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Étude des mécanismes de régulation génique stade-spécifique chez le parasite protozoaire leishmania

McNicoll, François 11 April 2018 (has links)
Le parasite protozoaire Leishmania est transmis à l'homme par la piqûre de la mouche des sables. Suite à son injection, Leishmania est ingéré par une cellule du système immunitaire, le macrophage, dans laquelle il se différencie de la forme promastigote à la forme amastigote. Cette différenciation est essentielle à la survie du parasite dans l'environnement hostile que constitue la cellule du macrophage. Bien que certaines stratégies de survie du parasite aient été décrites, les protéines qui en sont responsables n'ont pas encore été identifiées. L'identification des protéines exprimées spécifiquement au stade amastigote (intracellulaire), ainsi que la compréhension des mécanismes contrôlant leur expression, pourraient permettre de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques et/ou vaccinales contre ce parasite. Les objectifs de cette thèse étaient de (i) identifier un grand nombre de protéines exprimées spécifiquement au stade intracellulaire chez Leishmania (ii) obtenir une meilleure vue d'ensemble de la régulation génique chez ce parasite (iii) caractériser le mécanisme de contrôle de la traduction stade-spécifique d'une grande famille de protéines, les amastines, qui sont potentiellement impliquées dans la survie intracellulaire du parasite. Une approche protéomique a d'abord permis d'identifier un grand nombre de protéines exprimées spécifiquement dans l'un ou l'autre des deux stades du parasite. Par la suite, une étude transcriptomique a été appliquée aux gènes codant pour les protéines identifiées afin de déterminer à quel(s) niveau(x) est exercé le contrôle de leur expression. Les résultats obtenus suggèrent que la régulation aux niveaux traductionnel et post-traductionnel joue un rôle important dans l'expression génique stade-spécifique chez ce parasite. Les travaux effectués au cours de cette thèse ont aussi permis de mieux caractériser le mécanisme de contrôle de la traduction stade-spécifique des protéines amastines. Nous avons démontré que des éléments distincts en 3' de la région codante étaient responsables de la stabilité et de la traduction des transcrits de l'amastine. Nous avons aussi démontré que ces deux mécanismes de régulation étaient activés par des stimuli différents au cours du stade intracellulaire. De plus, nous avons démontré que la région 3' responsable de la traduction stade-spécifique se compose de deux éléments cis indépendants. Une protéine d'environ 22 kDa se liant spécifiquement à l'un de ces éléments a été détecté. / Leishmania parasites alternate between two major developmental stages: extracellular flagellated promastigotes in the alimentary tract of the sandfly vector and intracellular amastigotes residing in macrophage phagolysosomes of the mammalian host. The cytodifferentiation of the promastigote into the amastigote form is characterized by multiple morphological and biochemical changes, which are essential for parasite survival and proliferation within the hostile environment of the phagolysosome. Although several survival strategies of the parasite have been described, few proteins responsible for its intracellular survival have been identified. Identification of proteins expressed specifically in the amastigote (intracellular) stage, as well as comprehension of the mechanisms controlling their expression, could allow development of new strategies of prevention and/or therapies against this parasite. The objectives of this thesis are (i) to identify a large number of proteins expressed specifically in the intracellular stage of Leishmania (ii) to obtain a better global view of gene regulation in this parasite (iii) to characterize the mechanism of stage-specific translational control of a large protein family, the amastins, which are potentially involved in the intracellular survival of the parasite. A proteomic approach first allowed the identification of a large number of differentially expressed proteins in Leishmania. A transcriptomic study was then applied to the genes encoding the proteins identified in order to détermine which level(s) of gene expression is (are) controlled. Our results suggest that translational and post-translational regulatory mechanisms play an important role in stage-specific gene expression in this parasite. The work presented in this thesis also allowed to better characterize the mechanism of stagespecific translational control of the amastin proteins. Our results demonstrated that distinct elements regulate stability and translation of the amastin transcript in response to distinct stimuli encountered during the parasite intracellular stage. We also better characterized the regulatory region responsible for stage-specific translational control and showed that it was composed of two independent m-acting elements. A protein of 22 kDa specifically bound to one of these elements was detected
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Characterization of a new large family of extinct short retroposons in the protozoan parasite Leishmania and their role in post-transcriptional regulation of gene expression

Müller, Michaela Beatrice January 2009 (has links)
Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2009-2010 / Les leishmanioses se caractérisent par divers symptômes allant de lésions cutanées guérissant spontanément, causées surtout par L. major, . à des infections viscérales potentiellement mortelles causées par le complexe L. donovani/L. infantum. Malgré des génomes presque identiques, des analyses comparatives sur biopuces ont révélé d'importantes différences d'expression génique entre l~s deux stades de vie, promastigotes et amastigotes chez ces deux espèces, ce qui pourrait contribuer aux différences dans les manifestations cliniques. Chez Leishmania, le contrôle de l'expression génique s' effectue au niveau posttranscriptionnel et implique surtout des séquences cis régulatrices situées dans les séquences 3' non-traduites (3 'UTRs) des transcrits. Jusqu'à maintenant, quelques séquences régulatrices seulement ont été caractérisées et les mécanismes contrôlant l'expression génique entre les différents stades et différentes espèces de Leishmania sont peu connus. Ce projet visait à mieux comprendre les voies exploitées par Leishmania pour pallier au manque .de contrôle transcriptionnel et contrôler globalement l'expression génique afin de s'adapter à ses différents environnements. Nous avons identifié deux nouvelles grandes familles de courts rétroposons éteints nommées SIDER1 (Short Interspersed DEgenerated Retroposons; 785 copies) et SIDER2 (1 073 copies), situés presqu'exclusivement dans les régions 3'UTRs. Nous avons caractérisé la famille SIDER2 et démontré qu'elle réprime l'expression génique en déstabilisant spécifiquement les transcrits portant ces éléments. La dégradation rapide des transcrits instables contenant un élément SIDER2 est amorcée par un clivage endonucléolytique séquence-spécifique sans raccourcissement préalable de la séquence poly(A). Le clivage se produit dans une région riche en C d'environ 20 nt) au début de la seconde séquence signature de 79 nt, qui est hautement conservée parmi les SIDER2 et essentielle pour l'instabilité de l'ARNm. Nous suggérons -l'hypothèse que Leishmania exploite les SIDER2 pour réprimer de manière coordonnée l'expression des transcrits devant être faiblement exprimés. L'effet répressif de SIDER2 est bloqué chez les amastigotes de L. infantum, possiblement pour produire une quantité suffisante de certains ARNm ou protéines. Cette inactivation sélective des SIDER2 chez L. infantum contribue aux différences d'expression génique chez les différentes espèces et différents stades de Leishmania. À notre connaissance, ceci est le premier exemple chez les eucaryotes d'une famille entière d' éléments mobiles domestiqués pour participer au contrôle posttranscriptionnel de l'expression génique.
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Études protéomiques chez le parasite protozoaire Leishmania

Brotherton, Marie-Christine January 2013 (has links)
Les protozoaires du genre Leishmania sont responsables de différentes pathologies présentant des taux importants de morbidité et de mortalité à travers le monde. En l'absence de vaccin efficace, le contrôle de ces infections repose sur l'utilisation d'agents chimiothérapeutiques. Ce parasite étant dépourvu de promoteurs classiques, la régulation génique repose essentiellement sur des mécanismes post-transcriptionnels, ce qui rend l'étude des protéines primordiale. Toutefois, les protéines peu abondantes sont souvent sous-représentées avec les méthodes protéomiques classiques et le fractionnement protéique est donc à privilégier. L'étude des protéines exprimées de manière préférentielle chez l'un des deux stades de vie, soit les promastigotes présents chez l'insecte-vecteur et les amastigotes présents dans les macrophages de l'hôte mammifère infecté, peut mener à l'élaboration de vaccins et/ou de nouveaux traitements. Il est également essentiel de mieux caractériser les mécanismes de résistance aux médicaments actuels. Les objectifs de cette thèse étaient i) de mieux caractériser le protéome des deux stades de vie du parasite en étudiant les protéines basiques, membranaires et de haut poids moléculaire par la mise au point de méthodes protéomiques innovantes et ii) d'étudier les mécanismes de résistance de Leishmania à l'antimoine trivalent et l'amphotéricine B par protéomique quantitative et par séquençage à haut débit du génome complet. Les travaux effectués dans le cadre de cette thèse ont permis l'élaboration de méthodes de fractionnement protéique permettant une meilleure représentation des protéines peu abondantes chez Leishmania. Les analyses protéomiques subséquentes des protéines basiques, membranaires et de haut poids moléculaire ont permis l'identification de nombreuses protéines impliquées dans la différenciation entre les deux formes de vie du parasite. Des études de protéomique quantitative ont également permis de découvrir des protéines impliquées dans la résistance à l'antimoine trivalent et à l'amphotéricine B. De plus, l'aneuploïdie a également été impliquée dans la résistance à ces deux molécules. La formation d'amplicons circulaires extrachromosomiques a été observée en lien avec la résistance à l'antimoine trivalent. Finalement, deux nouvelles mutations ponctuelles ont été impliquées dans la résistance aux médicaments chez Leishmania, soit LinJ.33.1810-E629K dans le cas de l'antimoine trivalent et LinJ.13.1590-G433S dans le cas de l'amphotéricine B.
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Rôles de la recombinaison homologue dans la résistance aux drogues chez le parasite "Leishmania"

Genois, Marie-Michelle 23 April 2018 (has links)
Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2015-2016 / Bien que l’on attribue généralement un effet néfaste à l’instabilité génomique, pour le parasite Leishmania, elle s’avère pourtant bénéfique. De façon étonnante, ce protozoaire possède la capacité de remanier le nombre de copies de ses gènes pour s’adapter à son environnement et résister aux drogues utilisées contre lui. La présence de séquences répétées identiques près des gènes essentiels à sa survie permet une recombinaison homologue (RH) efficace et entraîne subséquemment la formation d’une copie extrachromosomique supplémentaire du gène ciblé. Ce phénomène de réarrangement génique induit la formation d’amplicons circulaires ou linéaires et est, entre autres, responsable de la résistance aux agents thérapeutiques. À l’heure actuelle, les enzymes impliquées dans ce processus sont peu connues et l’émergence d’un nombre croissant de cas d’infections réfractaires aux traitements favorise l’étude des protéines médiant la RH dans des conditions de résistance. Il a été récemment montré que la formation d’amplicons circulaires est compromise en l’absence du gène LiRad51, mais n’est toutefois pas abolie. Cette observation suggère l’implication d’autres acteurs dans ce processus, alors que le mécanisme par lequel les amplicons linéaires sont formés demeure inconnu. Cette thèse présente la caractérisation biochimique et cellulaire des protéines clés de la RH impliquées dans l’amplification génique chez le parasite Leishmania infantum. Plus précisément, le rôle de LiBrca2, en tant que médiateur de LiRad51, est tout d'abord démontré en raison de son implication essentielle dans la localisation nucléaire de LiRad51 et dans la stimulation d’invasion de brins effectuée par la recombinase. De façon similaire, les paralogues de LiRad51 peuvent, possiblement grâce à leur capacité de lier et d’apparier de l’ADN, eux aussi, stimuler LiRad51 pour l’invasion d’un ADN simple-brin dans un duplex homologue. L’inactivation génique pour l’un d’entre eux (LiRad51-4) a montré un rôle considérable sur l'amplification circulaire, malgré le fait qu’aucune activité d’invasion n’a pu être observée en l’absence de LiRad51. Enfin, en accord avec son rôle bien établi chez l’humain, cette étude confirme que la protéine LiMre11 possède une activité exonucléase et qu’elle serait impliquée dans la production d’amplicons linéaires. Ces résultats mettent en évidence le potentiel thérapeutique des protéines de la réparation de l’ADN, domaine de recherche prometteur pour mieux lutter contre la leishmaniose. / Genomic instability is usually known as a harmful hallmark, although in the parasite Leishmania this represents a beneficial feature. Surprisingly, this protozoan takes advantage of its ability to reorganize its genome for adapting itself to different environments as well as for drug resistance. In fact, the presence of identical repeats near essential genes allows homologous recombination (HR) between them, and subsequently causes the formation of an additional extrachromosomally copy of the targeted gene. This phenomenon of gene rearrangement induces circular or linear amplicons which leads to drug resistance. However, little is known about the enzymes involved in this process. In addition, the increasing number of infection cases refractory to treatment promotes the study of proteins mediating HR in these circumstances. It has been shown recently by gene inactivation that LiRad51 recombinase plays an important role in circular amplicon formation but was not essential. This observation suggested the presence of other players involved in this process while the mechanism by which linear amplicons are formed is still unknown. This thesis presents biochemical and cellular characterization of key HR proteins involved in extrachromosomal DNA amplification. We first determine the role of LiBrca2 as a mediator of LiRad51. In particular, LiBrca2 is involved in LiRad51 nuclear localisation and stimulates the homology search performed by the recombinase. Secondly, we show evidence that the LiRad51 paralogs help LiRad51 to promote HR through their capacity to bind and anneal DNA. Similary to LiBrca2, they can stimulate LiRad51 to invade a resected DNA double-strand break in an undamaged template to form a D-loop structure. However, they cannot perform this key step on their own. We succeed to inactivate one paralog (LiRad51-4) and provide insights on circular gene amplification. Finally, we show that LiMre11 harbors both DNA binding and exonuclease activities while inactivation of this gene led to a reduction of linear amplicon formation after drug selection. These results highlight a novel LiMre11-dependent pathway used by Leishmania to amplify stochastically portions of its genome. The relevance of DNA repair for drug resistance and its potential as a drug target represent a promising area of research for future treatments of leishmaniasis.
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Caractérisation des mécanismes de réarrangements géniques chez le parasite Leishmania résistant aux drogues

Laffitte, Marie-Claude 23 April 2018 (has links)
Le parasite Leishmania est un protozoaire de l’ordre des Kinetoplastidae et de la famille des Trypanosomatidae, responsable de maladies appelées leishmanioses. En tant qu’eucaryote unicellulaire, Leishmania possède de nombreux mécanismes d’adaptation aux stress environnementaux. En effet, plusieurs mécanismes de résistance peuvent être développés par le parasite pour répondre au stress et sont basés sur la modulation du génome, comme l’amplification génique ou l’introduction de mutations. De fait, l’étude de l’intégrité génomique et des mécanismes sous-jacents l’acquisition de la résistance sont des éléments clés de la compréhension du fonctionnement de ce parasite. L’amplification génique est rendue possible par la présence de nombreuses séquences répétées distribuées à travers le génome de Leishmania et qui permettent la formation d’amplicons circulaires et linéaires contenant des gènes essentiels à l’acquisition de la résistance. Les mécanismes sous-jacents la formation des amplicons restent encore à élucider mais les protéines de réparation de l’ADN semblent jouer un rôle majeur dans l’amplification génique. Dans le laboratoire, il a été démontré que l’amplification circulaire reposait essentiellement sur la protéine de réparation de l’ADN RAD51. Cependant, les acteurs impliqués dans la formation d’amplicon linéaire restaient inconnus. Les travaux de cette thèse ont permis de caractériser les fonctions de la protéine MRE11 chez Leishmania, protéine majeur de la réparation de l’ADN par recombinaison homologue, et qui possède une activité de liaison à l’ADN ainsi qu’une activité nucléase. MRE11 semble impliquée dans l’amplification linéaire puisque son inactivation conduit à une diminution du nombre d’amplicons linéaires dans la cellule. De plus, inhiber l’activité nucléase de MRE11 conduit à une augmentation de l’amplification circulaire, suggérant ainsi un rôle prépondérant de cette activité nucléase dans la formation d’amplicons. Cette étude a également permis d’étudier l’implication des protéines de réparation de l’ADN dans le maintien de l’intégrité du génome. / Nous avons pu établir un lien entre MRE11 et RAD50, deux protéines agissant au sein d’un même complexe MRN (MRE11-RAD50-NBS1), et l’instabilité génomique. En effet, l’inactivation de MRE11 et RAD50 a conduit à des réarrangements chromosomiques qui semblent être survenus par micro-homologie. Ces travaux ont donc permis de mettre en lumière qu’en l’absence des protéines majeures de la recombinaison homologue, un mécanisme de réparation par micro-homologie indépendant de MRE11 se met en place dans la cellule. De plus, l’inactivation du gène RAD50 dans une souche sauvage s’est révélée impossible alors qu’elle l’était dans une souche préalablement inactivée pour MRE11, suggérant une certaine hiérarchie dans le complexe MRN. Cette thèse présente également l’étude de l’acquisition de mutations ponctuelles dans le gène du transporteur de miltéfosine qui conduit à la résistance des parasites à cette drogue. La technologie de séquençage à profondeur élevée (« deep-sequencing ») nous a permis de séquencer ce gène à différents stades intermédiaires de la résistance, afin de déterminer la fréquence d’acquisition et la stabilité de ces mutations. Nous avons pu observer que les mutations ponctuelles dans le gène du transporteur de miltéfosine ne sont pas présentes dans les premiers stades de la résistance mais acquises à des concentrations plus élevées. L’analyse du gène a également démontré un plus grand nombre de mutations au fur et à mesure que la pression de sélection s’intensifie ainsi qu’une certaine stabilité des mutations après retrait de la pression de drogue, laissant entrevoir un maintien de la résistance. Ces résultats mettent en évidence l’implication des protéines de réparation de l’ADN dans la stabilité génomique chez Leishmania, mais surtout un rôle dans l’amplification extra-chromosomique liée à la résistance. L’utilisation des nouvelles technologies de séquençage nous a également permis d’étudier la dynamique d’acquisition de mutations ponctuelles impliquées dans la résistance.
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Caractérisation de la famille des transporteurs de folate et de la bioptérine (FBT) chez le parasite protozoaire Leishmania

Ahmed Ouameur, Amin 18 April 2018 (has links)
La leishmaniose est une maladie causée par des parasites appartenant au genre Leishmania. Elle est transmise à l'homme par la piqûre d'un insecte vecteur et est endémique dans plus de 88 pays où approximativement 350 millions de personnes vivent dans les zones à risque. À ce jour, aucun vaccin efficace n'est encore disponible pour prévenir la leishmaniose et le traitement repose actuellement sur la chimiothérapie. Les composés utilisés pour traiter la maladie sont limités et la plupart d'entre eux sont associés à des problèmes comme le coût élevé du traitement, les effets secondaires et l'émergence de souches de parasites résistantes aux médicaments. L'identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour le développement de molécules anti-Leishmania s'avère donc urgente. La voie métabolique de l'acide folique constitue un champ thérapeutique potentiel d'autant plus que la découverte chez Leishmania de 13 protéines appartenant à la famille de transporteurs de folate et de la bioptérine (FBT) permet d'envisager la possibilité de les exploiter dans un but thérapeutique. Mis à part trois (FT1, FT5 et BT1), les fonctions des autres protéines de la famille FBT sont inconnues et mon projet de doctorat avait comme objectif principal de caractériser cette famille et de tenter de trouver des fonctions à ces transporteurs. Les objectifs spécifiques de cette thèse étaient 1) de déterminer le profil d'expression des gènes de la famille FBT aux différentes phases de croissance chez les deux stades de vie du parasite et chez des mutants résistants au methotrexate (MTX); 2) de caractériser la fonction d'un nouveau membre de la famille FBT qui était réarrangé chez des mutants résistants à la sinéfungine (SNF); et 3) d'étudier la localisation subcellulaire des différents membres de la famille FBT et de quelques protéines de la famille des transporteurs mitochondriaux (MCF) dans le but d'identifier et de caractériser les transporteurs de donneurs d'unités monocarbonées, localisés au niveau de la membrane de la mitochondrie. L'analyse du profil d'expression de la famille FBT a permis de montrer que plusieurs gènes FBT sont exprimés préférentiellement en phase stationnaire de croissance, tandis que seul FT1, le principal transporteur de folate, est exprimé préférentiellement en Ill phase logarithmique de croissance ce qui est en accord avec la forte accumulation de folate durant cette phase de croissance. Aussi, il semblerait que les niveaux d'expression de FT1 dépendent aussi des niveaux de folate dans le milieu de culture. De plus, cette analyse a permis d'identifier les mécanismes de recombinaison génique impliqués dans l'inactivation de FT1 chez les souches hautement résistantes au MTX. Par ailleurs, la sélection des mutants résistants au MTX et à la SNF a permis de caractériser un nouveau membre (AdoMetTl) de la famille FBT. L'AdoMetTl correspond au transporteur de haute affinité pour la S-adénosylméthionine. Finalement, les études de localisation protéique ont permis de déterminer la localisation intracellulaire de trois protéines FBT ainsi que la localisation mitochondriale des protéines de la MCF. transmise à l'homme par la piqûre d'un insecte vecteur et est endémique dans plus de 88 pays où approximativement 350 millions de personnes vivent dans les zones à risque. À ce jour, aucun vaccin efficace n'est encore disponible pour prévenir la leishmaniose et le traitement repose actuellement sur la chimiothérapie. Les composés utilisés pour traiter la maladie sont limités et la plupart d'entre eux sont associés à des problèmes comme le coût élevé du traitement, les effets secondaires et l'émergence de souches de parasites résistantes aux médicaments. L'identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour le développement de molécules anti-Leishmania s'avère donc urgente. La voie métabolique de l'acide folique constitue un champ thérapeutique potentiel d'autant plus que la découverte chez Leishmania de 13 protéines appartenant à la famille de transporteurs de folate et de la bioptérine (FBT) permet d'envisager la possibilité de les exploiter dans un but thérapeutique. Mis à part trois (FT1, FT5 et BT1), les fonctions des autres protéines de la famille FBT sont inconnues et mon projet de doctorat avait comme objectif principal de caractériser cette famille et de tenter de trouver des fonctions à ces transporteurs. Les objectifs spécifiques de cette thèse étaient 1) de déterminer le profil d'expression des gènes de la famille FBT aux différentes phases de croissance chez les deux stades de vie du parasite et chez des mutants résistants au methotrexate (MTX); 2) de caractériser la fonction d'un nouveau membre de la famille FBT qui était réarrangé chez des mutants résistants à la sinéfungine (SNF); et 3) d'étudier la localisation subcellulaire des différents membres de la famille FBT et de quelques protéines de la famille des transporteurs mitochondriaux (MCF) dans le but d'identifier et de caractériser les transporteurs de donneurs d'unités monocarbonées, localisés au niveau de la membrane de la mitochondrie. L'analyse du profil d'expression de la famille FBT a permis de montrer que plusieurs gènes FBT sont exprimés préférentiellement en phase stationnaire de croissance, tandis que seul FT1, le principal transporteur de folate, est exprimé préférentiellement en phase logarithmique de croissance ce qui est en accord avec la forte accumulation de folate durant cette phase de croissance. Aussi, il semblerait que les niveaux d'expression de FT1 dépendent aussi des niveaux de folate dans le milieu de culture. De plus, cette analyse a permis d'identifier les mécanismes de recombinaison génique impliqués dans l'inactivation de FT1 chez les souches hautement résistantes au MTX. Par ailleurs, la sélection des mutants résistants au MTX et à la SNF a permis de caractériser un nouveau membre (AdoMetTl) de la famille FBT. L'AdoMetTl correspond au transporteur de haute affinité pour la S-adénosylméthionine. Finalement, les études de localisation protéique ont permis de déterminer la localisation intracellulaire de trois protéines FBT ainsi que la localisation mitochondriale des protéines de la MCF.
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Étude globale des gènes différemment exprimés entre les différents stades de vie et espèces du parasite leishmania à l'aide d'approches génomiques

Rochette, Annie 13 April 2018 (has links)
Le parasite protozoaire Leishmania possède un cycle de vie dimorphique; le stade promastigote présent chez l'insecte vecteur et le stade amastigote présent dans les phagolysosomes des macrophages de l'hôte vertébré. L'étude des gènes exprimés préférentiellement ou spécifiquement au stade intracellulaire pourrait nous en apprendre d'avantage sur les mécanismes de survie du parasite à l'intérieur des macrophages. Parmi les gènes exprimés préférentiellement au stade amastigote nous avons identifié la famille des amastines qui codent pour des protéines de surface. Cette famille est présente chez plusieurs espèces de Leishmania où on retrouve en moyenne 50 membres. Toutes les amastines possèdent une séquence signature de 11 acides aminés qui leur est unique. La majorité des amastines sont plus abondantes au stade amastigote et cette régulation implique des séquences situées en 3'UTR. La comparaison des génomes de deux espèces de Leishmania causant des pathologies distinctes, soit L. major et L. infantum a révélé une grande conservation au niveau de la synténie du génome. Cela suggère que ce qui est responsable de chaque pathologie se situe au niveau des quelques gènes uniques à chaque espèce ou encore au niveau de l'expression différentielle des gènes communs. Pour identifier de nouveaux gènes exprimés au stade intracellulaire et également identifier des gènes impliqués dans le tropisme, une analyse du transcriptome entier a été effectuée à l'aide de la technologie de puces à ADN. Lors de cette étude, où des parasites intracellulaires ont été utilisés, les résultats ont montré que chez L. infantum, 7.1 % des gènes étaient différemment exprimés entre les deux stades tandis que 9.3% l'étaient chez L. major. Parmi ces gènes modulés très peu (=10%) sont communs aux deux espèces. Une expérience indépendante avec les puces a été réalisée avec des parasites axéniques de L. infantum, pour comparer les deux stades de développement mais aussi pour évaluer la pertinence du système de culture axénique pour les amastigotes par rapport aux amastigotes obtenus de macrophages ou d'animaux infectés. Cette expérience a révélé que 12.8% des gènes étaient modulés entre les deux stades et que parmi ces gènes très peu étaient en commun avec ceux identifiés chez les amastigotes intracellulaires.
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Étude des éléments régulateurs « cis » et « trans » impliqués dans la stabilité du transcrit de l'amastine au stade intracellulaire chez « Leishmania »

Dupé, Aurélien 19 April 2018 (has links)
Le genre Leishmania regroupe des parasites protozoaires transmis par piqûre d’un insecte vecteur et qui sont responsables des leishmanioses. Le cycle de Leishmania alterne entre promastigotes dans l’appareil digestif de l’insecte et amastigotes dans les phagolysosomes des macrophages d’un hôte mammifère. Les delta-amastines sont une famille de protéines membranaires qui jouent potentiellement un rôle dans la virulence. L’expression exclusivement au stade intracellulaire de l’un de ces gènes est permise par une accumulation préférentielle de l’ARNm et la stimulation de la traduction, toutes deux chez les amastigotes. L’objectif de cette thèse est de caractériser les mécanismes permettant l’expression différentielle de l’ARNm de la delta-amastine. Ces organismes ont divergé rapidement des autres eucaryotes, ce qui engendre plusieurs différences fonctionnelles, dont notamment l’absence de régulation transcriptionnelle. Notre hypothèse est que la présence d’une région riche en uridines (URE) dans l’extrémité 3’ non traduite (3’UTR) du transcrit peut être impliquée dans la dégradation de l’ARNm. Nous démontrons que le URE est responsable d’une dégradation du transcrit au stade promastigote, par un phénomène indépendant de la déadénylation. Nous avons identifié une protéine à domaine Alba, LiAlba20, liant l’ARNm de la delta-amastine dans une région proche de l’URE. La suppression de cette protéine réduit l’accumulation du transcrit au stade amastigote. Ainsi, deux mécanismes complémentaires sont responsables de l’expression différentielle de ce transcrit. Le génome de Leishmania code pour une seconde protéine à domaine Alba, LiAlba13. Ces protéines interagissent ensemble, mais LiAlba13 n’affecte pas l’abondance de l’ARNm de la delta-amastine. Les protéines Alba ont une évolution exceptionnelle puisqu’elles stabilisent l’ADN chez les Archaea, et sont retrouvées dans les complexes RNase P/MRP chez les eucaryotes supérieurs. Nos résultats montrent qu’elles régulent l’expression de protéines spécifiques du stade amastigote, ce qui concorde avec les récents travaux chez d’autres parasites protozoaires. Ces protéines sont cytoplasmiques dans les deux stades de développement. Cependant, pendant la différenciation, elles s’accumulent dans le flagelle et le nucléole, respectivement décrits comme senseur et coordinateur de la réponse au stress. Nos travaux suggèrent donc l’implication du flagelle et du nucléole dans la coordination de la régulation de facteurs de virulence pendant la différenciation du parasite. / The Leishmania genus encompasses protozoan parasites which are transmitted through the bite of an insect vector and are responsible for leishmaniasis. The Leishmania life cycle alternates between promastigote forms within the gut of the insect vector and amastigotes which multiply in the phagolysosomal vacuoles of the mammalian host’s macrophages. Delta-amastins are part of a multigenic family of membrane proteins that potentially act in parasite virulence. One of the delta-amastin's exclusive expression in the intracellular stage is mediated by mRNA accumulation and translation stimulation, both taking place in the amastigote stage. The aim of this thesis is to characterize the mechanisms implicated in the differential expression of delta-amastin mRNA. Leishmania splits early in evolution from other eukaryotes and this split correlates with many functional differences, including the absence of transcriptional control of gene expression. Our hypothesis is that the presence of a uridine-rich element (URE) within the 3’ untranslated region (3’UTR) of the transcript might be implicated in an mRNA decay mechanism. We reveal that the URE is responsible for a fast mRNA decay only in the promastigote stage, performed by an unusual deadenylation-independent pathway. We next identified an Alba domain protein, LiAlba20, which binds to the delta-amastin mRNA in a region flanking the URE. Depletion of this protein leads to a reduced mRNA accumulation in the amastigote stage specifically. Therefore, we identified two complementary mechanisms taking part in the transcript’s differential expression. The Leishmania genome encodes a second Alba domain protein, LiAlba13. These proteins interact together, but LiAlba13 does not affect the delta-amastin mRNA level during the parasite life cycle. Alba domain proteins have a remarkable evolution, being involved in DNA stabilization in Archaea and subunits of the RNAses P/MRP complexes in higher eukaryotes. In addition, our data show that these proteins regulate stage-specific protein expression, which is in agreement with recent works in other protozoan parasites. Alba domain proteins are constitutively expressed in the cytoplasm of both parasite life cycle stages. Nevertheless, during the differentiation, those proteins accumulate in flagellar and nucleolus compartments, respectively described as sensor and stress response coordinators in higher eukaryotes. Our work suggests that the flagellum is implicated in the coordination of stage-specific transcript expression in response to stress in Leishmania.
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Bio-informatique pour la génomique et le diagnostic des maladies infectieuses

Raymond, Frédéric January 2011 (has links)
Le séquençage du génome d’un microorganisme est un jalon important dans l’étude de sa biologie. Quel que soit cet organisme, les outils bio-informatiques nécessaires pour comprendre son génome et le comparer aux autres génomes séquencés seront similaires. Dans cette thèse, l’ADN génomique de parasites et de virus est mis à profit afin de mieux comprendre ces microorganismes. Dans un premier temps, le parasite protozoaire Leishmania est étudié par transcriptomique et par génomique comparative afin de mieux comprendre son infectivité, sa résistance aux antiparasitaires et son mode de vie dimorphique. Ce parasite alterne entre le stade flagellé (promastigote) et le stade intracellulaire aflagellé (amastigote). Afin de faciliter l’analyse par biopuces du transcriptome de Leishmania, un système de gestion et d’analyse de données de biopuces a été conçu. Quatre études utilisant ce système sont présentées sommairement et leurs implications sont discutées. Deuxièmement, le génome de l’espèce Leishmania (sauroleishmania) tarentolae, qui n’est pas pathogène pour l’humain, a été séquencé et comparé à trois espèces infectant l’homme. Cette étude a montré que, même si peu de gènes différencient les espèces, L. tarentolae possède moins de gènes associés au stade amastigote que les autres espèces. Deux familles de gènes ont été trouvées en nombre de copies élevées chez L. tarentolae : GP63 et PSA31C. Ces résultats permettent une meilleure compréhension de la biologie de L. tarentolae et de la virulence des autres espèces de Leishmania. Dans un deuxième temps, les séquences des génomes de virus respiratoires disponibles dans les bases de données publiques ont été analysées pour créer un test diagnostique permettant la détection et l’identification de 25 types de virus respiratoires, dont la grippe A (H1N1) responsable de la pandémie de 2009 et la grippe aviaire A (H5N1). Le test a été validé avec des échantillons de laboratoire et avec des échantillons cliniques. Même si l’étude du parasite Leishmania était indépendante de celle des virus respiratoires, les approches utilisées pour ces deux projets étaient similaires. Ainsi, la bio-informatique est un outil essentiel en microbiologie, car elle est indispensable pour résoudre des problèmes de diverses natures chez des organismes différents. / Sequencing a genome is a milestone in the study of an organism. Bioinformatics allow both to better understand single organisms and to compare them to related species through comparative genomics. This thesis centers on the idea that genome sequence of parasites and viruses can be used in various ways to better understand these microorganisms. Transcriptomics and comparative genomics were used to study the protozoan parasite Leishmania in order to better understand its virulence, its resistance to antiparasitic drugs, and its dimorphic life-cycle, which includes a flagellated free form named promastigote and an aflagellate intracellular form named amastigote. In order to study gene expression in Leishmania, an integrated management and analysis system was created, along with protocols designed for Leishmania microarrays analysis. Four studies using this system are briefly described. In another study, the genome of Leishmania (sauroleishmania) tarentolae, a lizard parasite, was sequenced and compared to human pathogenic Leishmania species. This study showed little difference between the Leishmania species, although L. tarentolae seems to contain less genes associated to the amastigote life-cycle, including the amastin gene. Two gene families were highly expanded in L. tarentolae: the surface metalloprotease GP63 and the promastigote antigen protein PSA31C. These results provide a better understanding of L. tarentolae biology and give insights on the genes involved in virulence in pathogenic Leishmania species. The second part of this thesis concerns the creation of a molecular diagnostic assay for the detection and identification of 25 respiratory virus types, including the influenza A/H1N1 pandemic strain and the avian influenza A/H5N1 strain. This assay was created by analyzing genome sequences available from public repositories and it was afterwards tested on laboratory and clinical virus strains. Although Leishmania and respiratory viruses are distantly related, the approaches used in both projects were similar. Thus, bioinformatics is an essential and ubiquitous science that allows to solve problems in different areas (“omics”) of biology.
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Caractérisation des mutations du virus Herpès simplex impliquées dans la résistance aux antiviraux

Bestman-Smith, Julie. 11 April 2018 (has links)
La résistance du virus de l’herpès simplex (VHS) aux antiviraux est un problème courant chez les individus immunosupprimés. Des mutations au sein du gène de la thymidine kinase (TK) virale sont principalement à l’origine de la résistance au traitement de première ligne, i.e. les analogues des nucléosides. La cible ultime de tous les antiviraux anti-herpétique demeure cependant l’ADN polymérase (pol) virale. Ces deux gènes viraux (TK et ADN pol) démontrent un certain degré de polymorphisme génétique et il peut devenir difficile d’identifier avec certitude les mutations responsables de la résistance aux antiviraux. Les travaux présentés dans cette thèse de Doctorat démontrent le développement de nouvelles méthodes afin d’établir un lien entre l’apparition de mutations au niveau de gênes viraux et un phénotype de résistance particulier. Un système d’expression du gène de la TK virale chez le parasite Leishmania et un ensemble de cosmides et de plasmides recombinants permettant de générer des virus ADN pol mutants ont été mis au point. Ces nouvelles stratégies nous ont permis de caractériser les mutations virales impliquées dans la résistance aux antiviraux. / Drug resistant HSV isolates are responsible form substantial morbidity among immunocompromised subjects. The genetic basis for resistance to nucleoside analogs such as acyclovir (ACV) have been mapped to point mutations in the viral thymidine kinase (TK) gene while mutations within the viral DNA pol gene, the main target for all anti-herpetic drug actually available, could lead to a multidrug resistance phenotype. However, the distinction between viral mutations (TK and DNA pol) involved in antiviral resistance or part of viral polymorphism can be difficult to evaluate with current methodologies. OBJECTIVE: The aim of this research project is thus to evaluate the role of particular mutations within the HSV TK and DNA pol gene with regard to drug-resistance patterns and viral fitness, by designing new gene expression systems. METHODS: The protozoan parasite Leishmania stably transfected with a TK expression vector (pSP72αNEOα) was used as an heterologous system to evaluate the role of several different point mutations within the coding region of the TK gene in conferring resistance to nucleoside analogs. Susceptibility of TK-expressing parasites to nucleoside analogs can thus be tested very easily by a simple measurement of the optic density of cultures grown in the presence or in the absence of the drug. Finally, a set of overlapping viral cosmids and plasmids for the rapid generation of recombinant HSV-1 DNA pol mutants have been developed. RESULTS: Expression of the TK gene from ACV-susceptible clinical isolates resulted in Leishmania susceptibility to the antiviral, whereas expression of a TK gene with frameshift mutations or nucleotide substitutions from ACV-resistant isolates gave rise to parasites with high levels of antiviral resistance. Twenty HSV-1 recombinants with single or dual mutations within the DNA pol gene were successfully generated with the cosmid/plasmid based approach. Mutations within the central part of the enzyme’s catalytic domain (regions II and VI) were associated with resistance to ACV, FOS, and ADV, whereas mutations inserted within extremities (δ-region C, I, V, and VII) were mostly related to the replicative activity of the enzyme. CONCLUSION: Such new strategies provide an easy, reliable, and sensitive means of evaluating the functional role of viral mutations which should translate in improved management of drug-resistant HSV infections.

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