L'herpèsvirus humain 8 (HHV-8) est un pathogène reconnu récemment dont l'infection est associée à des maladies telles que le sarcome de Kaposi, le lymphome primitif des séreuses, et la maladie de Castleman. Le génome de HHV-8 code pour de nombreuses protéines impliquées dans l'interférence avec les mécanismes de défense immunitaire de l'hôte. Nos travaux portent sur la caractérisation de la protéine K-bZIP de HHV-8. Cette protéine précoce-immédiate dans le cycle viral, est issue du gène ORFK8, et est principalement décrite comme un répresseur transcriptionnel. L'étude de son impact sur la voie de transcription de l'interféron α/β a permis d'identifier un mécanisme original par lequel K-bZIP inhibe l'activation de l'interféron (IFN). En se fixant directement aux éléments de liaison de IRF3 contenus dans le promoteur de l'IFN, K-bZIP active faiblement sa transcription. En revanche, lors d'une activation des kinases cellulaires impliquées dans la transcription de l'IFN, K-bZIP entraîne une forte inhibition de l'expression du gène de l' Ifn-β. De plus, nous avons pu déterminer que K -bZIP avait un rôle inhibiteur dans la cascade d'activation induite par la liaison de l'IFN de type 1 sur son récepteur. Cette inhibition est indépendante de la phosphorylation des STATs et de la formation du complexe ISGF3. Nous avons également identifié le fait que la sumoylation joue un rôle déterminant dans la répression liée à K-bZIP. Enfin, grâce à la génération d'un ARN interférant dirigé contre le transcrit de l'ORFK8, nous avons démontré que K-bZIP est requis pour la réplication du génome viral, pour la production de virions matures, et pour une transactivation optimale des messagers lytiques viraux. Globalement, ces travaux nous procurent une vision plus affinée du rôle de la protéine K-bZIP dans le contexte viral.

La structure coiffe est une structure protectrice retrouvée à l'extrémité 5' des ARN messagers (ARNm). Elle est requise pour la stabilité, le transport, l'épissage et la traduction des ARNm.La coiffe est synthétisée par trois activités enzymatiques successives : les activités ARN 5'-triphosphatase, ARN guanylyltransférase et ARN (guanine-7) méthyltransférase. Cette structure doit de plus être dégradée par des enzymes spécifiques pour permettre le recyclage des ARNm. Plusieurs protéines virales ont été découvertes possédant l'une ou l'autre de ces diverses activités de synthèse et de dégradation de la structure coiffe. Ces enzymes viraux représentent donc des modèles très intéressants pour étudier ces activités catalytiques, permettant soit de mieux comprendre les mécanismes similaires chez les métazoaires, ou de cibler ces activités chez les virus à l'aide de molécules inhibitrices. Cette thèse présente l'étude des plus petites ARN 5'-triphosphatases et ARN guanylyltransférase connues à ce jour, les protéines A449R et A103R du virus Paramecium bursaria chlorella de type 1, ainsi que du premier enzyme viral de dégradation de la structure coiffe découvert : la protéine D10 du virus de la vaccine. L'étude de l'ARN 5'-triphosphatase A449R a permis de déterminer l'implication des acides aminés Glu24, Glu26 et Glu165 dans l'interaction avec des ions divalents au centre catalytique de l'enzyme, ainsi que leur nature essentielle pour l'activité ARN 5'-triphosphatase. De plus, les résultats obtenus démontrent que l'interaction de l'enzyme avec les ions ne stabilise pas l'interaction de l'enzyme avec son substrat d'ARN, tel que précédemment observé avec l'ARN triphosphatase de la levure Saccharomyces cerevisiae. Chez A449R, la liaison des ions semble plutôt positionner les acides aminés du centre catalytique pour la catalyse. Ces données démontrent que des enzymes reliés au niveau phylogénique possèdent des mécanismes distincts pour une même activité essentielle de synthèse de la structure coiffe. Ces particularités pourraient être ciblées pour le développement d'antiviraux ou d'antifongiques spécifiques. Parallèlement, une caractérisation cinétique complète de toutes les étapes du mécanisme d'ARN guanylyltransférase de la protéine A103R a été entreprise.La production d'un schéma de l'énergie libre impliquée dans le déroulement de la réaction a permis de préciser l'étape limitante du mécanisme, ainsi que la nature spontanée de la réaction in vitro . Les ARN guanylyltransférases étant très conservées entre les métazoaires, levures et virus, cette caractérisation a permis d'acquérir quantité d'information sur ce mécanisme catalytique peu connu. Cette étude nous mène au questionnement des implications pour la cellule de la synthèse exclusive d'une coiffe guanosine par les ARN guanylyltransférases. Finalement, la caractérisation du mécanisme d'action de la protéine D10 ainsi que la modélisation du site actif de l'enzyme ont permis de générer le premier modèle mécanistique pour un enzyme viral de dégradation de la structure coiffe. Ce mécanisme est régi par la présence de deux ions divalents et d'une molécule d'eau coordonnée par les acides aminés Glu141, Glu145 et Glu132 respectivement. Étant donné le peu de conservation de la séquence primaire entre cet enzyme viral et les enzymes de dégradation de la coiffe des métazoaires, il est possible que le mécanisme utilisé par ces enzymes diffère du mécanisme découvert pour la protéine D10. Cet enzyme deviendrait donc une cible virale potentielle supplémentaire.La caractérisation de ces trois protéines virales a permis d'accroître significativement notre connaissance mécanistique fondamentale des activités catalysées par ces enzymes retrouvés tant chez les virus que chez l'humain et les levures. L'étude de l'ARN 5'-triphosphatase A449R a démontré que des enzymes très proches au niveau phylogénique peuvent posséder des mécanismes divergents. De plus, des études futures pourront démontrer dans quelles mesures les mécanismes découverts pour l'ARN guanylyltransférase A103R et l'enzyme de dégradation de la coiffe D10 seront applicables à d'autres enzymes de même famille présents chez d'autres organismes. Il serait intéressant de poursuivre ces études en incorporant une utilisation accrue de la bioinformatique pour la modélisation des structures tertiaires des enzymes viraux, ainsi que l'utilisation de collections d'analogues de nucléotides pour caractériser les sites actifs des enzymes et ouvrir la voie au développement d'inhibiteurs.

The RNA cap structure is a fundamental feature of most known eukaryotic mRNAs and some viral RNAs, It is important for the stability, transport and translation of mRNAs. It is co-transcriptionally synthesized via the action of 3 consecutive enzymatic reactions: (1) A RNA triphosphatase which cleaves off the 5' terminal phosphate of nascent RNAs; (2) A RNA guanylyltransferase which transfers a GMP moiety onto the acceptor RNA; (3) A RNA (guanine-N7) methyltransferase which methylates the cap guanine at the N7 position. Through the end of the 1990's until now, the crystal structures of several capping enzymes have been solved. However, these structures, although very insightful in themselves, failed to provide any instructive information on several key issues regarding enzyme-substrate interactions. For instance, one of the first breakthrough crystallographic studies in RNA capping chemistry led to the elucidation of the yeast RNA triphosphatase structure (the Cet1 protein). However, in the crystal structure, the Cet1 protein was bound to a sulphate molecule, which was hypothesised to be mimicking the product of the RNA triphosphatase reaction- a phosphate molecule.The inability to capture the RNA triphosphatase in complex with its ligands is probably on account of the inherent thermodynamic instability of this protein when bound to RNA or a nucleotide. A structural definition of the active site of the yeast RNA triphosphatase in complex with an appropriate substrate is still lacking. In addition, the elucidation of the structure of the RNA guanylyltransferase of the Paramecium bursaria chlorella virus -1 (PBCV-1) in several different conformations has been a landmark study which greatly contributed towards the understanding of the catalytic pathway of this model enzyme. On the other hand, despite the presence of the natural substrate-GTP, within the active site of the enzyme, the rationale behind the GTP specificity of RNA guanylyltransferase remains poorly understood. Moreover, a molecular mechanism for the RNA guanylyltransferase reaction is still missing. Finally, the importance of the RNA cap for the process of eukaryotic translation is undisputable. However, the relationship between the RNA cap and translation has been mostly studied indirectly through proteins which bind to the cap structure. Most studies pertaining directly to the impact of the binding of the RNA cap structure have been restricted to investigating the inhibitory potential of various cap analogues on the translation process. Studies on the effects of modified RNA caps at the 5' ends of RNAs have only started in the last few years, and more importantly, the necessity of the N7-methyl group on RNA cap analogues had not been addressed. This thesis therefore aims to provide a structural insight into the structural dynamics of enzyme-ligand(s) interactions of the model S. cerevisiae's RNA triphosphatase and the PBCV-1 RNA guanylyltransferase. In addition, we show that purine analogues can be a useful tool for the study of several cellular processes, such as RNA translation. In the process we have uncovered a novel class of RNA capping enzyme in the flavivirus genus of the Flaviviridae family of RNA viruses, thus providing a more succinct insight into the flaviviral replication complex.

Le virus Herpès humain de type 6B (HHV-6B) est un virus qui infecte environ 95% de la population mondiale et qui est relativement bénin chez les personnes immunocompétentes mais dont les réactivations sont potentiellement graves chez les immunodéprimés. HHV-6B est l’agent étiologique de la roséole de l’enfant ou exanthème subit. Comme tout virus herpétique, HHV-6B a développé diverses stratégies lui permettant de moduler le système immunitaire à son avantage afin de persister au sein de son hôte. La caractérisation de nouveaux mécanismes d’évitement utilisés par HHV-6B ou l’identification de cibles immunodominantes permettraient de mettre en place de nouvelles stratégies afin de combattre l’infection. Au cours de nos recherches, nous avons identifié que la protéine de tégument U54 d’HHV-6B inhibe la synthèse d’interleukine-2 (IL-2). Nous avons déterminé la voie de signalisation de la calcineurine (CaN) / NFAT comme étant le facteur antagonisé par U54 et caractérisé le mécanisme aboutissant à cette inhibition. De plus, en nous basant sur ces résultats, nous avons testé l’impact d’une abrogation de la voie CaN/NFAT par U54 sur la progression de cellules de cancer du sein. Nous avons démontré que l’expression d’U54 provoque une baisse significative de la proliferation de cellules de cancer du sein MCF-7. Ces résultats ont fait germer l’idée du ciblage de cellules de cancer du sein exprimant la protéine U54 couplé à un protocole d’immunothérapie adoptive anti-cancéreuse. Enfin, l’immunothérapie adoptive antivirale est également un sujet d’étude qui a été abordé. Nous avons identifié des épitopes de la protéine IE1 d’HHV-6B présentés dans le contexte de trois des allèles les plus communs dans la population caucasienne : HLA-A*02, HLA-A*03 et HLA-B*07. Ceci nous a permit de perpétrer une expansion clonale de lymphocytes T cytotoxiques (CTL) capables de lyser des cellules infectées qui pourraient servir à contrôler d’éventuelles réactivations virales chez des patients immunodéprimés. De manière générale, nos travaux permettent d’étendre les connaissances sur les mécanismes utilisés par HHV-6B pour contourner le système immunitaire de l’hôte mais également d’identifier des cibles permettant de développer un éventuel protocole d’immunothérapie adoptive.

Streptococcus thermophilus est la seconde bactérie lactique la plus utilisée en transformation laitière. Comme toutes les bactéries, elle peut être infectée par des virus appelés bactériophages ou phages. Les phages représentent un risque significatif en transformation laitière puisqu'ils sont ubiquitaires et peuvent mener à des produits fermentés de qualité inférieure. L'étude de la biologie des phages lactiques et de leurs mécanismes de réplication est nécessaire à la prévention et au contrôle de leur prolifération dans les procédés industriels. En général, les gènes viraux qui sont exprimés dès le début de l'infection sont les plus susceptibles d'encoder des protéines qui interagissent avec des composantes de la bactérie. Chez le phage 2972, plus de la moitié de ces gènes dits précoces n'ont pas de fonction connue. Le principal objectif de cette maîtrise était donc de débuter la caractérisation des protéines virales encodées par certains de ces gènes. Puisque la nature du ou des partenaires d'interaction d'une protéine est souvent directement liée à la fonction de cette dernière, nous avons travaillé au développement de méthodes servant à investiguer les interactions protéine-protéine entre le phage 2972 et sa souche hôte S. thermophilus DGCC7710. Les méthodes adaptées sont basées sur la purification d'affinité avec les étiquettes de type Strep-III® ou s'inspirent de la méthode du BioID. Pour la réalisation de certaines approches, le phage 2972 a dû être modifié génétiquement à l'aide du système CRISPR-Cas de type II-A naturellement présent chez sa bactérie hôte. La caractérisation de quelques-uns de ces phages modifiés génétiquement nous a permis de vérifier ou de formuler des hypothèses qui concernent les relations phage-hôte et la résistance aux phages chez S. thermophilus. L'extraction du protéome bactérien est une étape importante dans l'étude des interactions protéine-protéine. La lyse de notre bactérie modèle, soit DGCC7710, a représenté un défi inattendu dans le développement de notre méthode. En effet, cette bactérie à Gram positif s'est avérée résistante à plusieurs techniques standard de lyse. Toutefois, nous avons démontré que les endolysines, des enzymes utilisées par les phages pour lyser la bactérie en fin d'infection, peuvent être purifiées et utilisées pour la lyse de la souche DGCC7710. Finalement, nous avons travaillé à résoudre la structure de différentes protéines de fonction inconnue du phage 2972 par cristallographie à rayons X. Bien que la structure d'aucune des protéines à l'étude n'ait encore été résolue, nos essais laissent croire qu'une protéine précoce de 2972 interagit avec des acides nucléiques. / Streptococcus thermophilus is one of the most widely used bacterium in the dairy transformation industry. This bacterium is primarily used in the production of yogurt and speciality cheeses such as mozzarella. Like all bacteria, strains of S. thermophilus can be infected by bacterial viruses commonly known as bacteriophages or phages. Phages are ubiquitous and represent a significant risk for the dairy industry as they can greatly impact the quality of fermented dairy products. The study of phage biology is crucial for the development of efficient phage control methods in dairy factories. In general, early expressed phage genes encode viral proteins that are the most likely to interact with host molecules. More than half of such early expressed genes encode proteins of unknown function in lactic phage 2972. The main objective of this thesis was to investigate the function of some of these viral proteins. Because the nature of the binding partner of a given protein often reflects its function, we are developing methods based on affinity purification for the study of protein-protein interactions between the phage 2972 and its host S. thermophilus DGCC7710. Our methods are based on affinity purification with Strep-III® tags or inspired from BioID. In order to achieve some of our objectives, we genetically modified the genome of phage 2972 using the endogenous type II-A CRISPR-Cas system of DGCC7710. The characterization of some of these genetically modified phages gave us insights on phage-host relationships and phage resistance in S. thermophilus. In developing our methods, the proteome extraction of S. thermophilus cells were surprisingly challenging. Indeed, this Gram-positive bacterium was resistant to many standard lysis techniques. Here, we show that purified phage endolysins are very efficient in lysing the strain DGCC7710. Endolysins are phage enzymes that lyse their bacterial host at the end of the phage lytic cycle. Finally, we worked on solving the structure of different proteins of unknown function encoded in the genome of phage 2972 by X-ray crystallography. While we have yet to solve any structure, we observed that one of the early-expressed protein of phage 2972 interacts with nucleic acids.

Le virus humain Herpès-8 (HHV-8) est un virus oncogene étroitement associé au développement du sarcome de Kaposi, au lymphome primitif des séreuses (PEL) et à la maladie de Castleman multicentrique. OBJECTIFS II est bien décrit que HHV-8 dérègle l'homéostasie cellulaire en affectant l'apoptose, le cycle cellulaire et les mécanismes d'activation du système immunitaire. De plus, ce virus est latent dans la majorité des cellules infectées. Les travaux présentés visent à étudier le rôle des protéines de latence de HHV-8 dans la mise en place de l'immunité innée via la synthèse d'interféron (IFN) de type I. METHODES Le rôle individuel de chacune des protéines de latence (vFLIP, vCyclin et LANA-1) sur la synthèse d'IFN de type I a été étudié par des expressions transitoires dans des cellules HEK-293T. L'étude synergique des trois protéines de latence sur la synthèse d'IFN de type I a été réalisée dans des cellules issues de lymphomes PELs exprimant des ARNs interférants contre ces gènes. RESULTATS Tout d'abord, les résultats obtenus démontrent, qu'en présence d'un activateur de la voie IFN, la protéine vFLIP active synergiquement le promoteur IFNB. Cette activation est strictement dépendante de l'activation de NF-KB par vFLIP et est médiée par la région de régulation PRD-II du promoteur IFNB (région de liaison de NF-KB). Ensuite, les résultats suggèrent que, lors d'une reconnaissance d'ADN étranger dans une cellule, LANA-1 inhibe la synthèse d'IFNB. Cette inhibition est générée par la liaison de LANA-1 au promoteur IFNB sur la région PRD-I-III (région de fixation des IRFs) empêchant ainsi la fixation du facteur de transcription IRF3 sur cette région. Puisque LANA-1 inhibe la transcription et l'expression de la protéine CBP, cette dernière ne peut également plus se fixer au promoteur IFNB. Ainsi, la formation du complexe enhanceosome sur le promoteur d'IFNB est altérée par la protéine LANA-1 et l'expression d'IFNB est fortement réduite. La région centrale répétée de la protéine LANA-1 a été démontrée comme majeure dans l'inhibition de la synthèse d'IFN-p. Ensuite, les résultats démontrent que la protéine vCyclin inhibe l'activation des promoteurs IFNB et NF-KB en présence d'un activateur de la voie IFN et ainsi, réduit l'expression d'IFNB. La protéine vCyclin réduit l'expression des facteurs de transcription IRF3 et p50, importants dans la formation du complexe enhanceosome sur le Ul promoteur IFNB, réduisant ainsi son activation. Enfin, puisque ces trois gènes sont transcrits par un même promoteur sous un transcrit tricistronique (vFLIP, vCyclin et LANA-1) épissé en transcrit bicistronique (vFLIP et vCyclin), le rôle synergique de ces protéines dans la synthèse d'IFN de type I a été étudié. Des lymphocytes B issues de PELs inductibles pour la production d'ARNs interférant avec le transcrit bicistronique, le transcrit polycistronique et la combinaison des deux transcrits ont été générés. Ces cellules expriment davantage d'IFNB suite à la réactivation du cycle de replication lytique ou lors d'une infection opportuniste. CONCLUSIONS Cette étude suggère que, par des expressions individuelles, seules les protéines vCyclin et LANA-1 agissent dans le but commun de réduire la synthèse d'IFN. Par contre, dans le cadre de cellules infectées, les trois protéines de latence agissent de concert pour inhiber la synthèse d'IFN. Un modèle murin a été généré pour étudier la pathogénèse induite par HHV-8 en injectant des cellules portant le génome de HHV-8 introduit dans un chromosome artificiel bactérien (BAC) dans des souris immunodéficientes. Le BAC pourrait être utile pour générer des cellules portant des virus mutants pour chacun des gènes latents. Ces cellules pourraient être injectées dans des souris afin d'étudier leur rôle dans la synthèse d'IFN-P dans un contexte d'infection in vivo.

Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) infecte et se réplique dans les cellules du système immunitaire. À sa sortie de la cellule, le virus s’enveloppe d’une partie de la membrane cellulaire et acquiert alors certaines des protéines membranaires de la cellule hôte. C’est le cas de la protéine HLA-DR du complexe majeur d’histocompatibilité de classe II (CMH-II) nécessaire à la présentation antigénique. Son incorporation par le virus augmente le potentiel infectieux et contribue à la persistance du virus. Vpu est une protéine du VIH-1 qui contribue au bourgeonnement viral. Une étude récente a montré que Vpu pourrait diminuer l’expression de HLA-DR mature à la surface des cellules infectées. Toutefois, il est aussi reconnu que Vpu module l’acquisition de HLA-DR mature par le VIH-1. Ces résultats pouvaient être expliqués par un contrôle de la localisation intracellulaire de HLA-DR et/ou des protéines structurales du VIH-1 par Vpu. En somme, Vpu pourrait favoriser les interactions spécifiques entre HLA-DR mature et le VIH-1 tout en diminuant l’expression générale de HLA-DR mature à la surface de la cellule. Nous avons souhaité confirmer ce double rôle de Vpu qui est important dans la pathogénèse du virus puisqu’il bénéficie ainsi des avantages de l’incorporation du HLA-DR mature tout en court-circuitant son rôle dans la réponse antigénique normale. Il est également admis que le virus bourgeonne à partir des microdomaines (radeaux lipidiques) de la cellule hôte. Ces régions de la membrane sont riches en cholestérol et constituent le lieu d’expression préférentiel des molécules de HLA-DR mature. Lors d’un traitement avec de la Simvastatin™, les radeaux lipidiques sont affectés car cette drogue inhibe la synthèse du cholestérol et de surcroit, diminue l’expression de HLA-DR mature à la surface cellulaire. L’usage de la Simvastatin™ nous a renseigné sur l’endroit où le virion pouvait interagir et éventuellement incorporer la molécule de l’hôte HLA-DR dans son enveloppe. Ce projet de recherche à permis de caractériser les interactions entre Vpu et HLA-DR et ainsi de mieux comprendre les mécanismes par lesquels Vpu module à la fois l’expression de HLA-DR à la surface des cellules infectées ainsi que son incorporation sur les virions. Les études conduites en microscopie confocale par co-marquage fluorescent de Vpu et HLA-DR ont conduit à la mise en évidence de l’existence d’une interaction entre Vpu et HLA-DR au sein de la cellule infectée. Les mesures de l’expression de HLA-DR à la surface de cellules infectées et de son incorporation à la surface des virions à l’aide des techniques de cytométrie en flux et d’immunocapture ont également permis de confirmer la modulation de l’expression de HLA-DR par Vpu. Enfin, le traitement des cellules infectées avec la Simvastatin™ nous a permis d’émettre l’hypothèse que l’acquisition de HLA-DR s’effectuait à une étape antérieure au bourgeonnement viral. Pour finir, nous avons tenté de corréler les différences observées dans la pathogénèse de certains sous-types viraux avec la variabilité de la séquence de Vpu entre ceux-ci, en lien avec une différence de localisation subcellulaire de Vpu. Les études conduites dans le cadre de mon projet de maîtrise ont contribués à une meilleure compréhension des mécanismes d’acquisition des molécules de l’hôte et de leur possible répercussion sur la pathogénèse du VIH-1 par différents sous-types viraux. Elles renseignent également de manière substantielle sur le rôle de Vpu, protéine dont le rôle est demeuré relativement méconnu dans la pathogénèse du VIH-1 ainsi que sur les mécanismes d’acquisition des molécules de l’hôte par le VIH-1. Les résultats présentés dans ce mémoire devraient susciter un regain d’intérêt pour cette protéine ainsi que pour les mécanismes d’incorporation des molécules de l’hôte par le VIH-1. / The type-1 human immunodeficiency virus (HIV-1) infects and replicates itself in the immune system cells. When it buds out, the virus covers itself with a part of the plasma membrane and then acquires some of the host membrane proteins. It is the case for the HLA-DR protein from the major histocompatibility complex class II (MHC-II) necessary for antigen presentation. Its viral incorporation increases the infectious potential and contributes to viral persistence. Vpu is an HIV-1 protein which contributes to the viral budding process. A recent study showed that Vpu could decrease the mature HLA-DR expression at the infected cell surface. Nevertheless, it is also known that Vpu modulates the mature HLA-DR acquisition by HIV-1. Those results could be explained by a control of the intracellular localization of HLA-DR and/or some HIV-1 structural protein by Vpu. In summary, Vpu could promote specific interactions between mature HLA-DR and HIV-1 while decreasing the general expression of mature HLA-DR at the cell surface. We wished to confirm the dual role of Vpu which is important in the viral pathogenesis by getting the mature HLA-DR incorporation advantages while short-circuiting its role in the normal antigen response. It is also accepted that the virus buds out from the infected cell lipid raft. These region are highly enriched with cholesterol and the preferential expression location of mature HLA-DR. With a Simvastatin™ treatment, the lipid raft are disrupt because this drug inhibit the synthesis of cholesterol, therefore down-modulating the mature HLA-DR expression at the cell surface. Using Simvastatin™ inform us on where the virus could possibly acquire the mature host molecule HLA-DR in its envelop. This research project allowed us to characterise the possible interactions between Vpu and HLA-DR that led to a better understanding of the mechanism by which Vpu modulates HLA-DR at the infected cell surface and its viral incorporation. The study conducted by confocal microscopy using multiple fluorescent tagging of Vpu and HLA-DR has led to the evidence of an interaction between Vpu and mature HLA-DR in an infected cell. The measurement of the cell surface expression of HLA-DR and its viral incorporation by flow cytometer and immunocapture techniques also allowed the confirmation of the Vpu modulation on HLA-DR expression. Finally, the Simvastatin™ treatment on infected cells allowed us to hypothesis that the mature HLA-DR acquisition was done at an earlier stage that the viral budding. To conclude, we also attempted to correlate the difference in the pathogenesis of some HIV-1 subtype with the sequence variability of Vpu between them: a link with a different subcellular localization of Vpu. The studies that have been performed in order to complete my master diploma have contributed to a better understanding of the acquisition mechanism of certain host molecules and their impact on different sub-types of HIV-1 pathogenesis. They also give substantial information on the roles of Vpu, a virus-encoded protein whose involvement in HIV-1 pathogenesis remains to be defined and on the acquisition mechanism of some host molecule by HIV-1. The results presented in this thesis will probably arouse an interest renewal for this protein and for the host molecule incorporation mechanism used by HIV-1.

Le métapneumovirus humain (hMPV) est un virus responsable d’infections aiguës des voies respiratoires telles que des bronchiolites, des bronchites ou des pneumonies, principalement chez les populations à risques que sont les jeunes enfants de moins de 5ans, ainsi que les personnes âgées ou immunodéprimées. Découvert en 2001, ce virus et sa pathogénèse ne restent encore aujourd’hui que partiellement caractérisés. De ce fait et malgré les besoins, il n’y a aucun vaccin ou traitement thérapeutique spécifique et efficace contre le HMPV disponible sur le marché. Dans ce contexte, mon projet de thèse s’est articulé autour de deux axes principaux: (i) L’étude de la protéine de fusion F du virus hMPV, protéine majeure antigénique de surface et responsable de l’entrée du virus dans la cellule cible. Elle a pour particularité d’induire de manière autonome la fusion membranaire in vitro et d’être associée à des effets cytopathiques variable selon les souches virales. De par son rôle clé pour le virus hMPV, la protéine F a déjà fait l’objet de plusieurs études structurales et fonctionnelles mais les déterminants de cette activité fusogénique ne sont pas encore entièrement caractérisés. Nous nous sommes donc intéressés à l’identification de déterminants du phénotype viral hyperfusogénique, localisés dans les domaines heptad repeats de la protéine F du hMPV. (ii) L’atténuation de deux souches virales cliniques (CAN98-75 et C-85473) par délétion de gènes accessoires dans le but de développer des candidats vaccinaux adaptés aux enfants en bas âge. Différents virus ont été générés par génétique inverse et les délétions des gènes accessoires SH et G dans les deux fonds génétiques viraux ont été étudiées pour leur impact sur l’infectivité, la réplication et la pathogénèse virale in vitro et in vivo ainsi que leur contribution pour le développement de virus atténués candidats vaccinaux. / Human metapneumovirus (hMPV) is a major pathogen responsible of acute respiratory tract infections, such as bronchiolitis or pneumonia, affecting especially infants, under five years old, elderly individuals and immunocompromised adults. Identified since2001, this virus and its pathogenes is still remain largely unknown and no licensed vaccines or specific antivirals against hMPV are currently available. In this context, my research project was built over two main subjects: (i) The study of the fusion F glycoprotein which is the major antigenic protein of hMPV and is responsible of viral entry into host cell. By its crucial role for the virus, the F protein has already been characterized in several structural and/or functional studies. Thus, it has been described that the hMPV F protein induces membrane fusion autonomously, resulting in variable cytopathic effects in vitro, in a strain-dependent manner. However, as the determinants of the hMPV fusogenic activity are not well characterized yet, we focused on identification of some of these, located in heptad repeats domains of the protein. (ii) The evaluation of hMPV SH and G gene deletion for viral attenuation. Live-attenuated hMPV vaccine candidates for infants’ immunization has been constructed thank to this deletion approach at the beginning of hMPV vaccine development efforts. Despite encouraging results, these candidates have not been further characterized and the importance of the viral background has not been evaluated.

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Le virus de la paralysie chronique de l'abeille (Chronic bee paralysis virus, CBPV) est l'agent étiologique d'une maladie infectieuse et contagieuse des abeilles adultes (Apis mellifera L.), appelée la paralysie chronique. Le CBPV est un virus à ARN simple brin positif qui contient 2 fragments d'ARN majoritaires. L'ARN 1 (3674 nt) et l'ARN 2 (2305 nt) codent respectivement 3 et 4 cadres ouverts de lecture (ORF). La séquence d'acides aminés de l'ORF 3 de l'ARN 1 partage des similitudes avec l'ARN polymérase ARN dépendante (RdRp) des virus des familles Nodaviridae et Tombusviridae. Par analogie avec ces familles virales, il a été suggéré que l'ARN 1 coderait les protéines non-structurales tandis que l'ARN 2 coderait les protéines structurales. Cependant, la réalité de ces protéines virales doit être démontrée expérimentalement afin d'étudier leurs fonctions, de mieux décrire ce virus et sa position taxonomique ainsi que d'améliorer les outils de diagnostic. Dans ce but, différentes approches expérimentales ont été utilisées. Une comparaison des protéomes d'hémolymphe d'abeilles non-infectées et infectées par le CBPV a été effectuée. Les protéines différentiellement exprimées ont été identifiées par empreinte peptidique massique (peptide mass fingerprint, PMF). Cette étude a permis d'identifier des protéines de l'abeille dont certaines contribueraient à une réponse immunitaire antivirale, mais aucune protéine virale n'a été identifiée par cette approche. Les ARN extraits du CBPV ont été utilisés dans des expériences de traduction in vitro. Malgré plusieurs essais réalisés en faisant varier les conditions expérimentales, cette approche s'est révélée infructueuse. / Chronic bee paralysis virus (CBPV) is the etiological agent that causes an infectious and contagious disease in adult bees (Apis mellifera L.), called chronic paralysis. CBPV is a positive single-stranded fragmented RNA virus which contains 2 major viral RNA fragments. RNA 1 (3674 nt) and RNA 2 (2305 nt) encode 3 and 4 putative open reading frames (ORFs), respectively. The amino acid sequence of ORF 3 on RNA 1 shares similarities with the RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) of virus families Nodaviridae and Tombusviridae. By analogy with these viral families, it has been suggested that RNA 1 encodes non-structural proteins and RNA 2 encodes structural proteins. However, the reality of viral proteins needs to be experimentally demonstrated in order to study theirs functions, to describe CBPV biology and its taxonomic position and to improve diagnostic tools. With this aim, different experimental strategies have been used.A comparison of hemolymph proteomes between uninfected bees and bees infected with CBPV was performed. Differentially expressed proteins have been identified using peptide mass fingerprint method (PMF). This study allowed only identifying proteins of bees which could contribute to an antiviral immune response but viral proteins were not identified using this approach. Extracted CBPV RNAs were used for in vitro translation experiments. Despite several assays in varying experimental conditions, this approach has been unsuccessful. Another approach was to generate antibodies directed against different proteins or parts of viral proteins.