Thèses (Ph.D.)--Université de Sherbrooke (Canada), 2001. / Titre de l'écran-titre (visionné le 20 juillet 2006). Publié aussi en version papier.

Thèses (M.Sc.)--Université de Sherbrooke (Canada), 2000. / Titre de l'écran-titre (visionné le 20 juin 2006). Publié aussi en version papier.

Les espèces de *Leishmania* sont des importants pathogènes humains qui affectent la santé de millions de personness à travers le monde. De plus, ces parasites présentent des caractéristiques uniques en matière de régulation de l'expression génique, ce qui en fait un excellent modèle pour étudier les mécanismes de régulation posttranscriptionnelle. Le génome de *Leishmania* abrite des « Short Interspersed DEgenerated Retroposons » (SIDERs), anciennement actifs, représentant la plus grande famille d'éléments répétitifs chez les trypanosomatides. Leur expansion substantielle est un fort indicateur de fonctions biologiques importantes. Cette étude intègre des analyses génomiques, bioinformatiques et transcriptomiques à haut débit pour dévoiler les divers rôles des rétroposons SIDER2 dans l'évolution du génome de *Leishmania* et la régulation d'expression de ses gènes. Nous montrons que les rétroposons du type SIDER2 sont organisés en clusters divergents et sont particulièrement localisés dans des régions non-codantes en 3' des transcrits (3'UTRs), altérant ainsi environ 13 % du transcriptome de *Leishmania*. Les séquences SIDER2 les plus homologues sont généralement positionnées très proche sur le même chromosome. Cette organisation génomique intrigante souligne l'importance de la proximité des SIDER2 dans la structure et dynamique chromosomique ainsi que la co-régulation. Il est intéressant de noter que les transcrits appartenant au même cluster SIDER2 peuvent afficher des niveaux d'expression similaires. Les études de profilage de l'expression à l'échelle du génome soulignent l'association générale des SIDER2 avec une faible expression de l'ARNm. Le lien remarquable entre les rétroposons SIDER2 et la régulation à la baisse de l'expression des gènes soutient leur rôle comme régulateurs majeurs de l'abondance de l'ARNm. Les séquences SIDER2 contribuent également à la diversification du répertoire d'expression des gènes de *Leishmania* car 35 % des transcrits contenant des SIDER2 sont exprimés de manière différentielle au cours du développement du parasite et plusieurs d'entre eux codent pour des facteurs de virulence. Nous avons également identifié des facteurs *trans* s'associant avec certaines séquences SIDER2 et impliqués dans la dégradation des ARNs les contenant. Un de ces facteurs est la protéine Pumilio (PUF) 6. En utilisant le séquençage d'ARN à partir d'une souche génétiquement inactivée pour PUF6 (PUF6 KO) et celui immunoprécipité avec la protéine PUF6 (PUF6 RIP-Seq) par la méthode d'Illumina, nous avons montré que la déplétion de PUF6 conduit à l'accumulation d'environ 10% de transcrits ayant SIDER2 dans leur 3'UTR, soulignant l'importance de cette protéine dans la dégradation de ces ARNm vis son interaction avec d'autres protéines des complexes de dégradation de l'ARN. PUF6 régule également l'expression de plusieurs transcrits exprimés spécifiquement au stade promastigote du parasite, par un mécanisme distinct de celui utilisant les séquences SIDER2, soulignant ainsi son importante contribution dans la régulation post-transcriptionnelle chez *Leishmania*. Enfin, en utilisant la technologie Nanopore pour séquencer directement l'ARN à partir de stades promastigote et amastigote, nous avons pu révèler des événements étendus d'épissage en trans (*trans*-splicing) et de polyadénylation alternative dans le transcriptome du parasite. Cette technologie a également fourni des données transcriptomiques de haute résolution identifiant 1,825 ARN longs non codants (lncRNAs), dont une petite fraction seulement était annotée auparavant. Un nombre significatif de ces lncRNAs est régulé de façon stade-spécifique, soulignant le paysage post-transcriptionnel complexe de *Leishmania*. Ensemble, ces résultats améliorent notre compréhension de la complexité du transcriptome de *Leishmania* au cours de son développement, mettant l'emphase sur le rôle central des rétroposons SIDER2 et de leurs partenaires protéiques dans la régulation de l'abondance de transcrits chez *Leishmania* selon son stade développemental, et fournissant de nouvelles perspectives sur la dynamique transcriptomique de ce parasite. / *Leishmania* species are important human pathogens that affect the health of more than a billion people worldwide. Additionally, these parasites exhibit unique characteristics in the way they regulate gene expression, mostly posttranscriptionally, making them an excellent model for studying mechanisms of posttranscriptional regulation. The *Leishmania* genome harbors formerly active **S**hort **I**nterspersed **DE**generated **R**etroposons (SIDERs), representing the largest family of repetitive elements among trypanosomatids. Their substantial expansion is a strong indicator of important biological functions. This study integrates high-throughput genomic, bioinformatics and transcriptomic analyzes to unveil the diverse roles of SIDER2 retroposons in the evolution of the *Leishmania* genome and the regulation of gene expression. We show that SIDER2 type retroposons are organized in highly divergent clusters and are particularly localized in the 3' non-coding regions of transcripts (3'UTRs), thus altering ~13% of the *Leishmania* transcriptome. The most homologous SIDER2 sequences are generally positioned very close on the same chromosome. This intriguing genomic organization highlights the importance of SIDER2 proximity in chromosomal structure and dynamics, as well as in co-regulation. Interestingly, transcripts belonging to the same SIDER2 cluster can display similar expression levels. Genome-wide expression profiling studies highlight the general association of SIDER2s with low mRNA expression. The remarkable link between SIDER2 retroposons and downregulation of gene expression supports their role as major regulators of mRNA abundance. SIDER2 sequences also contribute to the diversification of the *Leishmania* gene expression repertoire because 35% of SIDER2-containing transcripts are differentially expressed during the parasite development and several of them encode virulence factors. We also identified *trans*-acting factors associating with certain SIDER2 sequences and involved in the degradation of the RNAs containing them. One of these factors is Pumilio protein (PUF) 6. Using sequencing of total RNA from *Leishmania* genetically depleted for PUF6 (PUF6 KO) and PUF6 RNA-immunoprecipitations sequencing using the Illumina technology, we showed that PUF6 depletion leads to the accumulation of approximately 10% of SIDER2-containing transcripts, highlighting the importance of this protein in the degradation of these mRNAs through interactions with other proteins of the RNA degradation machinery. PUF6 also regulates the expression of several transcripts expressed specifically at the promastigote stage of the parasite, by a mechanism distinct from that using SIDER2 sequences, thus highlighting its important contribution in post-transcriptional regulation in *Leishmania*. Finally, using the Nanopore technology to directly sequence RNA from promastigote and amastigote life stages, we showed extensive *trans*-splicing and alternative polyadenylation events in the parasite transcriptome. This technology also provided high-resolution transcriptomic data identifying 1,825 long non-coding RNAs (lncRNAs), only a small fraction of which were previously annotated. A significant number of these lncRNAs are regulated in a stage-specific manner, highlighting the complex post- transcriptional landscape of *Leishmania*. Together, these results improved our understanding of the complexity of *Leishmania* transcriptome during its development, emphasizing the central role of SIDER2 retroposons and their protein partners in regulating transcript abundance depending on the parasite stage, and provide new insights into the transcriptomic dynamics of this parasite.

Leishmania est un pathogène important pour la santé humaine avec plus de 350 millions de personnes à risque dans le monde. Leishmania présente des caractéristiques uniques en termes de régulation génique constituant ainsi un excellent modèle pour l’étude des mécanismes de régulation génique. Chez Leishmania ainsi que les autres Trypanosomatidae, il n’y a pas de controle au niveau de l’initiation de la transcriptin et la regulation se fait pas presque exclusivement au niveau post-transcriptionnel. Les éléments régulateurs en cis situés dans les régions 3' non-traduites (3'UTRs) des ARN messagers chez Leishmania (ARNms) sont essentiels pour la régulation de la stabilité ou la traduction des transcrits. Malgré les efforts considérables déployés pour l’identification de ces éléments régulateurs, uniquement quelques centaines ont été caractérisées chez les eucaryotes. Nous avons identifiés une nouvelle classe de rétroéléments agissant en cis, appelés SIDERs (Short Interspersed DEgenerate Retroposons) qui sont largement distribués dans le génome du parasite (>2000 copies de SIDER1 et SIDER2), situés pour la plupart dans la région 3ʹUTR. Les transcrits contenant SIDER2 le région 3ʹUTR sont dégradés par un mécanisme indépendant de la déadénylation initié par un clivage endonucléolytique au sein de la séquence signature II (SII) qui est conservée parmi SIDER2. Mon travail a consisté à déterminer les séquences nécessaires pour le clivage endonucléolytique et à identifier les trans-régulateurs jouant un rôle dans la dégradation des ARNm dépendante de SIDER2. Nous avons adopté une approche de purification d'affinité d'ARN étiquetés MS2 permettant de capturer les facteurs trans-régulateurs. Parmi ces éléments liant spécifiquement SIDER2, la Pumilio protéine PUF6 est responsable de la dégradation du transcrit rapporteur possédant la séquence SIDER2 en 3ʹUTR. De plus, l’inactivation du gène PUF6 se manifeste par une augmentation de stabilité des transcrits, suggérant un rôle de PUF6 dans la dégradation des ARNm médiée par SIDER2. Des études de mutations au sein de la séquence conservée, signature II, responsable de la régulation de la dégradation, ont permis de souligner l’importance de sites de clivages putatifs, précédemment identifiés au niveau de SIDER2. De plus, deux régions additionnelles proches de l’extrémité terminale de la séquence SIDER2 se sont révélées de jouer aussi un rôle au niveau de la déstabilisation de l’ARNm. Enfin, nous avons investigué le rôle de la traduction au niveau de la dégradation des ARNm médiée par SIDER2 et nous avons montré que la dégradation des transcrits SIDER2 est liée à une traduction active, soulignant ainsi l’importance de la machinerie de la traduction au niveau de la régulation globale des transcrits contenants des éléments SIDER2 dans le 3’UTR.. / Leishmania spp. are important human pathogens which put lives of over 350 million people at risk, worldwide. Apart from being an important human pathogen, Leishmania has unique features in terms of gene regulation, rendering it an excellent model organism to study gene regulation mechanisms. Notably, Leishmania and other trypanosomatids lack control at the level of transcription initiation and therefore most of the regulation of gene expression takes place post-transcriptionally. Cis-acting elements in 3ʹ-untranslated regions (3ʹUTRs) of Leishmania messenger RNAs (mRNAs) are central to the regulation of mRNA decay or translation efficiency. We have identified a novel class of cis-acting retroposons, termed SIDERs (Short Interspersed DEgenerate Retroposons) that are widely distributed in the parasite genome (>2000 copies of SIDER1 and SIDER2), mostly within 3ʹUTRs. Transcripts bearing SIDER2 in their 3ʹUTR are degraded via a deadenylation-independent pathway involving endonucleolytic cleavage within the conserved signature II (SII) sequence of SIDER2 elements. My research project aimed at determining the sequence requirements for endonucleolytic cleavage and identifying the trans-acting factor(s) contributing to SIDER2-mediated mRNA decay. We employed a tethering approach using the MS2 system to capture the trans-acting proteins in vivo. Amongst the proteins specifically tethered to SIDER2, the Pumilio protein PUF6 was shown to downregulate the SIDER2-harboring reporter transcript. Furthermore, inactivation of the PUF6 gene resulted in upregulation and increased transcript stability, indicating that PUF6 contributes to SIDER2-mediated decay. Mutational analysis within the conserved SII region, known to regulate decay, highlighted the importance of the previously mapped putative cleavage sites in mediating degradation of SIDER2-containing transcripts. Furthermore, two additional regions closer to the end of the SIDER2 sequence were found to contribute to mRNA destabilization. Finally, we addressed the requirement of translation for SIDER2 mediated decay and showed that degradation of SIDER2 transcripts is linked to ongoing translation, underscoring significance of the translation apparatus in global regulation of SIDER2-containing transcripts.

Thèse (M.Sc.) -- Université Laval, 1997. / Bibliogr.: f. 76-85. Publ. aussi en version électronique.

Thèse (M.Sc.) -- Université Laval, 1997. / Bibliogr.: f. 75-91. Publié aussi en version électronique.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Plusieurs types de granules ARN sont observables dans toutes les cellules. Certains correspondent à des structures où la régulation post-transcriptionnelle est effectuée; parmi ceux-ci on retrouve les granules de stress (GS) et les "processing bodies" (PB). Les GS sont des structures ribonucléoprotéiques cytoplasmiques formées suite à un stress cellulaire et dans lesquels les ARNm sont remisés pour y être transitoirement réprimés et protégés en attendant de meilleures conditions physiologiques. Les PB sont aussi des granules cytoplasmiques ribonucléoprotéiques formés entre autre des composants de la machinerie de dégradation et de la surveillance de l'ARN. De nombreuses études citent l'apparition des GS suite à l'irradiation aux UV. Cependant, cette observation n'a pas été validée. Nous avons donc cherché à caractériser les granules induits par les UV en suivant le comportement de FMRP, une protéine de liaison à l'ARN présente dans les GS. Dans cette étude, nous avons montré que les UV induisent la formation de granules cytoplasmiques qui n'ont ni la même taille, ni la même cinétique d'apparition et de disparition, ni la même composition des GS. Nous avons aussi noté l'absence des protéines de la petite sous-unité ribosomale normalement présentes dans les GS. Nous avons montré également que les cellules irradiées peuvent reprendre certaines fonctions physiologiques. Nous proposons donc l'hypothèse qu'il existerait une nouvelle classe de granules ARN induits par les UV dans lesquels seront accumulés les ARN potentiellement endommagés, ceci serait un nouveau mécanisme de régulation post-tanscriptionnelle.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2008. / Bibliogr. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2009. / Bibliogr.: f. 123-143. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.