Th.--Méd.--Reims, 1980. N°: 61.

Reproduction de : Thèse doctorat : Pharmacie. Biochimie : Reims : 2006. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. p.154-203.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2000. / Titre de l'écran-titre (visionné le 12 juillet 2005). Bibliogr. Présenté aussi en version papier.

La sécrétion d'insuline stimulée par les incrétines tels le GLP-1 (glucagon-like peptide-1) et le GIP (glucose-dependent insulinotropic polypeptide), a un rôle majeur dans la régulation du métabolisme des glucides, puisque les incrétines sont responsables de 50 à 70 % de la réponse postprandiale de la cellule beta du pancréas endocrine. Les mécanismes impliquant l'activation de l'adénylate cyclase, l'augmentation intracellulaire de l'AMP cyclique (AMPc) et, en conséquence, l'activation de certaines protéines AMPc-dépendantes, sont responsables de l'effet sécrétagogue des incrétines. Cependant, l'effet du GLP-1 sur la sécrétion d'insuline est préservé même en absence de l'activation de ces protéines, ce qui suggère que des mécanismes indépendants de l'AMPc sont également impliqués. Dans la présente étude, nous nous sommes intéressés à élucider ces mécanismes. Nous avons observé que la voie de la kinase AMP-dépendante (AMPK), qui semble avoir un rôle dans la sécrétion d'insuline stimulée par des nutriments, était également modulée par le GLP-1 dans des cellules beta du pancréas. Nous avons ensuite démontré que l'activation de cette voie réduisait l'effet du GLP-1 sur la sécrétion d'insuline. Ainsi, notre étude a permis l'identification d'une nouvelle voie contribuant à l'effet du GLP-1 sur la sécrétion d'insuline.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2004. / Bibliogr. Publié aussi en version électronique.

Thèse (M.Sc.) -- Université Laval, 1997. / Bibliogr.: f. [68]-76. Publié aussi en version électronique.

"Le recrutement des neutrophiles est une étape critique de la réaction inflammatoire. L'AMP cyclique (AMPc) est une molécule reconnue pour ses effets pro-inflammatoires à de très faibles concentrations intracellulaires mais aussi pour ses effets anti-inflammatoires à fortes concentrations intracellulaires, et ce au niveau de plusieurs de types cellulaires. Des résultats obtenus dans notre laboratoire ont montré que les agents qui augmentent la concentration intracellulaire d'AMPc, comme l'histamine et l'adénosine, inhibent la biosynthèse du leucotriène B₄ (LTB₄) chez le neutrophile humain en bloquant la libération de son substrat, l'acide arachidonique. D'autres études en cours montrent que le LTB₄ est essentiel à la migration transendothéliale du neutrophile humain. Nous démontrons dans cette étude in vitro que l'inhibition par l'AMPc de la migration transendothéliale du neutrophile humain est due, du moins en partie, à l'inhibition de la biosynthèse du LTB₄."

L’acrodysostose est une chondrodysplasie associant une petite taille et des anomalies des extrémités et de la face. Les mécanismes moléculaires sous-jacents ont récemment été identifiés, et deux types d’acrodysostose sont individualisés : 1) l’acrodysostose avec résistance hormonale (acroR1a), en lien avec des mutations du gène PRKAR1A, codant pour une sous-unité régulatrice de la PKA et 2) l’acrodysostose « sans » résistance hormonale (acroPDE), en lien avec des mutations du gène PDE4D, codant pour la phosphodiestérase 4D. Dans les deux cas, il existe une altération de la voie de signalisation de l’AMPc entraînant une résistance au PTHrp à l’origine du phénotype osseux des patients, similaire à celui observé dans la PHP 1a due à des mutations inactivatrices du gène GNAS, codant pour la protéine Gsα. Je me suis intéressée dans ce travail aux mécanismes cellulaires à l’origine du phénotype de l’acroPDE et pouvant expliquer ses différences phénotypiques avec l’acroR1a et la PHP1a. Ces trois pathologies offrent un outil précieux pour l’étude de la voie de signalisation des RCPG puisqu’elles sont toutes dues à un défaut génétique altérant cette voie, mais s’exprimant cliniquement de façon différente bien que proche, notamment en ce qui concerne les résistances hormonales autres que celle du PTHrp dans les chondrocytes. Dans la première partie, afin de mettre en évidence une spécificité tissulaire pouvant expliquer les différences d’expression phénotypique de ces mutations, j’ai utilisé deux modèles cellulaires humains, des fibroblastes et la lignée HEK293, et observé les effets de l’inhibition sélective de la PDE4 par du rolipram à différentes étapes de la voie de signalisation, après stimulation par deux agonistes, la PTH et la PGE2. Les résultats indiquent que l’impact du rolipram est d’autant plus important que la stimulation par l’agoniste est faible. La modulation du signal par la PDE4 dépend donc à la fois du type cellulaire et de l’intensité initiale du stimulus par l’agoniste. Dans la seconde partie, pour comparer plus directement l’effet des mutations de ces trois gènes au niveau cellulaire, j’ai réalisé une étude détaillée du phénotype des fibroblastes de témoins et de patients atteints de PHP1a, d’acroR1a et d’acroPDE, à différentes étapes de la voie de signalisation, après stimulation par la PTH et la PGE2, et en présence ou non d’inhibiteur des PDE. Il n’existe pas de différence significative dans l’expression des transcrits ou la traduction des protéines impliquées dans la voie de signalisation dans les différents groupes de fibroblastes. En revanche, l’effet de l’inhibition des PDE4 sur la quantité d’AMPc intracellulaire est plus important dans les fibroblastes mutés PDE4D, allant dans le sens de mutations activatrices. Nous n’avons pas pu mettre en évidence de différence significative dans la phosphorylation de CREB dans ce modèle. Et enfin, dans la 3ème partie, je présente la mise au point d’une technique de BRET permettant l’étude fonctionnelle des différentes mutations de PDE4D connues pour être responsables d’acroPDE. Les résultats sont en faveur d’un caractère activateur des mutations de PDE4D à l’origine d’une dégradation plus rapide d’AMPc aboutissant à une diminution de l’activité PKA. En conclusion, ces résultats concordent à montrer que les mutations de PDE4D sont activatrices, augmentant ainsi la dégradation de l’AMPc ce qui serait à l’origine des résistances hormonales. Ce phénomène est d’autant plus important dans les situations où l’augmentation d’AMPc est modeste, expliquant probablement l’absence de résistance hormonale dans certains tissus. Bien sûr, ces résultats sont à pondérer par le fait qu’il existe de nombreuses autres phosphodiestérases pouvant compenser ces phénomènes, qu’il existe une troisième voie d’utilisation de l’AMPc (Epac), et qu’il faudrait poursuivre les investigations notamment en étudiant les phénomènes de compartimentalisation de la cellule pour élucider ces mécanismes. / No abstract

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2007. / Titre de l'écran-titre (visionné le 5 mai 2008). Bibliogr.

L'adénosine monophosphate cyclique (AMPc) est une molécule très largement conservée dans le monde du vivant. Chez les bactéries, cette molécule signal est impliquée, entre autres, dans l'adaptation aux changements de milieu, au développement de la virulence, à la sporulation et la compétence. Bien qu'il fut démontré dans les années 1970 que cette molécule nécessitait un transporteur afin de traverser la membrane cellulaire, l'identité de celui-ci restait jusqu'à très récemment inconnue. Ce n'est qu'en 2011 que Hantke et ses collègues démontrèrent l'implication de la protéine TolC dans l'export de l'AMPc. Au cours de ma thèse, j'ai démontré le rôle prépondérant du complexe Opp dans l'import d'AMPc chez Escherichia coli. Ce complexe, formé des protéines OppABCD et F, est connu pour transporter des oligopeptides et se trouve dans la membrane interne de nombreuses bactéries. Pour arriver à la conclusion de son implication dans le transport d'AMPc, une banque de mutants a été créée dans une souche ne produisant pas d'AMPc (cyaA-). Afin d'identifier le transporteur responsable de l'import de l'AMPc, différents cribles qui testent la présence de cette molécule dans la cellule, ont ensuite été réalisée sur ces clones. Après analyse des résultats obtenus, l'opéron opp a été pressenti comme étant nécessaire à l'entrée de l'AMPc dans la cellule. Le double mutant cyaA-oppA- a été créé et de nouvelles expériences sont venues confirmer notre hypothèse. La protéine OppA a ensuite était surexprimée et purifiée pour nous permettre de faire des tests biochimiques d'interaction entre AMPc et OppA, basés sur la fluorescence émise par la protéine elle-même ou un homologue de l'AMPc, l'ε-AMPc. Ces expériences nous ont permis de confirmer l'interaction entre la protéine OppA et l'AMPc. Le système Opp est donc le principal importateur d'AMPc chez Escherichia coli, mais il ne semble pas être l'unique transporteur impliqué. Un autre candidat très intéressant est le complexe Dpp, connu pour transporter les dipeptides. En effet, les expériences préliminaires effectuées démontrent une diminution de la concentration intracellulaire d'AMPc dans une cellule cyaA-dppA- comparée à celle observée dans une souche cyaA-. Les travaux réalisés pendant ces trois dernières années permettent de conclure que le complexe Opp est le principal importateur d'AMPc, très probablement secondé par le complexe Dpp. / Cyclic adenosine monophosphate (cAMP) is a signalling molecule conserved in all reigns of life. In bacteria, cAMP plays an important role in processes as diverse as the adaptation to a changing environment, the control of virulence, sporulation and competence. Although it has been proven in the 1970s that this molecule needs an active transporter to traverse the plasma membrane, the first one of these transporters was discovered only a few years ago. In 2011, Hantke et al have shown that the TolC protein is involved in the efflux of cAMP. During my PhD work I have identified the Opp complex as a major player of cAMP import into Escherichia coli. This complex, composed of proteins called OppABCD and F, is known to transport oligopeptides across the inner membrane of numerous bacterial species. To prove the involvement of the Opp complex in cAMP transport, I have used transposon mutagenesis to generate a collection of random mutants in a strain that does not produce cAMP (cyaA-). Different screens were used to detect mutants with impaired transport of extracellular cAMP into the cell. The opp operon emerged as the most promising candidate from this screen. The double mutant cyaA-oppA- was constructed and experiments designed to test the function of OppA confirmed our hypothesis. Subsequently, I overexpressed and purified OppA in order to perform biochemical experiments destined to measure the physical interaction between cAMP and OppA. I show that the Opp system is the major importer of cAMP in Escherichia coli. However, it seems that Opp is not the unique importer of cAMP. The other, very interesting candidate is the complex Dpp, known to transport dipeptides. Preliminary experiments revealed a decreased amount of cAMP in strain cyaA-dppA- compared to strain cyaA-. The experiments carried out during the last three years allow us to conclude that the Opp complex is the major importer of cAMP into E. coli and that the Dpp complex is probably a secondary transporter.