Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les perturbations environnementales peuvent induire des changements au niveau génétique, biochimique et physiologique chez les organismes exposés. Pour faire face à ces perturbations, les bivalves possèdent des défenses antioxydantes telles que la métallothionéine (MT), la superoxide dismutase (SOD), la catalase (CAT), la glutathion peroxidase sélénium dépendante (Se-GPx) et la glutathion S-transférase de classe pi (pi-GST). L'objectif de ce travail est de contribuer à la compréhension des mécanismes de détoxication chez les bivalves d'eau douce Unio tumidus et Corbicula fluminea. Les mollusques bivalves sont largement utilisés comme espèce sentinelle pour étudier la qualité de l'écosystème aquatique. Ce sont des organismes sédentaires, filtreurs, pouvant bioaccumuler une grande quantité de micropolluants environnementaux et qui peuvent être facilement transférés dans des milieux contaminés. La séquence codante de MT de Corbicula fluminea, ainsi que les séquences codantes de MT, SOD et CAT d'Unio tumidus ont été identifiées par RT-PCR en utilisant des amorces dégénérées. L'expression de ces gènes, ainsi que ceux de la Se-GPx et de la GST-pi, a ensuite été étudiée au niveau des ARNm dans différents cas d'études : (i) chez des bivalves prélevés sur une période d'un an dans le but d'identifier une éventuelle variation de l'expression en fonction de la saison, (ii) chez Corbicula fluminea exposée au cuivre et au cadmium, (iii) et chez Unio tumidus transférée au niveau de stations situées le long de la Moselle. Nous avons mis en évidence des variations du niveau d'expression des gènes dues à des paramètres saisonniers tels que la température de l'eau et le cycle de reproduction, principalement chez Unio tumidus. Nos résultats ont montré que les niveaux d'expression des ARNm de MT, SOD, CAT, Se-GPx et GST-pi peuvent être utilisés en tant que biomarqueurs précoces d'exposition au cuivre et au cadmium chez Corbicula fluminea. Des variations d'expression de tous les gènes étudiés ont également été observées chez Unio tumidus, mettant en évidence une anthropisation du milieu aquatique, non détectée par les analyses physicochimiques. Les approches biologiques apparaissent donc comme des outils indispensables à la détection de perturbations environnementales. / Environmental perturbations can induce genetic, biochemical and physiological changes in exposed organisms. To protect from oxidative stress, bivalves possess defences such as metallothionein (MT), superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), selenium-dependent glutathione peroxidase (Se-GPx) and pi class glutathione S-transferase (pi-GST). The aim of this study is to contribute to the understanding of the detoxification mechanisms in the freshwater bivalves Unio tumidus and Corbicula fluminea. Bivalve molluscs are appropriate sentinel species to study the quality of the aquatic environment. They are sedentary, filter-feeding species, bioaccumulating high amounts of environmental micropollutants and can easily be transferred to contaminated areas. The MT coding sequence of Corbicula fluminea and the MT, SOD and CAT coding sequences of Unio tumidus were identified by RT-PCR using degenerated primers. Then, the mRNA expression level of MT, SOD, CAT, Se-GPx and pi-GST was measured in different studies: (i) in bivalves sampled during a 1-year period in order to identify possible seasonal variations of the expression pattern, (ii) in Corbicula fluminea exposed to copper and cadmium, (iii) and in Unio tumidus transplanted in stations located along the Moselle River. Fluctuations of the mRNA level, supposed to correspond to seasonal parameter such as water temperature and reproductive statute, were noted, principally in Unio tumidus. Our results pointed out that MT, SOD, CAT, Se-GPx and GST-pi mRNA expression level could be used as early exposure biomarkers of copper and cadmium exposure in Corbicula fluminea. Variations of gene expression were observed in Unio tumidus, highlighting anthropic impacts on aquatic ecosystem no detected by chemical analysis. Biological approaches appear as essential tools to detect environmental degradations

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

The RNA cap structure is a fundamental feature of most known eukaryotic mRNAs and some viral RNAs, It is important for the stability, transport and translation of mRNAs. It is co-transcriptionally synthesized via the action of 3 consecutive enzymatic reactions: (1) A RNA triphosphatase which cleaves off the 5' terminal phosphate of nascent RNAs; (2) A RNA guanylyltransferase which transfers a GMP moiety onto the acceptor RNA; (3) A RNA (guanine-N7) methyltransferase which methylates the cap guanine at the N7 position. Through the end of the 1990's until now, the crystal structures of several capping enzymes have been solved. However, these structures, although very insightful in themselves, failed to provide any instructive information on several key issues regarding enzyme-substrate interactions. For instance, one of the first breakthrough crystallographic studies in RNA capping chemistry led to the elucidation of the yeast RNA triphosphatase structure (the Cet1 protein). However, in the crystal structure, the Cet1 protein was bound to a sulphate molecule, which was hypothesised to be mimicking the product of the RNA triphosphatase reaction- a phosphate molecule.The inability to capture the RNA triphosphatase in complex with its ligands is probably on account of the inherent thermodynamic instability of this protein when bound to RNA or a nucleotide. A structural definition of the active site of the yeast RNA triphosphatase in complex with an appropriate substrate is still lacking. In addition, the elucidation of the structure of the RNA guanylyltransferase of the Paramecium bursaria chlorella virus -1 (PBCV-1) in several different conformations has been a landmark study which greatly contributed towards the understanding of the catalytic pathway of this model enzyme. On the other hand, despite the presence of the natural substrate-GTP, within the active site of the enzyme, the rationale behind the GTP specificity of RNA guanylyltransferase remains poorly understood. Moreover, a molecular mechanism for the RNA guanylyltransferase reaction is still missing. Finally, the importance of the RNA cap for the process of eukaryotic translation is undisputable. However, the relationship between the RNA cap and translation has been mostly studied indirectly through proteins which bind to the cap structure. Most studies pertaining directly to the impact of the binding of the RNA cap structure have been restricted to investigating the inhibitory potential of various cap analogues on the translation process. Studies on the effects of modified RNA caps at the 5' ends of RNAs have only started in the last few years, and more importantly, the necessity of the N7-methyl group on RNA cap analogues had not been addressed. This thesis therefore aims to provide a structural insight into the structural dynamics of enzyme-ligand(s) interactions of the model S. cerevisiae's RNA triphosphatase and the PBCV-1 RNA guanylyltransferase. In addition, we show that purine analogues can be a useful tool for the study of several cellular processes, such as RNA translation. In the process we have uncovered a novel class of RNA capping enzyme in the flavivirus genus of the Flaviviridae family of RNA viruses, thus providing a more succinct insight into the flaviviral replication complex.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La biogénèse des mitochondries est un processus qui implique l’importation de plus de 98% des protéines constitutives de ces organites. Les signaux protéiques impliqués dans l’importation de ces protéines dans les mitochondries sont relativement bien caractérisés. Il y a une dizaine d’année, il a été montré chez la levure et les mammifères que d’autres signaux, présents au niveau des ARNm étaient également impliqués dans l’adressage et l’importation des protéines dans les mitochondries. Ce processus d’adressage d’ARNm à la surface des mitochondries s’est montré fondamental pour la biogénèse et la fonction des mitochondries chez la levure. Au cours de cette thèse, nous avons démontré que des ARNm étaient adressés à la surface des mitochondries chez trois espèces végétales. Par la combinaison d’approches in vitro et in vivo, nous avons également identifié des éléments cis permettant l’adressage d’ARNm à la surface des mitochondries à partir d’un messager candidat : AtVDAC3. Ces éléments cis sont localisés dans une séquence de 142 nt présente dans la région 3’UTR du messager AtVDAC3. Le rôle de ce processus chez les plantes est actuellement en cours d’étude. / Mitochondria biogenesis requires the import of more than 98 % of their constitutive proteins. Proteic signals involved in mitochondrial protein import are well known today. Ten years ago, it was shown in yeast and mammals that targeting signals are also present at the level of mRNAs. Cytosolic mRNA targeting to mitochondria is an extended process concerning half of the mRNAs encoded mitochondrial proteins in yeast. Furthermore, this process is fundamental for yeast mitochondria biogenesis and functions. During this PhD, we showed that some mRNAs are also targeting to mitochondria in three different plant species. These results highlighted the conservation of this process during evolution. By using in vivo and in vitro experimental strategies, we also identified a mitochondrial cis-targeting element in one candidate mRNA: AtVDAC3. This cis-element is 142 nt long and is located in the 3’UTR of the AtVDAC3 mRNA. We are now investigating the roles of this process in mitochondria biogenesis and functions in plants.

Il est connu chez la levure Saccharomyces cerevisiae que la dégradation nucléaire est surtout impliquée dans les mécanismes de surveillance de la qualité des ARNs. Parmi les ribonucléases nucléaires, il existe l'endoribonucléase Rnt1p qui possède plusieurs fonctions notamment dans la maturation de l'ARN ribosomal. Cependant, sa délétion causait des défauts dans la progression du cycle cellulaire ainsi qu'une sensibilité à la température. Ces défauts ont été associés à deux gènes impliqués dans la régulation du cycle cellulaire HSL1 et SW14. L'analyse des niveaux d'ARNm de ces deux gènes a montré que ces derniers étaient surexprimés en absence de RNT1 et que l'ajout de Rnt1p recombinant à des extraits d'ARNm provenant d'une souche rntl [delta] provoquait une diminution de l'ARNm mature. Le rôle de Rnt1p dans la régulation de ces deux gènes a également été confirmé par des expériences analysant les niveaux des protéines encodées par ces gènes. La protéine Hsl1p étant impliquée dans le contrôle de la morphogénèse et donc du cycle cellulaire, et étant donné que la localisation de Rnt1p est également dépendante de celui ci, nous avons voulu examiner la possibilité que Rnt1p régule Hsl1p de façon dépendante du cycle cellulaire. Pour cela, nous avons examiné l'impact de la délétion de Rnt1p sur l'expression de Hsl1p dans les différentes phases du cycle cellulaire. Par ailleurs, puisque Hsl1p possède deux fonctions à la fois dans le contrôle de la morphogénèse mais aussi dans la réponse au stress des parois, nous avons décidé d'étudier sa distribution dans le cycle cellulaire mais aussi l'impact de la régulation posttranscriptonnelle sur l'expression et la localisation de son ARNm dans les différentes phases du cycle cellulaire. Pour cela, nous avons testé l'impact de trois délétions de ribonucléases nucléaires (Rnt1p et Rrp6p) et cytoplasmique (Xrnlp) afin de comprendre quel niveau de régulation était le plus important dans l'expression de l'ARNm Hsll. Nous avons utilisé pour cela une technique très sensible appelée FISH (fluorescent in situ hybridization) qui permet de détecter des ARNm individuels au sein de la cellule et d'en calculer le nombre dans chaque phase du cycle et dans chaque compartiment cellulaire (noyau et cytoplasme). Nos résultats ont montré que Rnt1p jouait un rôle très important dans l'expression et la localisation cycle cellulaire-dépendante de l'ARNm Hsll avec un impact marqué au niveau de la phase G2/M, alors que les autres délétions n'avaient pas d'effet sur l'expression cyclique de l'ARNm Hsl1.