Summary : Macropinocytosis refers to the formation of large primary endocytic vesicles of irregular size and shape, generated by actin-driven evaginations of the plasma membrane, whereby cells avidly incorporate extracellular solutes. Macropinosomes resemble "empty" phagosomes and show no difference with the "spacious phagosomes" triggered by the enteropathogenic bacteria Salmonella and Shigella. Macropinosomes are formed at the leading edge and appear tightly regulated. They may fuse with lysosomes or regurgitate their content back to the extracellular space. Transformation of fibroblasts by Src or Ras results into the constitutive formation of macropinosomes at "ruffling" zones. My thesis adresses the dynamic of the constitutive macropinocytosis and its potential regulators. The first part of the thesis deals with the fate of macropinosomes. We found that, in v-Src transformed fibroblasts, macropinosomes do not fuse with transferrin-containing endosomes and investigated the effects of cyclic AMP as a regulator of macropinocytosis in this cell system. The permeant analogs dibutyryl cyclic AMP and 8-bromo-cyclic AMP, as well as the pharmacological activator of adenylate cyclase, forskolin, similarly decreased by about 35% the net endocytic accumulation of the fluid-phase tracer, horseradish peroxidase, in v-Src-transformed cells but not in the non-transformed parental Rat-1 cell line. However, and in contrast to the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) inhibitors and phosphatidylinositol-specific phospholipase C (PI-PLC), dibutyryl cyclic AMP neither returned the peroxidase accumulation rate of v-Src-transformed cells to that of parental Rat-1/control cells, nor prevented macropinosome formation, as shown by confocal microscopy. Detailed analysis of the kinetics of peroxidase entry and efflux in transformed cells revealed that dibutyryl cyclic AMP inhibited its accumulation only after intervals >5 minutes, due to accelerated regurgitation, but did not alter the rate of transferrin recycling. Taken together, these data indicate that, in v-Src-transformed fibroblasts, macropinocytosis and micropinocytosis serve different pathways and that cyclic AMP affects neither micropinocytosis nor the formation of macropinosomes, but selectively promotes regurgitation therefrom. The second part of my thesis deals with the regulation of macropinocytosis. Both transformation of Rat-1 fibroblasts by v-Src or K-Ras and stable transfection with an expression vector for wild-type PI3K regulatory subunit p85a, acting as dominant-positive PI3K, constitutively lead to stress fibers disruption, cortical actin recruitment, extensive ruffling and macropinosome formation, as measured by a selective acceleration of fluid-phase endocytosis. These alterations closely correlated with activation of PI3K and PI-PLC, as assayed by 3-phosphoinositides synthesis in situ and in vitro and IP3 steady state levels, respectively, and were abolished by stable transfection of Src-transformed cells with an expression vector for truncated p85a, acting as dominant-negative PI3K, as well as by pharmacological inhibitors of PI3K and PI-PLC, indicating requirement for both enzymes. These inhibitors strongly decreased the population of cells showing active membrane ruffling and did not detectably affect receptor-mediated endocytosis of transferrin. Interestingly, the effect of Src and dominant-positive p85a transfection on the actin cytoskeleton could be reversed within 30-60 min by the pharmacological inhibitor of PI3K, wortmannin. Whereas PI3K activation resisted PI-PLC inhibition by NCDC, PI-PLC activation was abolished by the PI3K inhibitor wortmannin and upon dominant-negative PI3K transfection, thus placing PI-PLC downstream of PI3K. Taken together, these data suggest that permanent sequential activation of both PI3K and PI-PLC is necessary for the dramatic reorganization of actin cytoskeleton in oncogene-transformed fibroblasts resulting into constitutive ruffling and macropinocytosis.Résumé : La macropinocytose désigne la formation de grandes vésicules endocytaires primaires de taille et de forme irrégulière, produites par évagination de la membrane péricellulaire, qui permet l'accumulation accélérée de solutés extracellulaires. Il existe une forte similitude entre les macropinosomes et les "phagosomes spacieux" induits par des bactéries entéropathogènes telles que Salmonella et Shigella. Les macropinosomes de forment préférentiellement au front de migration et peuvent fusionner avec les lysosomes ou recycler leur contenu vers le milieu extracellulaire (régurgitation). La transformation de fibroblastes Rat-1 par les oncogènes v-Src ou K-Ras induit la formation constitutive de macropinosomes au niveau des zones du "ruffling". Notre travail s'est intéressé à la dynamique de cette macropinocytose constitutive et à ses régulateurs potentiels. La première partie de ma thèse concerne le sort des macropinosomes dans les fibroblastes transformés par v-Src. Ceux-ci ne fusionnent pas avec les endosomes contenant la transferrine. Pour tester l'effet de l'AMP-cyclique sur cette macropinocytose, nous avons utilisé deux analogues perméants de l'AMPc, le dibutyryl AMP-cylique et le 8-bromo-AMP-cyclique, ainsi qu'un activateur de l'adénylate cyclase, la forskoline. Ces trois agents ralentissent d'environ 35% la vitesse de l'accumulation nette d'un traceur de l'endocytose fluide, la peroxydase de raifort, dans les cellules transformées par v-Src, mais n'ont pas d'effet dans la lignée parentale. Cependant, au contraire d'inhibiteurs de la phospho-inositide 3-kinase (PI3K) ou d'inhibiteurs de la phospholipase C spécifique du phosphatidylinositol (PI-PLC), le dibutyryl AMP-cyclique ne ramène pas le taux d'accumulation de la peroxydase des fibroblastes transformés par v-Src au niveau des fibroblastes parentaux et n'empêche pas la formation de macropinosomes, visualisée en microscopie confocale. L'analyse détaillée de la cinétique d'accumulation de la peroxydase dans les cellules transformées a révélé que le dibutyryl AMP-cyclique ralentit l'accumulation de la peroxydase seulement après un temps supérieur à 5 minutes, en accélérant sa régurgitation, sans affecter le recyclage de la transferrine. Ces résultats montrent clairement que, dans les fibroblastes transformés par v-Src, la macropinocytose et la micropinocytose sont deux voies distinctes et que l'AMP-cyclique n'affecte ni la micropinocytose, ni la formation de macropinosomes, mais active sélectivement la régurgitation à partir de ceux-ci. La seconde partie de ma thèse s'intéresse à la régulation de la formation des macropinosomes. La transformation des fibroblastes Rat-1 par les oncogènes v-Src ou K-Ras ainsi que la transfection stable par un vecteur d'expression de la sous-unité régulatrice sauvage p85a, créant un ²dominant-positif² de la PI3K, provoquent la destruction des câbles de tension, le recrutement de l'actine corticale et la formation du ²ruffling² qui génère les macropinosomes, ce qui est reflété par l'accélération sélective de l'endocytose en phase fluide. Ces altérations corrèlent étroitement avec l'activation de la PI3K et de la PI-PLC, mesurées par la production des phospho-inositides D3 in situ et in vitro et par le niveau de l'IP3 respectivement, et sont abolies après transfection stable par un vecteur d'expression pour la sous-unité p85a tronquée, agissant comme ²dominant-négatif² de la PI3K, ou après traitement des cellules avec les inhibiteurs pharmacologiques de la PI3K et de la PI-PLC. Ceci démontre que ces deux enzymes sont nécessaires dans la signalisation de la macropinocytose constitutive. Ces inhibiteurs diminuent fortement le pourcentage des cellules montrant un ²ruffling² membranaire mais n'affectent pas l'endocytose de la transferrine. La réorganisation du cytosquelette d'actine dans les cellules transformées par v-Src ou dans le ²dominant-positif² de la PI3K est reversée après 30 à 60 minutes de traitement par un inhibiteur de la PI3K, la wortmannine. L'activité de la PI3K n'est pas modifiée par le traitement des cellules avec un inhibiteur de la PI-PLC. En revanche, l'activité de cette dernière est abolie par les inhibiteurs de la PI3K et chez le ²dominant-négatif² de la PI3K. Ceci permet de placer la PI-PLC en aval de PI3K dans la même voie de signalisation de la macropinocytose. En conclusion, une activation permanente et séquentielle de la PI3K et de la PI-PLC est nécessaire au remodelage du cytosquelette d'actine qui produit le ²ruffling² membranaire et la macropinocytose constitutive dans les fibroblastes transformés.

Summary : Macropinocytosis refers to the formation of large primary endocytic vesicles of irregular size and shape, generated by actin-driven evaginations of the plasma membrane, whereby cells avidly incorporate extracellular solutes. Macropinosomes resemble "empty" phagosomes and show no difference with the "spacious phagosomes" triggered by the enteropathogenic bacteria Salmonella and Shigella. Macropinosomes are formed at the leading edge and appear tightly regulated. They may fuse with lysosomes or regurgitate their content back to the extracellular space. Transformation of fibroblasts by Src or Ras results into the constitutive formation of macropinosomes at "ruffling" zones. My thesis adresses the dynamic of the constitutive macropinocytosis and its potential regulators. The first part of the thesis deals with the fate of macropinosomes. We found that, in v-Src transformed fibroblasts, macropinosomes do not fuse with transferrin-containing endosomes and investigated the effects of cyclic AMP as a regulator of macropinocytosis in this cell system. The permeant analogs dibutyryl cyclic AMP and 8-bromo-cyclic AMP, as well as the pharmacological activator of adenylate cyclase, forskolin, similarly decreased by about 35% the net endocytic accumulation of the fluid-phase tracer, horseradish peroxidase, in v-Src-transformed cells but not in the non-transformed parental Rat-1 cell line. However, and in contrast to the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) inhibitors and phosphatidylinositol-specific phospholipase C (PI-PLC), dibutyryl cyclic AMP neither returned the peroxidase accumulation rate of v-Src-transformed cells to that of parental Rat-1/control cells, nor prevented macropinosome formation, as shown by confocal microscopy. Detailed analysis of the kinetics of peroxidase entry and efflux in transformed cells revealed that dibutyryl cyclic AMP inhibited its accumulation only after intervals >5 minutes, due to accelerated regurgitation, but did not alter the rate of transferrin recycling. Taken together, these data indicate that, in v-Src-transformed fibroblasts, macropinocytosis and micropinocytosis serve different pathways and that cyclic AMP affects neither micropinocytosis nor the formation of macropinosomes, but selectively promotes regurgitation therefrom. The second part of my thesis deals with the regulation of macropinocytosis. Both transformation of Rat-1 fibroblasts by v-Src or K-Ras and stable transfection with an expression vector for wild-type PI3K regulatory subunit p85a, acting as dominant-positive PI3K, constitutively lead to stress fibers disruption, cortical actin recruitment, extensive ruffling and macropinosome formation, as measured by a selective acceleration of fluid-phase endocytosis. These alterations closely correlated with activation of PI3K and PI-PLC, as assayed by 3-phosphoinositides synthesis in situ and in vitro and IP3 steady state levels, respectively, and were abolished by stable transfection of Src-transformed cells with an expression vector for truncated p85a, acting as dominant-negative PI3K, as well as by pharmacological inhibitors of PI3K and PI-PLC, indicating requirement for both enzymes. These inhibitors strongly decreased the population of cells showing active membrane ruffling and did not detectably affect receptor-mediated endocytosis of transferrin. Interestingly, the effect of Src and dominant-positive p85a transfection on the actin cytoskeleton could be reversed within 30-60 min by the pharmacological inhibitor of PI3K, wortmannin. Whereas PI3K activation resisted PI-PLC inhibition by NCDC, PI-PLC activation was abolished by the PI3K inhibitor wortmannin and upon dominant-negative PI3K transfection, thus placing PI-PLC downstream of PI3K. Taken together, these data suggest that permanent sequential activation of both PI3K and PI-PLC is necessary for the dramatic reorganization of actin cytoskeleton in oncogene-transformed fibroblasts resulting into constitutive ruffling and macropinocytosis.Résumé : La macropinocytose désigne la formation de grandes vésicules endocytaires primaires de taille et de forme irrégulière, produites par évagination de la membrane péricellulaire, qui permet l'accumulation accélérée de solutés extracellulaires. Il existe une forte similitude entre les macropinosomes et les "phagosomes spacieux" induits par des bactéries entéropathogènes telles que Salmonella et Shigella. Les macropinosomes de forment préférentiellement au front de migration et peuvent fusionner avec les lysosomes ou recycler leur contenu vers le milieu extracellulaire (régurgitation). La transformation de fibroblastes Rat-1 par les oncogènes v-Src ou K-Ras induit la formation constitutive de macropinosomes au niveau des zones du "ruffling". Notre travail s'est intéressé à la dynamique de cette macropinocytose constitutive et à ses régulateurs potentiels. La première partie de ma thèse concerne le sort des macropinosomes dans les fibroblastes transformés par v-Src. Ceux-ci ne fusionnent pas avec les endosomes contenant la transferrine. Pour tester l'effet de l'AMP-cyclique sur cette macropinocytose, nous avons utilisé deux analogues perméants de l'AMPc, le dibutyryl AMP-cylique et le 8-bromo-AMP-cyclique, ainsi qu'un activateur de l'adénylate cyclase, la forskoline. Ces trois agents ralentissent d'environ 35% la vitesse de l'accumulation nette d'un traceur de l'endocytose fluide, la peroxydase de raifort, dans les cellules transformées par v-Src, mais n'ont pas d'effet dans la lignée parentale. Cependant, au contraire d'inhibiteurs de la phospho-inositide 3-kinase (PI3K) ou d'inhibiteurs de la phospholipase C spécifique du phosphatidylinositol (PI-PLC), le dibutyryl AMP-cyclique ne ramène pas le taux d'accumulation de la peroxydase des fibroblastes transformés par v-Src au niveau des fibroblastes parentaux et n'empêche pas la formation de macropinosomes, visualisée en microscopie confocale. L'analyse détaillée de la cinétique d'accumulation de la peroxydase dans les cellules transformées a révélé que le dibutyryl AMP-cyclique ralentit l'accumulation de la peroxydase seulement après un temps supérieur à 5 minutes, en accélérant sa régurgitation, sans affecter le recyclage de la transferrine. Ces résultats montrent clairement que, dans les fibroblastes transformés par v-Src, la macropinocytose et la micropinocytose sont deux voies distinctes et que l'AMP-cyclique n'affecte ni la micropinocytose, ni la formation de macropinosomes, mais active sélectivement la régurgitation à partir de ceux-ci. La seconde partie de ma thèse s'intéresse à la régulation de la formation des macropinosomes. La transformation des fibroblastes Rat-1 par les oncogènes v-Src ou K-Ras ainsi que la transfection stable par un vecteur d'expression de la sous-unité régulatrice sauvage p85a, créant un ²dominant-positif² de la PI3K, provoquent la destruction des câbles de tension, le recrutement de l'actine corticale et la formation du ²ruffling² qui génère les macropinosomes, ce qui est reflété par l'accélération sélective de l'endocytose en phase fluide. Ces altérations corrèlent étroitement avec l'activation de la PI3K et de la PI-PLC, mesurées par la production des phospho-inositides D3 in situ et in vitro et par le niveau de l'IP3 respectivement, et sont abolies après transfection stable par un vecteur d'expression pour la sous-unité p85a tronquée, agissant comme ²dominant-négatif² de la PI3K, ou après traitement des cellules avec les inhibiteurs pharmacologiques de la PI3K et de la PI-PLC. Ceci démontre que ces deux enzymes sont nécessaires dans la signalisation de la macropinocytose constitutive. Ces inhibiteurs diminuent fortement le pourcentage des cellules montrant un ²ruffling² membranaire mais n'affectent pas l'endocytose de la transferrine. La réorganisation du cytosquelette d'actine dans les cellules transformées par v-Src ou dans le ²dominant-positif² de la PI3K est reversée après 30 à 60 minutes de traitement par un inhibiteur de la PI3K, la wortmannine. L'activité de la PI3K n'est pas modifiée par le traitement des cellules avec un inhibiteur de la PI-PLC. En revanche, l'activité de cette dernière est abolie par les inhibiteurs de la PI3K et chez le ²dominant-négatif² de la PI3K. Ceci permet de placer la PI-PLC en aval de PI3K dans la même voie de signalisation de la macropinocytose. En conclusion, une activation permanente et séquentielle de la PI3K et de la PI-PLC est nécessaire au remodelage du cytosquelette d'actine qui produit le ²ruffling² membranaire et la macropinocytose constitutive dans les fibroblastes transformés.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les plantes n'échappent pas à leur lieu de vie, elles doivent en permanence adapter leurs processus physiologiques pour répondre aux variations de leurs conditions environnementales. Durant ma thèse, j'ai étudié deux stress affectant le développement des plantes, les stress thermique (HS) et oxydant (OS), en ciblant des éléments clé de ces phénomènes (les protéines de choc thermique Hsp et Thiorédoxines TRX) afin d'apporter des éléments de réponse quant à l'interconnexion de ces stress et leur importance pour la plante.En utilisant le riz et le soja comme modèles, je montre que le HS suit une « signature Ca2+ » en provoquant une entrée de calcium de l'apoplaste vers le cytosol, assurant ainsi une rigidité à la paroi cellulaire et une cascade de signaux. J'identifie aussi une Pectine Methylesterase nécessaire au remodelage de la paroi cellulaire et à l'intégrité de la membrane. J'ai aussi recherché comment la plante perçoit les changements de température et transmet ce signal vers des effecteurs. Par des analyses d'expression de gènes, je montre qu'une CaM bien spécifique coordonne la réponse au HS, qui se traduit par l'expression spécifique de certaines petites Hsp nucléaires et cytosoliques.Je réalise enfin une étude moléculaire de TDX, une TRX suspectée d'agir dans la réponse au HS. Je montre que TDX interagit avec des Hsp70 de type cytosoliques/nucléaires de façon redox dépendante, que les stress HS et OS induisent une relocalisation nucléaire de TDX. Je montre enfin que TDX est essentielle pour la thermotolérance acquise et la transduction du signal oxydant. Ces résultats sont discutés et des modèles de transduction des signaux entre HS et OS sont proposés. / While being unable to escape their lands, plants are continuously submitted to the modifications of their environment, and need to adjust proper physiological processes in response to various stimuli. During this work, I devoted my studies on two major stresses affecting plant development, heat shock (HS) and oxidative stresses (OS), focusing on key elements in these pathways (HS chaperons and HS-related thioredoxins) in order to bring news elements of knowledge and interconnexion of these pathways.Using rice and soybean as mono- and dicotyledonous plant systems, I show how HS leads to calcium release from plant cell apoplast to the cytosol in a typical calcium signature, conferring cell wall rigidity and enhancing HS signaling pathway. I also identify Pectin Methylesterase as required in this pathway for cell wall remodeling and plasma membrane integrity. I further investigate how plant sense temperature increases and how they transmit the HS signal to downstream elements. Using systematic analyses of Calmodulin (CaM) and small heat shock protein (sHsp) gene expression, I identify one CaM as a coordinator of HS response, which I characterize as involving specific cytosolic/nuclear isoforms of the sHsp family.I latter perform the molecular analysis of TDX, a Thioredoxin suspected to be involved in heat shock response. I show that TDX interacts with cytosolic/nuclear members of the Hsp70 family in a redox dependent manner, both HS and OS inducing its nuclear relocation, and that TDX is required for both acquired thermotolerance and OS signaling.I finally discuss the data brought by this work and propose models with cross-talks between HS and oxidative stress signaling.

Le bon fonctionnement de notre organisme repose sur de nombreux réseaux de communication intercellulaires (neurotransmetteurs, hormones, facteurs de croissance, lymphokines, molécules d'adhésion, etc.) prolongés par les voies de signalisation intracellulaires. Les signaux moléculaires sont des ligands reconnus par des récepteurs exprimés à la surface des cellules cibles. La fixation du ligand à son récepteur déclenche des voies de signalisation intracellulaires qui commandent la réponse fonctionnelle. Mes travaux scientifiques m'ont conduit à étudier diverses voies de signalisation intracellulaires qui seront évoquées dans cette HDR avec une emphase particulière sur les études les plus récentes.<br />Les cellules de la réponse immune cellulaire, les lymphocytes T, reconnaissent leur antigène spécifique à l'aide d'un récepteur multi-protéique, le complexe TCR/CD3. Le contrôle de son expression de surface est essentiel car le nombre de récepteurs stimulés par l'antigène et la durée de cette interaction déterminent la réponse fonctionnelle. Au cours de ma thèse au Centre d'Immunologie de Marseille-Luminy, j'ai participé à l'étude des mécanismes qui contrôlent l'expression de surface du récepteur et son internalisation suite à l'interaction avec l'antigène. Ces travaux ont permis 1) de corroborer que l'expression de surface du complexe TCR/CD3 est dépendante de l'assemblage complet de toutes les sous-unités qui le composent, 2) et surtout d'aborder le lien entre voies de signalisation associées au complexe TCR/CD3 et son internalisation stimulées par la liaison d'un ligand spécifique.<br />Le récepteur aux poly-immunoglobulines (pIgR) exprimé à la surface des cellules épithéliales qui tapissent la cavité interne de nos organes transcytose les anticorps sécrétés dans le milieu basal vers le lumen. Ainsi, ce récepteur approvisionne-t-il continuellement les sécrétions mucosales en anticorps (pIgA et pIgM). La forte augmentation de la quantité d'anticorps produits en réponse à une infection nécessite un transport accru de ces anticorps vers les surfaces mucosales à protéger. Pendant mon stage post-doctoral à UCSF (University of California, San Francisco) j'ai contribué 1) à montrer que la liaison des pIgA au pIgR stimulait une voie de signalisation, 2) à décrire au niveau moléculaire le fonctionnement de cette voie de signalisation, 3) à montrer in vivo que cette voie de signalisation stimule fortement la transcytose des pIgAs.<br />Les épithéliums représentent une barrière à la pénétration d'agents pathogènes mais également une surface d'échange avec le milieu extérieur. Pour accomplir leurs fonctions les cellules épithéliales maintiennent un phénotype polarisé avec un coté orienté vers les tissus sous-jacents (pôle basal) et un autre tourné vers le milieu extérieur (pôle apical). Ces cellules doivent établir entre elles des contacts physiques pour maintenir la cohésion de l'ensemble du tissu qu'elles constituent. Les contacts cellulaires sont assurés par des molécules d'adhésion (E-cadhérine) qui se comportent comme des récepteurs couplés à des voies de signalisation transduisant notamment des signaux qui participent au maintien de la polarité épithéliale. Depuis mon arrivée à l'IPMC (Institut de Pharmacologie Moléculaire et Cellulaire), j'ai mis au jour une nouvelle voie de signalisation associée aux molécules de E-cadhérine qui comprend un facteur d'échange (EFA6) et son substrat la petite protéine G Arf6. Cette voie de régulation contrôle notamment la mise en place de la structure moléculaire, appelée jonction étroite, qui régule les échanges paracellulaires de l'épithélium et contribue à la polarité épithéliale. EFA6, connecté à deux voies de signalisation qui agissent de façon coordonnée, participe à l'organisation du cytosquelette d'actine qui soutient la jonction étroite. Par ailleurs, nous avons trouvé que le niveau d'expression d'EFA6 est étroitement régulé pendant le développement de la polarité. Cette régulation post-traductionnelle est assurée par la machinerie de dégradation cytosolique appelée système ubiquitine-protéasome. Nous avons identifié certains acteurs de cette voie de régulation et commencé de montrer son importance pour le développement et le maintien de la polarité épithéliale. Les résultats les plus récents pointent vers un rôle de ces protéines dans les cancers épithéliaux qui se caractérisent toujours par une perte de la polarité cellulaire.