dynamics for MCAK interaction and cell polarity for APC interaction) remains to be investigated.

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La protéine Damaged DNA-Binding 2 (DDB2) est connue pour son rôle dans la réparation de l'ADN lésé par les UV. Cependant, le laboratoire a montré que cette protéine est surexprimée naturellement dans les cellules tumorales mammaires non métastatiques et active leur prolifération, en favorisant leur entrée en phase de transition G1/S du cycle cellulaire. Il a été montré que cette nouvelle activité biologique de DDB2 dépend de sa capacité à intervenir dans la transcription de gènes cibles, comme celui codant l'enzyme anti-oxydante, la superoxyde dismutase à manganèse (SOD Mn). Sur la base que DDB2 est peu ou pas exprimée dans les cellules tumorales mammaires métastatiques, ce travail a consisté à étudier le rôle de cette protéine dans les capacités invasives de ces cellules. Dans un 1er temps, nous avons montré que les cellules tumorales mammaires hautement métastatiques (MDA-MB231 et SKBR3), lorsqu'elles surexpriment DDB2 après introduction de son gène, ont des capacités migratrices et invasives in vitro, ainsi que des propriétés in vivo à développer des métastases pulmonaires, fortement réduites, en association avec une diminution importante de l'expression de la métalloprotéase matricielle 9 (MMP-9). De même, lors d'une analyse rétrospective sur 92 échantillons cliniques provenant de patientes, une corrélation inverse entre l'expression de DDB2 et le haut grade (SBR>ou =3) des tumeurs mammaires est observée. Dans un 2ème temps, nous avons identifié le mécanisme moléculaire par lequel DDB2 agit négativement sur les capacités invasives des cellules tumorales mammaires. Nous avons montré que DDB2 intervient positivement sur l'expression du gène codant I kappa B alpha (IkBa), en se fixant sur une séquence d'ADN localisée dans la région proximale du promoteur, qui entraîne en conséquence une forte diminution de l'activité du facteur de transcription NF-kB. Ce dernier est connu pour son rôle dans les capacités invasives et migratrices des cellules tumorales mammaires métastatiques, en régulant de nombreux gènes cibles comme celui codant la MMP-9. Nous avons montré, que l?inhibition de l'expression d'IkBa, par ARN interférence restaure en partie les propriétés invasives des cellules tumorales mammaires métastatiques surexprimant DDB2, en association avec une réexpression de MMP-9. Dans un 3ème temps, nous avons également montré dans les cellules tumorales mammaires métastatiques, que l?expression constitutivement élevée de la SOD Mn, en l'absence de DDB2, dépend de l'activité conjointe des facteurs de transcription NF-kB et Sp1, révélant ainsi un autre mécanisme moléculaire impliqué dans les propriétés invasives de ces cellules. L'ensemble de ce travail contribue ainsi à mieux comprendre comment les cellules tumorales mammaires progressent vers un statut invasif et renforce également l'idée que DDB2 présente un intérêt clinique potentiel, comme marqueur prédictif de la progression métastatique des tumeurs mammaires. Enfin, la relation entre la DDB2, NF-kB et la SOD Mn représente une voie intéressante pour le développement de nouvelles thérapies anticancéreuses / The Damaged DNA-Binding 2 protein (DDB2) is known to play a role in repair of UV-induced DNA damages. However, the laboratory has shown that this protein is overexpressed in nonmetastatic breast tumor cells and stimulates their proliferation by favouring their entry in G1/S transition phase of cell cycle. This novel biological activity of DDB2 depends on its ability to modulate transcription of target genes, such as that encoding the manganese superoxide dismutase (MnSOD) antioxidant enzyme. The fact that DDB2 is not expressed in metastatic breast tumor cells led us to focuse this work on the role of DDB2 in the invasive abilities of these cells. In a 1st time, we have shown that highly metastatic breast tumor cells (MDA-MB231 et SKBR3), when they overexpress DDB2 after introduction of its gene, have a strong decrease in their in vitro migratory and invasive abilities, and in their properties to develop in vivo lung metastasis, associated with a highly reduced expression of matrix metalloprotease 9 (MMP-9). In addition, DDB2 expression was analyzed in a cohort of 92 breast samples from patients. An inverse correlation is observed between DDB2 level and the high-grade (SBR>=3) breast tumors. In a 2nd time, we identified the molecular mechanism by which DDB2 controls negatively the invasive abilities of breast tumor cells. We have shown that DDB2 plays a positive role in the expression of gene encoding I kappa B alpha gene (IkB?), though its binding to a specific DNA sequence localized in the proximal promoter, and which promotes a strong decrease in the NF-kB activity. This transcription factor is well known to play a role in migratory and invasive abilities of metastatic breast tumor cells by regulating many target genes, such as that encoding MMP-9. We have shown that inhibition by RNA interference of I?B? expression restores in part the invasive properties of DDB2-overexpressing metastatic breast tumor cells, associated with an induction of MMP-9 gene expression. In a 3rd time, we have also shown in metastatic breast tumor cells, that the high basal MnSOD expression, when DDB2 is lacking, depends on the related activity of the NF-kB and Sp1 transcription factors, considering that this other molecular mechanism is involved in invasive properties of these cells. Taken together, this work contributes to a better understanding how breast tumor cells progress toward an invasive phenotype and underlines also the idea that DDB2 has a clinical relevance as a good potential marker for predicting breast tumor progression toward metastasis. Finally, the relationship between DDB2, NF-kB and MnSOD may be considered as an interesting pathway for development of new anticancer therapies

Dans le cadre de la recherche de nouvelles cibles pour le traitement du cancer, les phosphatases Cdc25 sont des candidats intéressants dont l'inhibition devrait permettre de ralentir la croissance tumorale et éventuellement d'améliorer les traitements actuellement en usage. Les objectifs de ce projet de thèse sont de concevoir et synthétiser de nouveaux composés capables d'inhiber les CDC25, et de déterminer l'efficacité des meilleurs composés dans les lignées cellulaires du cancer du sein. L'évaluation du potentiel inhibiteur des composés est réalisée in vitro par une méthode fluorimétrique très sensibilité (substrat 3-OMFP). Les effets des composés sont évalués dans les lignées cellulaires MCF-7 et MDA-MB-231 : La viabilité des cellules est évaluée par la méthode colorimétrique du MTT, la cytotoxicité est évaluée par coloration au bleu trypan et par observation microscopique avec le système de vidéomicroscopie Incucyte. La mort cellulaire est caractérisée par la détection de marqueurs apoptotiques (caspases) et de marqueurs des dommages de l'ADN (H.2AX Histone PARP) par western blot. L'analyses des mécanismes liés à la mort cellulaire sont explorées par cytométrie en flux via la détection d'espèces réactives de l'oxygène (ERO) avec les sondes H2DCFDA et Redox Sensor Red. L'inhibition de CDC25 dans les cellules est évaluée indirectement par détection des formes phosphorylées dse CDK en Western Blot. L'évaluation in vitro de 93 molécules synthétisées nous a permis d'identifier de nouveaux composés actifs. Ils appartiennent à diverses familles chimiques comprenant des stéroïdes, thiophènes, coumarines, imidazoles ainsi que des dérivés de quinone. Les dérivés coumariniques ont montré une intéressante inhibition de CDC25, non décrite jusqu'à présent. Une nouvelle structure coumarine-soufre-quinone, nommée SV37, a été conçue pour optimiser le potentiel d'inhibition. Ce composé présente un fort potentiel inhibiteur des CDC25 in vitro (CI50 < 5uM pour CDC25 A et C). L'effet de SV37 sur la croissance cellulaire a été évalué sur les lignées cellulaires MCF-7, MDA-MB-231, hTERT-HME1 et HepG2 sur lesquelles une inhibition de la croissance cellulaire est observée (CI50 de 9 à 18 µM). L'analyse de la viabilité des cellules traitées à la CI50 indique l'absence de mort cellulaire pour la lignée MCF7, tandis que pour la lignée MDA-MB-231 la diminution de la croissance cellulaire est liée à une augmentation de la mort cellulaire. Afin d'étudier les mécanismes liés à la mort cellulaire, nous nous sommes concentrés sur l'étude du modèle triple négatif MDA-MB- 231. Les modifications morphologiques de ces cellules sont caractérisées par l'apparition d'altérations cellulaires compatibles avec la mort cellulaire. Le clivage des caspase-3 et 7 a été observé dès 16h de traitement, ce qui suggère l'induction d'une mort apoptotique. Par ailleurs, des ERO ont été détectées 15 min après le début du traitement, cette émission d'ERO a pu être totalement bloquée par un prétraitement avec la N-acétylcystéine (NAC). La détection de marqueurs des dommages de l'ADN, entre 16 et 28 heures après début du traitement, corrobore l'activation des caspases et les observations réalisées en vidéo-microscopie. Après traitement à CI50, une accumulation des pCDK dans les cellules a été observée après 4 et 8 heures, suggérant une inhibition de l'activité CDC25. De plus, les cellules prétraitées avec la NAC n'ont montré aucune accumulation de pCDK après traitement par SV37. Ces résultats suggèrent un lien direct entre la production de ROS induit par le composé SV37 et l'inhibition des CDC25. Ce projet a permis de définir les coumarines en tant que nouvelle classe de composés inhibitrice des phosphatases CDC25. Ces travaux ont de plus permis l'identification d'un composé coumarine-soufre-quinone SV37 qui constitue une structure de base pour le développement d'inhibiteurs de plus en plus efficaces, ... / Within the context of research for new targets for cancer therapy, Cdc25 phosphatases are interesting candidates, the inhibition of which being able to slow down tumor growth and eventually improve the cancer treatments currently in use. The objectives of this PhD project are to design and synthesize new compounds able to inhibit CDC25 and to determine efficiency of identified compounds in breast cancer cell lines. In vitro evaluation of inhibitory potential of compound is realized through a high sensitivity fluorometric method (3-OMFP substrate). Cellular effects were evaluated in MCF-7 and MDA-MB-231 cell lines. Effects on cell viability are assessed through MTT assays, and cytotoxicity is evaluated through trypan blue assays and microscopic observations with Incucyte videomicroscopy system. Cell death was characterized by detection of apoptotic markers (caspases) and DNA damages markers (PARP Histone H.2AX) by Western Blotting. The analyses of mechanisms underlying cell death were explored through cytometric detection of reactive oxygen species (ROS) with H2DCFDA and Redox Sensor Red probes. Inhibition of CDC25 in cells was indirectly evaluated through detection of phosphorylated forms of CDK by Western Blotting. In vitro evaluation of 93 synthesized compounds allowed us to find new active compound in various chemical families including steroid, thiophene, coumarinic, imidazole and quinone derivatives. The coumarinic derivatives showed potent CDC25 inhibition. A new coumarin-sulfurquinone combined structure, named SV37, was designed to optimize efficiency of inhibition. In vitro tests on this compound, showed a strong CDC25 inhibitory potential (IC50 under 5µM for CDC25 A and C). Effect of SV37 on cell growth was evaluated on various cell lines (MCF-7, MDA-MB-231, hTERT-HME1 and HepG2). Results indicate inhibition of cell growth (IC50 values from 9 to 18 µM). Analysis of cell viability indicates no remarkable cell death in MCF7 at IC50 value whereas in MDA-MB-231 the cell growth decrease was characterized by an increase of cell death. For deeper investigations on the cell death and on the underlying mechanisms, we focused the study on the triple negative model MDA-MB-231. The morphological changes of MDA-MB-231 cells during the treatment were characterized by the appearance of cellular alterations compatible with a cellular demise and culminating with a disruption of cells after 20h. Caspase-3 and 7 cleavages were observed 16h after beginning of the treatment, suggesting an apoptotic cell death. A ROS induction was observed 15 min after the beginning of the treatment and was totally prevented by Nacetylcysteine (NAC) pretreatment. DNA damage markers were detected between 16 and 28 hours after beginning of treatment, a timing falling with caspase activation and with the appearance of cell demise observed by video microscopy. Accumulation of pCDK in cells was observed after 4 and 8 hr of treatment by SV37 at IC50 suggesting an inhibition of CDC25 activity, and cells pretreated with NAC showed no accumulation of pCDK after SV37 treatment. This strongly suggests a direct link between ROS generation by the compound SV37 and the accumulation of pCDK. This project increased knowledge on inhibitors of CDC25 phosphatases and allowed the identification of coumarine compound as new CDC25 inhibitors. This work will enable the development of ever more efficient inhibitors, leading to efficient inhibition of CDC25 and inhibition of tumor development

Το μονοπάτι του Transforming- Growth Factor beta είναι ένα από τα πιο πολύπλοκα και πιο καλά μελετημένα σε μια σειρά παθήσεων και έχει βρεθεί να δρα άλλοτε ως ογκοκατασταλτικό και άλλοτε ως προαγωγό της κακοήθους εξαλλαγής. Πρόσφατα έγινε η ανακάλυψη των υποστρωμάτων του, της οικογένειας των Smad πρωτεϊνών, που μεταφέρουν το σήμα στον πυρήνα του κυττάρου, με τη συμμετοχή πολλαπλών παραγόντων, συν –ενεργοποιητών ή συν – καταστολέων. Η Ski πρωτεΐνη έχει ταυτοποιηθεί τελευταία ως ένας σημαντικός συν-καταστολέας του εν λόγω μονοπατιού. Επιπλέον, ο καρκίνος του μαστού είναι ένας από τους πιο συχνούς καρκίνους στις γυναίκες και η ανακάλυψη καινούριων μορίων στόχων μοριακής θεραπείας αποτελεί μια μεγάλη πρόκληση, ιδίως σε ασθενείς με νόσο αρχικού σταδίου. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η μελέτη της έκφρασης του υποδοχέα του TGF-β, των πρωτεϊνών Smad2/3, Smad4 και Ski σε καρκινώματα μαστού σταδίου Τ1 και Τ2 με απουσία λεμφαδενικών μεταστάσεων, και η συσχέτιση της έκφρασης τους με ποικίλες κλινικοεργαστηριακές παραμέτρους, κυριότερες των οποίων ήταν ο βαθμός κακοηθείας των όγκων, η έκφραση ορμονικών υποδοχέων, η εμφάνιση απομακρυσμένων μεταστάσεων καθώς και ο θάνατος των ασθενών. Υλικά και μέθοδος: Σε 146 δείγματα από πορογενή καρκινώματα μαστού (εκ των οποίων 21 in situ και 125 διηθητικά) μελετήθηκε με τη μέθοδο της ανοσοϊστοχημείας (έμμεση μέθοδος βιοτίνης- στρεπταβιδίνης) η έκφραση των προαναφερθέντων μορίων. Η εκτίμηση της ανοσοθετικότητας ήταν τόσο ποιοτική (θετικη – αρνητική), όσο και ποσοτική (αρνητική, μέτρια, έντονη) ανάλογα με το ποσοστό των θετικών νεοπλασματικών κυττάρων και την ένταση της χρώσης. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων έγινε με το στατιστικό πρόγραμμα SPSS 13 for windows. Αποτελέματα: Η έκφραση του υποδοχέα του TGF-β είχε στατιστικώς σημαντική, αντίστροφη συσχέτιση με το βαθμό κακοηθείας των όγκων, καθώς και με την εμφάνιση αιματογενών μεταστάσεων και θανάτου των ασθενών. Η έκφραση της Smad2/3 πρωτεΐνης αποδείχτηκε ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας στα Grade I διηθητικά καρκινώματα και η Smad4 βρέθηκε να αποτελεί ισχυρό προγνωστικό παράγοντα στους ER (Estrogen Receptor) θετικούς όγκους. Η έκφραση της Smad2/3 και της Smad4 συσχετίστηκαν σημαντικά τόσο μεταξύ τους όσο και με την έκαραση του TGF-β υποδοχέα. Η έκφραση της πρωτεΐνης Ski συσχετίστηκε με το βαθμό κακοηθείας των όγκων, την παρουσία αιματογενών μεταστάσεων και αποδείχτηκε ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας για την επιβίωση των ασθενών. Επίσης σημαντική ήταν η παρατήρηση της ενδοκυττάριας μετακίνησης της Ski από τον πυρήνα προς το κυτταρόπλασμα του κυττάρου, αυξανομένου του βαθμού κακοηθείας των όγκων και η στατιστικώς σημαντική συσχέτιση της παρουσίας κυτταροπλασματικής Ski ανοσοχρώσης και απώλειας έκφρασης της πρωτεΐνης Smad2/3. Συμπεράσματα: Οι Smad πρωτεΐνες αποδεικνύεται για άλλη μια φορά να αποτελούν τα ενδοκυττάρια υποστρώματα του TGF-β και φαίνεται να διαδραματίζουν ρόλο ογκοκατασταλτικών πρωτεϊνών στην εξέλιξη της νεοπλασίας του μαζικού αδένα, ενώ η Ski πρωτεϊνη δρα ως ένα ισχυρό ογκογονίδιο καταστέλλοντας τη δράση του TGF-beta μονοπατιού. Όλες οι μελετηθείσες πρωτεΐνες αποτελούν δυνητικά ενδιαφέροντες στόχους μελλοντικής μοριακής θεραπείας. / Transgorming Growth Factor beta signaling pathway is thoroughly studied in a series of diseases and this molecule has been proved to act either as an ancogene or as a tumor suppressor molecule in human carcinogenesis. Recently, the Smad proteins’ family has been identified as TGF-b’s intracellular substrates, which transfer the signal in the cell’s nucleus. A lot of molecules have also been found to act as co-repressors or co-activators in this procedure. Ski protein is one of the most well known Smad proteins’ co-repressors. On the other hand, breast cancer is one of the most common cancers in women, and the fi of new predictive factors, especially in the early stages of the disease is very alluring. The purpose of the present study was the investigation of the expression of TGF-β receptor, as well as the expression of Smad2/3 and Ski protein in T1, T2, -node negative breast cancer specimens and theirs potent correlation with several clinicopathological parameters The most important of these were tumor Grade, hormone receptors’ positivity as well as the patients’ outcome (blood – borne metastases or death of their disease). Materials and methods: 146 breast cancer specimens were used, among which 21 in situ and 125 invasive. The proteins’ expression was studied using immunohistochemistry (biotin – streptabidin indirect method). The evaluation of the immunopositivity was not only qualitative (negative versus positive) but also quantitative (negative, weakly positive and strongly positive) depending on the number of positive tumor cells and the staining’s intensity). The statistical analysis of the results was implemented using the SPSS13 for windows. Results: TGF-β receptor’s expression was inversely correlated with tumor Grade as well as with the presence of blood- borne metastases and patients’ death. The expression of Smad2/3 protein was proved to be an independent prognostic factor in Grade I invasive carcinomas while loss of Smad4 expression was strongly correlated with poor patients’ outcome in ER (Estrogen Receptor) –positive tumors. All three proteins’ positivity had statistically significant correlation with each other. Ski proteins’ expression was strongly correlated with tumors’ Grade, the presence of distant metastases and was also an independent prognostic factor for patients’ survival. An other important observation was the intracellular metatopisi of Ski’ s expression from the nucleus to the cytoplasm in high Grade tumors and the strong relationship between cytoplasmic Ski and loss of expression of Smad2/3. Conclusions: Smad proteins seem to be TGF-beta intracellular substrates and, according to our results, play a tumor suppressor role in mammary gland tumorigenesis. On the other hand, Ski protein acts as an oncogene in breast carcinogenesis procedure modulating the TGF-beta pathways’ effect. All the studied proteins are potent targets of a future molecular therapy.