La molécule HLA-DR du complexe majeur d'histocompatibilité de classe II (CMH-II) est fortement incorporée dans l'enveloppe virale du virus d'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1). L'expression à la membrane cytoplasmique de cette même molécule est modulée à la baisse par la protéine virale Nef. D'autre part, Nef augmente l'expression de la chaîne invariante CD74, une autre protéine du CMH-II associée avec HLA-DR dans un complexe protéique immature. D'autres protéines accessoires virales, telles Vpu, interagissent avec le CMH-II. Vpu diminue l'expression de HLA-DR et interagit avec la portion intracellulaire de CD74. Cette étude a pour but de vérifier si les complexes immatures de CMH-II sont incorporés dans l'enveloppe virale du VIH-1. Elle veut aussi vérifier l'impact de la présence de Nef et de Vpu sur l'incorporation du CMH-II. La modulation à la baisse de HLA-DR et l'augmentation d'expression de CD74 induite par Nef ont été confirmées à la surface de lymphocytes T CD4+. La molécule CD74 représentant un complexe de CMH-II immature ne semble pas être incorporée dans l'enveloppe virale, peu importe la présence ou l'absence de Nef et de Vpu lors de l'infection. La présence de Nef ne semble pas influencer l'incorporation de HLA-DR qui demeure toujours fortement incorporée. Vpu semble important pour l'incorporation du HLA-DR, puisqu'un virus sans Vpu incorpore nettement moins de HLA-DR. Un mutant déficient en phosphorylation sur deux serines de Vpu, pour sa part, semble permettre une incorporation partielle de cette même molécule. Ces résultats semblent indiquer que HLA-DR est incorporée selon son stade de maturation et que Vpu est essentielle à l'incorporation de HLA-DR.

Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) infecte et se réplique dans les cellules du système immunitaire. À sa sortie de la cellule, le virus s’enveloppe d’une partie de la membrane cellulaire et acquiert alors certaines des protéines membranaires de la cellule hôte. C’est le cas de la protéine HLA-DR du complexe majeur d’histocompatibilité de classe II (CMH-II) nécessaire à la présentation antigénique. Son incorporation par le virus augmente le potentiel infectieux et contribue à la persistance du virus. Vpu est une protéine du VIH-1 qui contribue au bourgeonnement viral. Une étude récente a montré que Vpu pourrait diminuer l’expression de HLA-DR mature à la surface des cellules infectées. Toutefois, il est aussi reconnu que Vpu module l’acquisition de HLA-DR mature par le VIH-1. Ces résultats pouvaient être expliqués par un contrôle de la localisation intracellulaire de HLA-DR et/ou des protéines structurales du VIH-1 par Vpu. En somme, Vpu pourrait favoriser les interactions spécifiques entre HLA-DR mature et le VIH-1 tout en diminuant l’expression générale de HLA-DR mature à la surface de la cellule. Nous avons souhaité confirmer ce double rôle de Vpu qui est important dans la pathogénèse du virus puisqu’il bénéficie ainsi des avantages de l’incorporation du HLA-DR mature tout en court-circuitant son rôle dans la réponse antigénique normale. Il est également admis que le virus bourgeonne à partir des microdomaines (radeaux lipidiques) de la cellule hôte. Ces régions de la membrane sont riches en cholestérol et constituent le lieu d’expression préférentiel des molécules de HLA-DR mature. Lors d’un traitement avec de la Simvastatin™, les radeaux lipidiques sont affectés car cette drogue inhibe la synthèse du cholestérol et de surcroit, diminue l’expression de HLA-DR mature à la surface cellulaire. L’usage de la Simvastatin™ nous a renseigné sur l’endroit où le virion pouvait interagir et éventuellement incorporer la molécule de l’hôte HLA-DR dans son enveloppe. Ce projet de recherche à permis de caractériser les interactions entre Vpu et HLA-DR et ainsi de mieux comprendre les mécanismes par lesquels Vpu module à la fois l’expression de HLA-DR à la surface des cellules infectées ainsi que son incorporation sur les virions. Les études conduites en microscopie confocale par co-marquage fluorescent de Vpu et HLA-DR ont conduit à la mise en évidence de l’existence d’une interaction entre Vpu et HLA-DR au sein de la cellule infectée. Les mesures de l’expression de HLA-DR à la surface de cellules infectées et de son incorporation à la surface des virions à l’aide des techniques de cytométrie en flux et d’immunocapture ont également permis de confirmer la modulation de l’expression de HLA-DR par Vpu. Enfin, le traitement des cellules infectées avec la Simvastatin™ nous a permis d’émettre l’hypothèse que l’acquisition de HLA-DR s’effectuait à une étape antérieure au bourgeonnement viral. Pour finir, nous avons tenté de corréler les différences observées dans la pathogénèse de certains sous-types viraux avec la variabilité de la séquence de Vpu entre ceux-ci, en lien avec une différence de localisation subcellulaire de Vpu. Les études conduites dans le cadre de mon projet de maîtrise ont contribués à une meilleure compréhension des mécanismes d’acquisition des molécules de l’hôte et de leur possible répercussion sur la pathogénèse du VIH-1 par différents sous-types viraux. Elles renseignent également de manière substantielle sur le rôle de Vpu, protéine dont le rôle est demeuré relativement méconnu dans la pathogénèse du VIH-1 ainsi que sur les mécanismes d’acquisition des molécules de l’hôte par le VIH-1. Les résultats présentés dans ce mémoire devraient susciter un regain d’intérêt pour cette protéine ainsi que pour les mécanismes d’incorporation des molécules de l’hôte par le VIH-1. / The type-1 human immunodeficiency virus (HIV-1) infects and replicates itself in the immune system cells. When it buds out, the virus covers itself with a part of the plasma membrane and then acquires some of the host membrane proteins. It is the case for the HLA-DR protein from the major histocompatibility complex class II (MHC-II) necessary for antigen presentation. Its viral incorporation increases the infectious potential and contributes to viral persistence. Vpu is an HIV-1 protein which contributes to the viral budding process. A recent study showed that Vpu could decrease the mature HLA-DR expression at the infected cell surface. Nevertheless, it is also known that Vpu modulates the mature HLA-DR acquisition by HIV-1. Those results could be explained by a control of the intracellular localization of HLA-DR and/or some HIV-1 structural protein by Vpu. In summary, Vpu could promote specific interactions between mature HLA-DR and HIV-1 while decreasing the general expression of mature HLA-DR at the cell surface. We wished to confirm the dual role of Vpu which is important in the viral pathogenesis by getting the mature HLA-DR incorporation advantages while short-circuiting its role in the normal antigen response. It is also accepted that the virus buds out from the infected cell lipid raft. These region are highly enriched with cholesterol and the preferential expression location of mature HLA-DR. With a Simvastatin™ treatment, the lipid raft are disrupt because this drug inhibit the synthesis of cholesterol, therefore down-modulating the mature HLA-DR expression at the cell surface. Using Simvastatin™ inform us on where the virus could possibly acquire the mature host molecule HLA-DR in its envelop. This research project allowed us to characterise the possible interactions between Vpu and HLA-DR that led to a better understanding of the mechanism by which Vpu modulates HLA-DR at the infected cell surface and its viral incorporation. The study conducted by confocal microscopy using multiple fluorescent tagging of Vpu and HLA-DR has led to the evidence of an interaction between Vpu and mature HLA-DR in an infected cell. The measurement of the cell surface expression of HLA-DR and its viral incorporation by flow cytometer and immunocapture techniques also allowed the confirmation of the Vpu modulation on HLA-DR expression. Finally, the Simvastatin™ treatment on infected cells allowed us to hypothesis that the mature HLA-DR acquisition was done at an earlier stage that the viral budding. To conclude, we also attempted to correlate the difference in the pathogenesis of some HIV-1 subtype with the sequence variability of Vpu between them: a link with a different subcellular localization of Vpu. The studies that have been performed in order to complete my master diploma have contributed to a better understanding of the acquisition mechanism of certain host molecules and their impact on different sub-types of HIV-1 pathogenesis. They also give substantial information on the roles of Vpu, a virus-encoded protein whose involvement in HIV-1 pathogenesis remains to be defined and on the acquisition mechanism of some host molecule by HIV-1. The results presented in this thesis will probably arouse an interest renewal for this protein and for the host molecule incorporation mechanism used by HIV-1.

Le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) cause quotidiennement 14 000 nouvelles infections et 8 000 décès (1). Certes, les antirétroviraux actuels aident le système immunitaire des porteurs du VIH à contenir le virus. Néanmoins, ils sont inefficaces pour guérir l’infection vu l’intégration du génome viral dans celui de la personne infectée. Ainsi, la prévention de l’infection demeure, en ce moment, la meilleure arme dont nous disposions contre ce rétrovirus. La connaissance du cycle de réplication du VIH-1 constitue la pierre angulaire de la conception de médicaments et d’outils de prévention. C’est pourquoi nous en étudions des étapes encore peu définies comme le bourgeonnement, et plus particulièrement l’incorporation de molécules d’origine cellulaire dans l’enveloppe virale. Les résultats présentés dans cette thèse montrent que des isolats cliniques du VIH-1 acquièrent les molécules HLA-DR, ICAM-1, CD40, CD86 et CD40L des cellules qu’ils infectent dans des modèles de culture de cellules reflétant au mieux la réalité du corps humain, telles des cultures ex vivo de portions d’amygdales palatines. Par le fait même, nous sommes les premiers à mentionner la présence de CD40L dans l’enveloppe du VIH-1. Également, nos résultats relatifs à l’appropriation des protéines cellulaires HLA-DR et CD40L par ce virus prouvent que celle-ci découle d’un mécanisme indépendant des glycoprotéines de l’enveloppe virale. Nos résultats démontrent aussi que les lymphocytes B d’amygdales palatines sont activés suite à la sollicitation de leur récepteur CD40 par la molécule CD40L insérée dans l’enveloppe du VIH-1. Ainsi, la translocation de NF-κB au noyau de ces cellules est induite, de même que la sécrétion d’anticorps IgG et d’IL-6 et l’adhésion cellulaire homotypique. La molécule CD40L permet au virus de mieux se lier aux lymphocytes B qui le transmettent par ailleurs aux lymphocytes T CD4+. Enfin, caractériser davantage le mécanisme d’acquisition de molécules de l’hôte par le VIH-1 et son impact sur la pathogenèse associée au virus contribuera peut-être à identifier des molécules pouvant être ciblées par une nouvelle thérapie, voire une immunisation. / Ever since mankind faced human immunodeficiency virus (HIV), advances in research have been compromised by many difficulties, some of them being related to the complexity of the virus. Because HIV causes 14 000 new infections and 8 000 deaths daily (1), we must work intensely to fight this pathogen. Although antiretroviral drugs help the immune system of HIV-infected individuals to contain the virus, these drugs are ineffective to cure the infection, considering that the viral genome is integrated within the host genome. Thus, the best way to fight HIV infection at this point is to prevent it. The design of new therapies and prevention tools rely on our knowledge of the replication cycle of HIV. Therefore, we study steps of the viral cycle that are less defined, such as budding, and particularly the incorporation of molecules of cellular origin in the viral envelope. The results we present in this thesis show that host-derived HLA-DR, ICAM-1, CD40, CD86 and CD40L molecules are acquired by clinical isolates of HIV-1 produced in the most natural culture models, such as pieces of palatine tonsils cultured ex vivo. Moreover, we are the first to report the CD40L molecule as being part of HIV-1’s envelope. Also, our results indicate that incorporation of host HLA-DR and CD40L is independent of viral envelope glycoproteins. Furthermore, our results show that B lymphocytes from tonsils are activated following the binding of their CD40 receptor by the CD40L molecule inserted in the envelope of HIV-1. The translocation of NF-κB to the nucleus of cells is then induced, as for the secretion of IgG antibodies, production of IL-6 and homotypic cell-to-cell adhesion. The CD40L protein facilitates binding of virions to B lymphocytes which transfer them to T CD4+ lymphocytes. In the future, further investigation of the mechanism of HIV-1 host molecule incorporation and its impact on HIV-1 pathogenesis may help in the identification of new molecules being able to be targeted by a new therapy or immunization.