Thèse de doctorat : Biologie cellulaire et moléculaire : Paris 12 : 2006. Tesi di dottorato : Biologia cellulare e molecolare : Università degli studi di Parma : 2006. / Thèse soutenue en co-tutelle. Titre provenant de l'écran-titre. Pagination : III-191 f. Bibliogr. f. 165-186.

Trois classes majeures de récepteurs de l’immunité innée sont reconnues pour être impliquées dans la reconnaissance de pathogènes : les Toll-like receptors (TLRs), les Retinoic acid-inducible gene I-like receptors (RLRs) ainsi que les Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors (NLRs). NOD2, un des membres de la famille des NLRs, a été initialement reconnu comme étant impliqué dans la reconnaissance du muramyl dipeptide (MDP), un composé de la paroi de peptidoglycane bactérienne. NOD2 est également connu pour être un facteur de risque associé à plusieurs maladies inflammatoires humaines, en particulier la maladie de Crohn et le syndrome de Blau. Récemment, il a été démontré que NOD2 a également la capacité de reconnaitre des motifs viraux à ARN simple brin, tel que celui du virus de l’influenza du type A. Bien que les fonctions antimicrobiennes de NOD2 soient maintenant supportées par de nombreuses études, son rôle dans la réponse inflammatoire reste à clarifier. Chez les patients atteints de la maladie de Crohn, il n’est pas clair à l’heure actuelle si les mutations dans le gène NOD2 sont liées à une incapacité de contrôler l’élimination bactérienne, ou si l’inflammation résulte d’une non régulation de la réponse inflammatoire. Dans notre laboratoire, nous avons mis en évidence que le traitement avec le MDP peut influencer l’homéostasie immunitaire dans divers modèles inflammatoires chez la souris. Le but de ce travail de recherche fut d’investiguer les populations cellulaires et les éventuels mécanismes sous-jacents à l’activation de la voie NOD2 par le MDP et de déterminer leurs implications dans le contrôle de la réponse inflammatoire, à l’aide de différents modèles murins. Ces études nous ont permis d’approfondir les divers mécanismes potentiels ainsi que les populations cellulaires impliquées dans la réponse immunitaire liée à l’activation de NOD2 par le MDP. Les résultats des études regroupées dans cette thèse soulignent le rôle de la voie NOD2 dans le contrôle de l’inflammation. En effet, nous avons mis en évidence le rôle de NOD2 dans le développement des monocytes patrouilleurs Ly6Clow, des macrophages alvéolaires (MA) ainsi que des lymphocytes T régulateurs (Treg) et leur implication dans la régulation de l’inflammation lors d’une infection par le virus de l’influenza. Ces travaux de recherche ont permis d’accroitre notre compréhension de la voie NOD2 et de son effet bénéfique dans le contrôle de l’inflammation et suggèrent que cela pourrait constituer une cible thérapeutique intéressante pour le traitement de maladies inflammatoires et virales. / Three major classes of innate immunity receptors are known to be involved in pathogen recognition: the Toll-like receptors (TLRs), the Retinoic acid-inducible gene I-like receptors (RLRs), and the Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors (NLRs). NOD2, a member of the NLR family, was initially known to be involved in the recognition of muramyl dipeptide (MDP), a compound of the bacterial peptidoglycan wall. NOD2 is suspected to be associated with inflammatory diseases such as Crohn's disease and Blau's syndrome. Recently, NOD2 receptor was shown to have the capacity to recognize viral single-stranded RNA motifs, such as Influenza A virus. However, although the antimicrobial functions of NOD2 are now supported by numerous studies, its role in the inflammatory response remains to be clarified. In patients with Crohn disease, it is unclear whether the mutations in NOD2 lead to an inability to control bacterial clearance, or if the inflammation results from a non-regulation of the inflammatory response. In our laboratory, we highlighted that MDP treatment could control immune homeostasis in various inflammatory models in mice. The purpose of this work was to investigate the cell populations and the eventual mechanisms underlying the activation of the NOD2 pathway by MDP and determine their implications for controlling the inflammatory response using different murine models. These studies allowed us to deepen the various potential mechanisms as well as the cell populations involved in the immune response linked to the activation of NOD2 by MDP. The results underline the promising role of the NOD2 pathway in the control of inflammation. Indeed, we highlighted the role of NOD2 in the development of Ly6Clow patrolling monocytes, alveolar macrophages and Treg cells and their involvement in the regulation of inflammation, during influenza A virus infection. This work has therefore increased our understanding of the NOD2 pathway and its beneficial effects in the control of inflammation and suggests that it could be an interesting therapeutic target to treat inflammatory and viral diseases

Les infections respiratoires virales sont la cause de consultation médicale la plus fréquente mondialement. Les traitements antiviraux disponibles sont efficaces lorsqu'ils sont prescrits rapidement après le début des symptômes. Cependant les méthodes de diagnostic actuel sont trop lentes pour être utile lors des consultations. D est donc nécessaire de développer des tests diagnostiques rapides, sensibles, spécifiques et ubiquitaires. Ce mémoire présente mes travaux sur le développement d'un essai de diagnostic moléculaire qui combine la technologie du PCR multiplex avec une détection rapide par hybridation sur puces à ADN sur une plate-forme microfluidique (CD d'hybridation). Les virus ciblés sont les adenovirus, l'influenza B et les parainfluenza de type 4. Ces derniers sont des virus en émergence et seront traités plus en détails dans le premier chapitre du présent mémoire. Cet essai sera combiné avec d'autres essais en développement dans notre laboratoire pour détecter les quinze virus respiratoires les plus importants cliniquement.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2009. / Bibliogr.: f. 107-115. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Le virus respiratoire syncytial (VRS) est le plus important pathogène respiratoire du jeune enfant. Dans une étude prospective menée au cours de deux saisons hivernales, parmi les enfants de 0-3 ans hospitalisés pour infections des voies respiratoires (IVR) , au moitis un virus respiratoire a été retrouvé chez 74%. Le VRS était présent chez 55,6% des enfants. Deux sousgroupes (A et B) du VRS et plusieurs génotypes ont été identifiés basé sur la séquence du gène G. Le séquençage de la glycoprotéine G et l'analyse phylogénétique ont été effectués sur les souches détectées. La comparaison des données cliniques des 106 enfants avec le sous-groupe A du VRS (96 génotypes GA2) et 94 enfants avec le sous-groupe B du VRS (62 génotypes GB3) a montré que le sous-groupe A et le génotype GAI étaient associés à une plus grande sévérité de la maladie en comparaison avec les souches du sous-groupe B. Parmi les enfants atteints de VRS qui ont reçu des antibiotiques (AB) de façon empirique à l'admission, la réception d'un résultat d'un test rapide confirmant la présence du VRS n'a pas réduit subséquemment l'utilisation des AB. La proportion des hospitalisations attribuables au VRS et à l'influenza estimée à partir des banques administratives par six méthodes statistiques connues a été comparée aux résultats de l'étude prospective chez les enfants de 6 à 23 mois. Les estimés obtenus variaient de façon considérable selon la saison et la méthode. Les méthodes statistiques usuelles ne semblent pas en mesure d'estimer correctement les hospitalisations attribuables aux virus respiratoires.

Le métapneumovirus humain (hMPV) est un virus responsable d’infections aiguës des voies respiratoires telles que des bronchiolites, des bronchites ou des pneumonies, principalement chez les populations à risques que sont les jeunes enfants de moins de 5ans, ainsi que les personnes âgées ou immunodéprimées. Découvert en 2001, ce virus et sa pathogénèse ne restent encore aujourd’hui que partiellement caractérisés. De ce fait et malgré les besoins, il n’y a aucun vaccin ou traitement thérapeutique spécifique et efficace contre le HMPV disponible sur le marché. Dans ce contexte, mon projet de thèse s’est articulé autour de deux axes principaux: (i) L’étude de la protéine de fusion F du virus hMPV, protéine majeure antigénique de surface et responsable de l’entrée du virus dans la cellule cible. Elle a pour particularité d’induire de manière autonome la fusion membranaire in vitro et d’être associée à des effets cytopathiques variable selon les souches virales. De par son rôle clé pour le virus hMPV, la protéine F a déjà fait l’objet de plusieurs études structurales et fonctionnelles mais les déterminants de cette activité fusogénique ne sont pas encore entièrement caractérisés. Nous nous sommes donc intéressés à l’identification de déterminants du phénotype viral hyperfusogénique, localisés dans les domaines heptad repeats de la protéine F du hMPV. (ii) L’atténuation de deux souches virales cliniques (CAN98-75 et C-85473) par délétion de gènes accessoires dans le but de développer des candidats vaccinaux adaptés aux enfants en bas âge. Différents virus ont été générés par génétique inverse et les délétions des gènes accessoires SH et G dans les deux fonds génétiques viraux ont été étudiées pour leur impact sur l’infectivité, la réplication et la pathogénèse virale in vitro et in vivo ainsi que leur contribution pour le développement de virus atténués candidats vaccinaux. / Human metapneumovirus (hMPV) is a major pathogen responsible of acute respiratory tract infections, such as bronchiolitis or pneumonia, affecting especially infants, under five years old, elderly individuals and immunocompromised adults. Identified since2001, this virus and its pathogenes is still remain largely unknown and no licensed vaccines or specific antivirals against hMPV are currently available. In this context, my research project was built over two main subjects: (i) The study of the fusion F glycoprotein which is the major antigenic protein of hMPV and is responsible of viral entry into host cell. By its crucial role for the virus, the F protein has already been characterized in several structural and/or functional studies. Thus, it has been described that the hMPV F protein induces membrane fusion autonomously, resulting in variable cytopathic effects in vitro, in a strain-dependent manner. However, as the determinants of the hMPV fusogenic activity are not well characterized yet, we focused on identification of some of these, located in heptad repeats domains of the protein. (ii) The evaluation of hMPV SH and G gene deletion for viral attenuation. Live-attenuated hMPV vaccine candidates for infants’ immunization has been constructed thank to this deletion approach at the beginning of hMPV vaccine development efforts. Despite encouraging results, these candidates have not been further characterized and the importance of the viral background has not been evaluated.

Le séquençage du génome d’un microorganisme est un jalon important dans l’étude de sa biologie. Quel que soit cet organisme, les outils bio-informatiques nécessaires pour comprendre son génome et le comparer aux autres génomes séquencés seront similaires. Dans cette thèse, l’ADN génomique de parasites et de virus est mis à profit afin de mieux comprendre ces microorganismes. Dans un premier temps, le parasite protozoaire Leishmania est étudié par transcriptomique et par génomique comparative afin de mieux comprendre son infectivité, sa résistance aux antiparasitaires et son mode de vie dimorphique. Ce parasite alterne entre le stade flagellé (promastigote) et le stade intracellulaire aflagellé (amastigote). Afin de faciliter l’analyse par biopuces du transcriptome de Leishmania, un système de gestion et d’analyse de données de biopuces a été conçu. Quatre études utilisant ce système sont présentées sommairement et leurs implications sont discutées. Deuxièmement, le génome de l’espèce Leishmania (sauroleishmania) tarentolae, qui n’est pas pathogène pour l’humain, a été séquencé et comparé à trois espèces infectant l’homme. Cette étude a montré que, même si peu de gènes différencient les espèces, L. tarentolae possède moins de gènes associés au stade amastigote que les autres espèces. Deux familles de gènes ont été trouvées en nombre de copies élevées chez L. tarentolae : GP63 et PSA31C. Ces résultats permettent une meilleure compréhension de la biologie de L. tarentolae et de la virulence des autres espèces de Leishmania. Dans un deuxième temps, les séquences des génomes de virus respiratoires disponibles dans les bases de données publiques ont été analysées pour créer un test diagnostique permettant la détection et l’identification de 25 types de virus respiratoires, dont la grippe A (H1N1) responsable de la pandémie de 2009 et la grippe aviaire A (H5N1). Le test a été validé avec des échantillons de laboratoire et avec des échantillons cliniques. Même si l’étude du parasite Leishmania était indépendante de celle des virus respiratoires, les approches utilisées pour ces deux projets étaient similaires. Ainsi, la bio-informatique est un outil essentiel en microbiologie, car elle est indispensable pour résoudre des problèmes de diverses natures chez des organismes différents. / Sequencing a genome is a milestone in the study of an organism. Bioinformatics allow both to better understand single organisms and to compare them to related species through comparative genomics. This thesis centers on the idea that genome sequence of parasites and viruses can be used in various ways to better understand these microorganisms. Transcriptomics and comparative genomics were used to study the protozoan parasite Leishmania in order to better understand its virulence, its resistance to antiparasitic drugs, and its dimorphic life-cycle, which includes a flagellated free form named promastigote and an aflagellate intracellular form named amastigote. In order to study gene expression in Leishmania, an integrated management and analysis system was created, along with protocols designed for Leishmania microarrays analysis. Four studies using this system are briefly described. In another study, the genome of Leishmania (sauroleishmania) tarentolae, a lizard parasite, was sequenced and compared to human pathogenic Leishmania species. This study showed little difference between the Leishmania species, although L. tarentolae seems to contain less genes associated to the amastigote life-cycle, including the amastin gene. Two gene families were highly expanded in L. tarentolae: the surface metalloprotease GP63 and the promastigote antigen protein PSA31C. These results provide a better understanding of L. tarentolae biology and give insights on the genes involved in virulence in pathogenic Leishmania species. The second part of this thesis concerns the creation of a molecular diagnostic assay for the detection and identification of 25 respiratory virus types, including the influenza A/H1N1 pandemic strain and the avian influenza A/H5N1 strain. This assay was created by analyzing genome sequences available from public repositories and it was afterwards tested on laboratory and clinical virus strains. Although Leishmania and respiratory viruses are distantly related, the approaches used in both projects were similar. Thus, bioinformatics is an essential and ubiquitous science that allows to solve problems in different areas (“omics”) of biology.

Cette étude vise à estimer le risque d'hospitalisation lié à l'influenza chez les femmes enceintes du Québec durant trois périodes d'influenza saisonnière (2006-2007, 2007-2008 et 2008-2009) et pendant la période d'influenza pandémique de 2009. Il existe un lien significatif entre l'intensité de l'activité du virus de l'influenza pendant les périodes d'influenza saisonnière et de pics pandémiques et les hospitalisations pour infections respiratoires liées à l'influenza des femmes enceintes au troisième trimestre de grossesse. Ces résultats n'appuient pas la recommandation de vacciner les femmes enceintes contre l'influenza au premier ou au deuxième trimestre de la grossesse. Les conclusions de cette étude se basent sur de critères de substitution de la grippe plutôt que la grippe confirmée en laboratoire. Un suivi prospectif avec confirmation de laboratoire pourrait réaffirmer le fardeau de la maladie estimé dans la présente étude.

Le Saccharopolyspora rectivirgula (SR) est le principal agent responsable du Poumon du fermier, une forme d'alvéolite allergique extrinsèque. Des modèles expérimentaux ont permis de mieux comprendre cette maladie qui est caractérisée par une réponse immune exacerbée et une lymphocytose pulmonaire marquée. Des cofacteurs, tels l'infection virale, sont probablement nécessaires au développement de la maladie puisque la majorité des sujets exposés demeurent asymptomatiques. Par contre, les mécanismes expliquant le maintient de la tolérance à l'antigène chez ces individus ou le développement de la maladie chez les patients sont inconnus. L'objectif premier de ce projet de doctorat était donc d'examiner le rôle potentiel des cellules T régulatrices (Trég) dans le contrôle de la réponse immune dans l'alvéolite chez la souris et chez l'humain. Chez la souris, nos résultats démontrent que, des expositions répétées à une préparation antigénique de SR induisent des Trég capables de supprimer la prolifération de cellules T activées. Des données similaires ont été obtenues chez les sujets asymptomatiques ce qui pourrait expliquer la réponse tolérante retrouvée chez ces individus. Notre modèle murin démontre également qu'une infection virale altère cette tolérance à l'antigène. À la suite d'une infection au virus Sendai, les Trég ne peuvent inhiber la prolifération de cellules T activées et ne contrôlent plus l'inflammation causée par des expositions subséquentes au SR. Des Trég non-fonctionnelles sont également observées chez les patients. Au cours de nos recherches, nous avons remarqué que la stimulation de la réponse immune par un lysat de SR protège contre une infection mortelle au virus Sendai. Nous avons caractérisé cet effet antiviral et démontré qu'une seule instillation d'une préparation antigénique de SR (200 pg) administrée de 24 à 120 heures avant l'infection virale protège efficacement le système pulmonaire en diminuant le nombre de cellules inflammatoires. Cette protection est efficace pendant une semaine. Cette thèse a donc permis de constater que l'inhalation de SR, selon l'historique des expositions et des co-infections, peut soit induire l'alvéolite ou générée une protection efficace contre l'infection virale.

L'infection par le cytomégalovirus humain (HCMV) est une cause majeure de mortalité chez les patients immunodéprimés et représente la première cause d'infection congénitale. HCMV est un virus complexe qui s'est adapté au système immunitaire humain en développant de multiples mécanismes d'évasion. L'infection primaire à HCMV est associée à une réplication virale prolongée avant l'établissement de la latence. Il a été montré que cette intense réplication lors de la phase initiale de l'infection était associée à une épuisement fonctionnel des lymphocytes T CD4 spécifiques du virus. Alors que les anticorps jouent un rôle dans la limitation de la dissémination virale et la prévention de l'infection à HCMV, les réponses des lymphocytes B sont peu caractérisées. Dans le présent travail, nous avons étudié l'impact de l'infection à HCMV sur le phénotype et la fonctionnalité des sous-populations de LB du sang circulant chez une cohorte de femme enceintes avec une primo-infection par HCMV en utilisant comme contrôles des sujets sains séropositifs et séronégatifs pour HCMV ainsi que des femmes enceintes séronégatives. Nous montrons que l'infection primaire par HCMV induit une expansion significative et prolongée de deux sous-populations de LB :les LB mémoires activés (CD27+CD21low) et mémoires atypiques (CD27-CD21low), précédemment décrites lors d'infection chroniques. Les LB mémoires atypiques démontrent des signes d'épuisement fonctionnel comme en témoigne une expression élevée de récepteurs inhibant le BCR et une moindre réponse à la stimulation in vitro mesurée par la production de TNF-α. Les expansions de ces deux sous-populations sont corrélées entre elles et liées à la virémie. Ces résultats contribuent à la compréhension de la régulation des réponses des LB lors d'infections virales, en montrant que l'épuisement fonctionnel de LB, précédemment décrit lors d'infections chroniques, peut également survenir lors d'infections primaires.<p>Dans un deuxième temps, nous avons étudié l'acquisition des réponses B mémoires spécifiques de HCMV dirigées contre la principale glycoprotéine de surface, la glycoprotéine B (gB), et deux polypeptides du tégument. Lors de l'infection primaire par HCMV, la production d'anticorps neutralisant le virus, dirigés contre les glycoprotéines d'enveloppe, est retardée par rapport aux anticorps dirigés contre le tégument qui sont non neutralisant. Nous montrons que le phénotype des LB mémoires spécifiques de gB est différent de celui des LB mémoires spécifiques du tégument. La majorité des LB mémoires spécifiques de gB exprime un phénotype CD27+CD21+ alors que la majorité de ceux du tégument exprime le phénotype CD27+CD21low. Nous montrons par la suite chez des sujets sains que ces deux sous-populations de LB mémoires présentent des différences phénotypiques, au niveau de l'expression de récepteurs liés au "trafficking" cellulaire ainsi qu'au niveau de la fonctionnalité. Les LB mémoires CD21low, contrairement au LB mémoires CD21high, expriment des taux bas des récepteurs CXCR5 et CCR7, qui permettent la migration vers les centres germinatifs, mais des taux élevés de CD11c promouvant la migration vers les tissus périphériques. Après stimulation in vitro, les LB mémoires CD21low vont avoir une capacité de production d'immunoglobulines immédiate mais une réponse proliférative plus faible comparée aux LB mémoires CD21+. Nous démontrons la relevance de cette division des LB mémoires sur base de l'expression du CD21 dans un modèle de vaccination de rappel contre la toxoïde tétanique (TT). Après rappel, nous observons une expansion significative de LB mémoires spécifiques de la TT exprimant un phénotype CD27+CD21lowCXCR5lowCD11chigh. Nous proposons ainsi un nouveau mécanisme de manipulation des réponses humorales par des pathogènes qui se traduit par une limitation de l'induction de réponses B effectrices. Nos travaux permettraient également une meilleure approche des réponses B mémoires physiologiques chez l'homme en proposant une classification des LB mémoires basées sur leur fonctionnalité et leur phénotype.<p><p>Human cytomegalovirus (HCMV) infection is a major cause of mortality in immunocompromised patients and is the first cause of congenital infection worldwide. HCMV is a complex virus that has developed multiples immune evasions mechanisms during its co-evolution with mankind. Although often asymptomatic, primary HCMV infection is associated with an intense and prolonged viral replication. It has been previously shown that this intense viral replication is associated with functional exhaustion of virus-specific CD4+ T cells. Although neutralizing antibodies limits viral dissemination and play a role in the prevention of HCMV infection, B cell responses during HCMV infection have been poorly studied so far.<p>In this work, we have studied the impact of HCMV infection on the phenotype and functionality of peripheral-blood B cell subsets in a cohort of pregnant women with a primary HCMV infection. Controls were healthy seronegative and seropositive HCMV donors and HCMV seronegative pregnant women. We show that primary HCMV infection induces a significant and prolonged expansion of two B-cell subsets, previously described in chronic infections :activated memory B cells (MBC) (CD27+CD21low) and atypical MBC (CD27-CD21low). Atypical MBC display signs of functional exhaustion with increased expression of inhibitory receptors and a lower response to in vitro stimulation as assessed by TNF-α production. Expansion of these two subsets are correlated and higher in subjects with detectable viremia. These results contribute to the understanding of the regulation of B cell responses during viral infections and indicate that B cell exhaustion, previously described during chronic infections, can be observed in primary infection.<p>Next, we have characterized the acquisition of HCMV-specific B cell responses directed against envelope glycoprotein B (gB) and two tegument polypeptides (pp150 and pp52). During primary HCMV infection, the production of neutralizing antibodies targeting envelope glycoproteins is delayed when compared to non-neutralizing anti-tegument antibodies. We show that gB and tegument-specific MBC have distinct phenotype during primary HCMV infection. The majority of gB-specific MBC have a CD27+CD21+ phenotype while the majority of tegument-specific MBC have a CD27+CD21low phenotype. We show that CD27+CD21+ and CD27+CD21low MBC express different pattern of chemokine receptors pattern but also have distinct functionality. CD27+CD21low MBC, on the contrary to CD27+CD21+ MBC, express low levels of CXCR5 and CCR7 that favor migration to lymph nodes and germinal centers but express high levels of CD11c that promotes migration to inflammatory tissues.<p>In vitro stimulation of sorted subsets of healthy individuals indicates that CD27+CD21low MBC have higher capacity of immediate immunoglobulin production but a lower proliferative potential as compared to CD27+CD21+ MBC. We further show the relevance of a division of MBC subsets based on CD21 expression in a model of TT booster immunization. Following booster immunization, a significant expansion of TT-specific MBC expressing the phenotype CD27+CD21lowCXCR5lowCD11chigh is observed. <p>We propose that HCMV manipulates the host humoral response by limiting the induction of gB-specific CD27+CD21low "effector" MBC. Our work also indicates that human MBC physiological responses should be studied according to their respective phenotype and functions.<p> / Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished